Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

Abstract

שכפול DNA אאוקריוטי הוא תהליך מוסדר מאוד המבטיח כי התוכנית הגנטית של התא משוכפלת כראוי לפני הפרדת הכרומוזומים. מכיוון שפגמים בסינתזת דנ"א עומדים בבסיס סידור מחדש של כרומוזומים, ניטור שכפול הדנ"א הפך לחיוני להבנת הבסיס לחוסר יציבות הגנום. Saccharomyces cerevisiae הוא מודל קלאסי לחקר ויסות מחזור התא, אך עדיין קשה לקבוע פרמטרים מרכזיים של שכפול DNA, כגון חלק התאים בשלב S או משך שלב S. פרוטוקול זה משתמש בפולסים קצרים ולא רעילים של 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), אנלוגי של תימידין, בתאי שמרים מהונדסים מסוג TK-hENT1, ולאחר מכן זיהויו על ידי תגובת קליק כדי לאפשר הדמיה וכימות של שכפול DNA ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה. שיטה זו עשויה לזהות פגמים שהתעלמו מהם בעבר בשלב S ובהתקדמות מחזור התא של מוטנטים של שמרים, ובכך לאפשר אפיון של שחקנים חדשים החיוניים להבטחת יציבות הגנום.

Introduction

יציבות הגנום באמצעות חלוקה מיטוטית מובטחת על ידי העברת קבוצה שלמה ושווה של כרומוזומים לשני אבות התאים המיוצרים. זה מסתמך על השלמה מדויקת של סדרה של אירועים המתרחשים בזמן נתון בכל שלב של מחזור התא. ב- G 1, מקורות השכפול מורשים עם גיוסם של מספר גורמי רישוי, כולל Cdc61. בשלב S, שכפול גנום שלם מתחיל ממקורות שכפול פעילים מרובים ומבוצע על ידי מכונות שכפול המתאספות במוקדים הנראים לעין מיקרוסקופית בשם מפעלי שכפול2. בשלב M, כרומטידים אחיות משוכפלים מחוברים ודו-כיווניים על הציר המיטוטי כדי לאפשר את הפרדתם לקטבים המנוגדים של התא המיטוטי3. הרגולציה, ההשלמה הנכונה ומשך הזמן של כל שלב הם המפתח להבטחת יציבות הגנום. ואכן, יציאה מוקדמת מכל אחד מהשלבים הללו מובילה לחוסר יציבות גנומית. לדוגמה, G 1 קצר יותר המושרה על ידי מחיקה של מעכב CDK שמרים ניצנים Sic1 או על ידי ביטוי יתר של ציקלינים G1 ישנה את שלב Sהבא 4,5,6. כתוצאה מכך, הסרת הרגולציה הזו, הקשורה או לא ללחץ שכפול, גורמת לשברים בכרומוזומים, לסידור מחדש ולהפרדה שגויה 4,5,6. לכן, ניטור משך שלב S, ובאופן רחב יותר, משך השלבים האחרים של מחזור התא עשוי להיות חיוני כדי לזהות את הפגמים המתרחשים במוטציות שונות ובתנאי עקה שונים.

שיטה מסורתית למדידת משך הפאזה של מחזור התא כוללת ציטומטריה פשוטה של זרימת תוכן DNA (איור 1A) ומסתמכת על אלגוריתם מתאים (זמין ברוב תוכנות הציטומטריה) המשמש להפרדת האוכלוסייה לשברי פאזה G1, S ו- G2 + M מהפסגות 1C ו- 2C. לאחר מכן השברים מוכפלים בזמן הכפלת האוכלוסייה7. עם זאת, שיטה זו נותנת רק ערכים משוערים, דורשת התפלגות גודל תא הומוגנית בתוך שבר נתון, ואינה ישימה לתרביות מסונכרנות. כדי לחקור את משך שלב ה-S בתאי יונקים, פותחו מספר אנלוגים של תימידין ונעשה בהם שימוש נרחב, כולל EdU. ספיגתם מהמדיום החוץ-תאי והזרחון על ידי תימידין קינאז (להלן TK) הופכים אותם לזמינים עבור פולימראזות DNA כדי לשלב אותם באתרים של סינתזת DNA (שכפול, רקומבינציה, תיקון). כדי לעקוף את היעדר הגן TK בתאי Saccharomyces cerevisiae, הונדסו זני שמרים כדי לאפשר ביטוי יציב ומכונן של נגיף ההרפס סימפלקס TK8 וטרנספורטר נוקלאוזיד שיווי משקל אנושי (hENT1)9. לאחר ששולב בדנ"א, EdU מזוהה באמצעות תגובת קליק סלקטיבית, אשר מצמידה כימית את מואטיות האלקין שלו לפלואורוכרומים10 שעברו שינוי אזיד.

מאמר זה מספק שני פרוטוקולים מקיפים ממוטבים לתיוג פולסים של תאים מהונדסים אסינכרוניים וסינכרוניים מסוג TK-hENT1 עם EdU על מנת להמחיש ולמדוד במדויק את משך ודינמיקת שכפול הדנ"א, כמו גם את משך השלבים האחרים של מחזור התא, עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S . cerevisiae תרבית תאים

הערה: זני השמרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1

הערה: ניתן לנטר את משך שלב ה-S בדרכים שונות. בהתאם לשאלה שיש להתייחס אליה, ניתן לגדל את התאים באופן אסינכרוני או סינכרוני לאחר מעצר G1 .

  1. מתאי S. cerevisiae הגדלים באופן אסינכרוני
    הערה: שיטה זו מאפשרת לקבוע את אחוז התאים בשלב S באוכלוסיית תאים הגדלה באופן אסינכרוני. על ידי קביעת זמן ההכפלה, ניתן לבצע אקסטרפולציה של משך שלב S (והשלבים האחרים).
    1. חיסון תאי S. cerevisiae ב-10 מ"ל של מדיום סינתטי שלם (SC) בריכוז תאים נמוך (5 × 104 תאים /מ"ל) לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב-130 סל"ד.
      הערה: הריכוז נמדד באמצעות מונה תאים. כדי לחשב ביעילות את זמני ההכפלה, מומלץ לחסן את התרבית מתרבית לילה שעדיין נמצאת בשלב האקספוננציאלי (כלומר, באופן אידיאלי מתחת ל-2 × 107 תאים למ"ל). גידול תאים בתווך עשיר (YPD) אינו מומלץ, מכיוון שזיהוי EdU אינו יעיל.
    2. למחרת, דללו את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC טרי בריכוז הסופי של 5 × 105 תאים /מ"ל.
    3. תרבית את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד עם רעידות אופקיות ב-120 סל"ד.
    4. מדוד את ריכוז התא כל שעה עד שהוא מגיע 1 × 107 תאים / מ"ל.
      הערה: שלב זה מאפשר לבצע ייצוג גרפי של ריכוז התא לאורך זמן. הנוסחה המשמשת לחישוב זמני ההכפלה מוסברת במקרא של טבלה 2.
    5. המשך במקביל לשלב 2 לתיוג EdU כאשר ריכוז התאים הוא בערך 2 × 10 6-5 × 106 תאים למ "ל.
  2. מתאי S. cerevisiae מסונכרנים G1
    הערה: שיטה זו מאפשרת לקבוע מתי שלב S מתחיל ומסתיים באמצעות ציטומטריה של זרימה ו/או ניתוחי מיקרוסקופיה.
    1. חיסון תאי S. cerevisiae ב-10 מ"ל של SC בינוני בריכוז תאים נמוך (5 × 104 תאים /מ"ל) לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב-130 סל"ד.
      הערה: ראה את ההערות לאחר שלב 1.1.1.
    2. למחרת, יש לדלל את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC טרי בריכוז סופי של 2 × 106-3 × 106 תאים/מ"ל.
    3. יש להוסיף 40 μL של 1 מ"ג/מ"ל α-פקטור מדולל במים.
    4. תרבית את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב 130 סל"ד במשך שעה אחת.
    5. יש להוסיף שוב 40 μL של 1 מ"ג/מ"ל α-פקטור מדולל במים.
    6. תרבית את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב 130 סל"ד במשך שעה אחת.
    7. דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לעקוב אחר מעצר G1 . המשך אם יותר מ-90% מהתאים מציגים shmoo והאחרים הם תאים מעוגלים ולא מעוגלים.
      הערה: בהתאם לרקע שבו נעשה שימוש, מומלץ לנתק את התאים לפני ההדמיה של shmoo. עבור רקע W303, ניתן לנתק 2x, במשך 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
    8. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 1,500 × גרם. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. יש לתלות את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC.
    10. חזור על שלבים 1.2.8-1.2.9 פעם אחת.
      הערה: גורם α נשטף עם שלבים אלה, והתאים משתחררים במחזור התאים. לחלופין, ניתן לשטוף את גורם α על ידי סינון תאי השמרים באמצעות מסנן ניטרוצלולוז בגודל 1.2 מיקרומטר באמצעות משפך המוצב על בקבוקון צדדי המחובר למשאבת ואקום.
    11. אסוף 1 מ"ל של תאים 2x כל 5 דקות והמשך לשלב 2 לתיוג EdU.
      הערה: תייג את התאים רק מאחד משני הצינורות עם EdU. התאים שאינם מסומנים בפולסים משמשים להבחנה בין תאים חיוביים ל-EdU לבין תאים שליליים ל-EdU בגרף דו-כיווני פרופידיום יודיד (PI)-EdU.
    12. יש להוסיף 400 μL של 1 מ"ג/מ"ל גורם α מדולל במים 30 דקות לאחר השחרור.
      הערה: מינון גבוה זה של גורם α נדרש כדי לעצור את התאים בשלב G1 של מחזור התאים הבא וכדי למנוע מהתאים להיכנס מחדש לשלב S הבא.

2. תיוג EdU

  1. העבר 1 מ"ל של תרבית תאים לצינור מיקרופוגה של 2.0 מ"ל המכיל 1 μL של 10 mM EdU. מערבבים היטב על ידי היפוך.
    הערה: כדי להפלות את התאים החיוביים ל-EdU מהתאים השליליים ל-EdU ב-FACS דו-כיווני PI-EdU, העבירו עוד 1 מ"ל של תרבית תאים לצינור מיקרופוגה של 2.0 מ"ל המכיל 1 μL של DMSO.
  2. דגירה במשך 3-5 דקות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה באמבט מים רועדים.
    הערה: שלוש דקות מספיקות לזיהוי EdU באמצעות מיקרוסקופ; נדרשות 5 דקות לזיהוי EdU אופטימלי על ציטומטר זרימה.
  3. עצור את התגובה עם תוספת של 100 μL של 100% אתנול.
    1. עצור את התגובה עם תוספת של 100 μL של 20% paraformaldehyde אם מדידת גודל התא נדרש.
      הערה: אם יש לשמור על הארכיטקטורה הגרעינית של התאים המיטוטיים ללא פגע לצורך ניתוחים נוספים בעקבות תגובת הקליק, אנו ממליצים לתקן תאים עם 2% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) במקום לשים את התאים על קרח, מכיוון שהאחרון גורם לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים.
    2. השאירו את התאים למשך 20 דקות ב-RT תחת תסיסה קלה על נדנדה במהירות משתנה של 20 הטיות לדקה כדי לתקן את התאים לפני תוספת של 100 μL של 100% אתנול.

3. קיבוע תאים וחדירה

  1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה ואקום.
  2. יש להשעות את כדור התא ב-500 μL של 70% אתנול. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
  3. השאירו למשך ≥1 שעות ב-RT ב-20 הטיות לדקה על נדנדה במהירות משתנה כדי לחדור לתאים.
    הערה: תאים הגדלים במדיום SC אינם פולטים היטב מכיוון שהם נוטים להידבק לדפנות המיקרופוגה. תוספת של אתנול משפרת את הכדורים ומפחיתה את אובדן התאים. ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה או לתקופות ארוכות יותר בטמפרטורה של 20°C-.
  4. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
  5. לשטוף את התאים 2x עם 500 μL של 10% אתנול PBS.
    הערה: השטיפות חיוניות להסרת EdU לא מקורב מהתאים.

4. תגובת קליק-איט

  1. לניתוח ציטומטריה
    1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    2. יש להשהות את הכדור ב-200 מיקרו-ליטר של PBS המכיל 0.1 מ"ג/מ"ל RNase A ו-0.2 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K.
    3. דגירה במשך 1-2 שעות ב 50 °C עם רעידות מדי פעם (או לילה ב 37 °C).
    4. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    5. לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS.
    6. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    7. יש להשעות את גלולת התא ב-200 μL של PBS + 1% אלבומין בסרום בקר (BSA). דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
      הערה: אין צורך בזמנים ארוכים יותר והם אפילו מזיקים ליעילות של תגובות קליק.
    8. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. השהה את הכדור ב 300 μL של PBS + 1% BSA.
    10. פזרו את התאים בין שני צינורות: 200 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל עבור תגובת קליק ו-100 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף של 1.5 מ"ל עבור צביעה ירוקה של Sytox.
    11. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    12. לצביעת כתמים ירוקים של סיסטוקס
      הערה: אנו ממליצים בחום לקחת אליקוט לצביעת Sytox Green (ללא קליק) על מנת לקבל פרופילי התייחסות לתוכן DNA באיכות גבוהה. ואכן, תגובת הקליק מרווה מאוד פלואורסצנציה אינטרקלנטית, כולל הפלואורסצנציה של Sytox Green ו-PI. כתוצאה מכך, תגובת הקליק עלולה לעוות את הקריאה של תוכן הדנ"א.
      1. יש להשעות את כדור התא ב-100 μL של PBS.
      2. העבר 10-30 μL (בהתאם לריכוז התא) לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 μL של 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ו- 0.5 μM Sytox Green.
      3. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      4. השאירו בחושך עד לעיבוד הדגימות על ציטומטר זרימה.
        הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    13. עבור תגובת הלחיצה
      1. הכינו חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הבא (כמות לצינור אחד): 36 μL של PBS, 2 μL של 0.2 M CuSO4, 0.2 μL של 2 mM Cy5 Azide, ו 2 μL של 1 M חומצה אסקורבית.
        הערה: ניתן להכין תערובת מאסטר של חיץ צבע אזיד. יש לערבב את הריאגנטים באותו סדר כמו זה שהוזכר לעיל.
      2. השהה את גלולת התא עם 40 μL של תערובת צבע אזיד טרייה. דגירה ב-RT בחושך למשך 60 דקות.
      3. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
      4. לשטוף את התאים 3x עם 300 μL של 10% אתנול PBS.
        הערה: השטיפות חיוניות לסילוק כל אזיד EdU-Cy5 המסיס.
      5. יש לתלות את התאים ב-100 μL של 50 מיקרוגרם/מ"ל PI ב-PBS. השאירו למשך 10 דקות בחושך.
      6. העבר 10-30 μL של תרחיף התא (בהתאם לריכוז התא) לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 μL של 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
      7. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      8. השאירו בחושך עד לעיבוד הדגימות על ציטומטר.
        הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    14. קרא את הדוגמאות הירוקות של Sytox באמצעות לייזר כחול עירור בגודל 488 ננומטר ומסנן 530/30 BP. ראה איור 1A לקבלת תוצאות אופייניות. קרא את דגימות PI-EdU הדו-ערכיות על מתווה נקודה באמצעות לייזר כחול עירור ב-488 ננומטר ומסנן 615/20 BP עבור ה-PI (ציר x) ולייזר אדום עירור ב-640 ננומטר ומסנן 660/20 BP (ציר y). ראו איור 1B לקבלת תוצאות אופייניות.
      הערה: איור 1C מייצג את תוצאת ה-FACS הדו-כיוונית האופיינית ל-PI-EdU עבור תאים שליליים ל-EdU. זה מאפשר אפליה של תאים שליליים EdU מן התאים חיוביים EdU.
  2. לניתוח מיקרוסקופיה
    1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    2. להשעות את הכדור ב 200 μL של PBS + 1% BSA. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
    3. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    4. הכינו חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הבא (כמות לצינור אחד): 36 μL של PBS, 2 μL של 0.2 M CuSO4, 0.2 μL של 2 mM Dy-530 אזיד, 2 μL של 1 M חומצה אסקורבית.
      הערה: ניתן להכין תערובת ראשית של חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הנ"ל.
    5. השהה את הכדור עם 40 μL של חיץ צבע אזיד טרי. דגירה ב-RT בחושך למשך 60 דקות.
    6. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    7. לשטוף את התאים 2x עם 300 μL של 10% אתנול PBS.
      הערה: השטיפות חיוניות לסילוק כל אזיד Dy-530 מסיס.
    8. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. יש להשעות את התאים ב-100 μL של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ב-PBS. משאירים למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    10. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    11. יש לשטוף עם 300 μL של PBS כדי להסיר עודפי DAPI.
    12. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    13. השהה את הכדור עם 10-50 μL של PBS בהתאם לריכוז התא.
    14. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    15. פיפטה 1.7 μL של התאים על מיקרוסקופ זכוכית להחליק ולכסות עם כיסוי נקי.
    16. התבונן מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני DAPI ו- TexasRed או Cy3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע את משך שלב S, ובאופן רחב יותר, את משך הזמן של G 1 ו- G2 + M (שלב פרוטוקול 1.1), S. cerevisiae W303 תאים מסוג בר (WT, טבלה 1) גודלו באופן אסינכרוני במדיום SC במשך 7 שעות. בכל שעה, ריכוז התאים היה במעקב כדי לקבוע את זמן ההכפלה (איור 2B). בתנאי גידול אלה, זמן ההכפלה המחושב היה 120 דקות ± 13 דקות ב-25 מעלות צלזיוס (טבלה 2). כאשר התאים היו בפאזה המעריכית (2 × 10 6-5 × 106 תאים למ"ל), אליקוטשל תאים היה מסומן בפולס עם EdU (10 μM) במשך 5 דקות כדי לבודד את התאים בשלב S ולקבוע את אחוז התאים שהיו בפאזה G1, S ו- G2 + M. שלוש אוכלוסיות של תאים נצפו בניתוח ציטומטר EdU-PI דו-ערכי (איור 1B). ההבחנה בין אוכלוסיות ה-EdU-negative וה-EdU-positive נעשתה באמצעות ניסוי בקרה שבו התאים לא היו מסומנים בפולסים עם EdU, אך תגובת הקליק בוצעה (איור 1C). שתי האוכלוסיות השליליות ל-EdU באזור התחתון-שמאלי ובאזור הימני התחתון שנבדלו בעוצמת ה-PI פי שניים התאימו ל-G1 ול-G2+M, בהתאמה (איור 1B,C). לכן, האוכלוסייה העליונה (עם עוצמה >1× 10 4-2 × 104) התאימה לתאים חיוביים ל-EdU שהיו בשלב S בזמן הדופק (איור 1B). לפיכך, 27% ± 5% מאוכלוסיית התאים היו בשלב G1, 29% ± 3% היו בשלב S, ו-44% ± 2% היו ב-G2 + M. מכיוון שזמן ההכפלה היה 120 דקות ± 13 דקות בתנאים אלה, הסקנו אקסטרפולציה שהשלבים G1, S ו- G 2 + M נמשכו 32 דקות ± 4 דקות, 35 דקות ± 6 דקות ו-53 דקות ± 7 דקות, בהתאמה, ב-25 מעלות צלזיוס (טבלה 2 וטבלה 3).

לאחר מכן, שמנו לנו למטרה לאמת את השיטה הזו ולהראות שהיא רגישה מספיק כדי לזהות מוטציות עם פגמים בשכפול דנ"א שעד כה התעלמו מהם. סברנו שאללים הניתנים לכוונון של אובדן תפקוד של הגורמים המעורבים בשכפול דנ"א יהיו בקרות אימות אידיאליות. לפיכך, השתמשנו בזן שמרים המכיל מוטציה רגישה לטמפרטורה cdc6-1 (טבלה 1)11. Cdc6 הוא גורם רישוי חיוני המתבטא בסוף M ו-G1 להרכבת קומפלקסים של קדם-שכפול (preRC) באתרי כרומוזומים הקשורים ל-ORC שעשויים לשמש מאוחר יותר כמקורות שכפול. לכן, בטמפרטורה מתירנית, משך פאזה S שלו צריך להיות זהה לזה של WT, בעוד שבטמפרטורה מגבילה, לא צריך להתרחש שכפול DNA מכיוון ששום מקור אינו מורשה12. עם זאת, בטמפרטורה מתירנית למחצה, שבה פחות מקורות מורשים אך יש מספיק כדי להקנות את כדאיות התא (הנתונים שלנו שלא פורסמו; Barba Tena et al., כהכנה), ציפינו משכי זמן שונים לכל שלב. כצפוי, בהתבסס על בדיקות נפילה, תאי cdc6-1 גדלו כמו תאי WT בטמפרטורה מתירנית (כלומר, 25 מעלות צלזיוס, איור 2A), והציגו את אותו זמן הכפלה (איור 2B וטבלה 2), אך היו מתים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס או יותר (איור 2A). מעניין, בטמפרטורה מתירנית למחצה (כלומר, 28 מעלות צלזיוס), cdc6-1 היה בר קיימא (28 מעלות צלזיוס, איור 2A). עם זאת, זמן ההכפלה היה ארוך יותר מאשר עבור WT (איור 2B וטבלה 2), ומשך הזמן של כל שלב היה שונה. ואכן, ב-cdc6-1, G1 היה מעט קצר יותר (12 דקות ± דקה לעומת 16 דקות ±-2 דקות), בעוד ששלב ה-S הוארך מעט (34 דקות ± 4 דקות לעומת 29 דקות ±-5 דקות), ושלב G2 + M היה ארוך משמעותית (77 דקות ± 4 דקות לעומת 45 דקות ± 3 דקות) בהשוואה ל-WT (איור 2C, D וטבלה 3). שלב ה-S הוא, באופן מפתיע, לא הוארך הרבה, אך העוצמה הממוצעת של אות ה-EdU ירדה ב-25% (איור 2C,D), מה שעולה בקנה אחד עם שלב S שהתחיל מפחות מקורות. יתר על כן, בעוד שתאי WT חיוביים ל-EdU חולקו באופן הומוגני בין השלבים המוקדמים (S1) והמאוחרים S (S2) (איור 2C, איור משלים S1A, שלבים מוקדמים [S1] ו-S [S2] מאוחרים מתוחמים באמצעות קו מקווקו אנכי בשער העליון), 65% מתאי ה-cdc6-1 החיוביים ל-EdU הצטברו בשלב S המאוחר (איור 2D, איור משלים S1B). אפילו לא הייתה הבחנה ברורה בין אוכלוסיות S ו-G 2 + M (איור 2D), מה שמרמז על כך שהתאים התקשו להשלים את שלב ה-S לפני שנכנסו לשלב G2. לכן, שיטה זו מתאימה ורגישה לזיהוי מוטציות עם פגמים בשלב S (משך ו/או התפלגות) ובמשך שלב מחזור התא.

שיטה משלימה פותחה כדי לקבוע מתי תאים מתחילים ומסיימים את שכפול הדנ"א שלהם ולהעריך את משך שלב ה-S באמצעות תאים מסונכרנים (שלב פרוטוקול 1.2). לשם כך, באמצעות גורם α עם תאים מסונכרנים ב- G1, תאים שוחררו במדיום SC ונאספו כל 5 דקות. משך שלב ה-S עשוי להיות כ-25 דקות, בהתבסס על הזמן שבו תוכן הדנ"א השתנה מ-1C ל-2C בפרופיל ציטומטר הזרימה של Sytox Green (איור 3A). עם זאת, הערכה זו תלויה בשאלה מתי חלק משמעותי מהאוכלוסייה שילב מספיק Sytox Green כדי שניתן יהיה לראותו בפרופיל FACS. לא ניתן לזהות את אירועי השכפול המוקדמים והמאוחרים בשיטה זו. כדי להגדיר במדויק מתי שלב S מתחיל ומסתיים וכמה זמן הוא נמשך, תאי פאזת S בודדו מתוך אליקוט של תאים לאחר תיוג פולסים עם EdU (10 μM) למשך 5 דקות כל 5 דקות לאחר שחרור G1. כצפוי, בתוך 10 הדקות הראשונות לאחר השחרור, כל התאים היו באזור השמאלי התחתון (כלומר, ב-G1, איור 3B, איור משלים S2). רבע שעה לאחר השחרור, כבר זוהה שבריר של תאים חיוביים ל-EdU (השוו את שתי השורות הראשונות באיור S2 משלים ובאיור משלים S3, תאים שטופלו ב-EdU ותאים נטולי EdU, בהתאמה), מה שמצביע על כך ששלב ה-S התחיל (איור 3C). את ההתקדמות בשלב S ראה ענן התא שנע תחילה כלפי מעלה ולאחר מכן ימינה בגרף PI-EdU הדו-כיווני (איור 3D-F). לבסוף, 35 דקות לאחר השחרור, חלק קטן מהתאים היה שלילי ל-EdU, אך עם כמות כפולה של דנ"א, מה שמצביע על כך שהתאים האלה השלימו את שלב ה-S והיו בפאזה G2 + M (איור 3G). לפיכך, שלב S נמשך 20 דקות בתנאים אלה. יש לציין כי למרות הסנכרון הגבוה שנצפה עם שכבת העל של תוכן הדנ"א שזוהתה עם Sytox Green, מה שמרמז על כך ששלב ה-S הסתיים בכל האוכלוסייה 40 דקות לאחר השחרור, הניתוחים הדו-ערכיים הראו כי חלק מהתאים סיימו את שלב S 60 דקות לאחר השחרור וכי שלב ה-S הושלם עבור כל האוכלוסייה 65 דקות לאחר השחרור (איור 3H, I ותוספת איור S2).

בנוסף, ניתן לנטר את שלב S ואת סינתזת הדנ"א באמצעות מיקרוסקופיה. מכל מקור שכפול מופעל, סינתזת הדנ"א מתבצעת על ידי שני רפליזומים קשורים, היוצרים מוקד שכפול גרעיני שעשוי להיות מלווה במיקרוסקופיה על ידי הדמיה של גרסה מתויגת של גורם שכפול ו/או מערך אופרטורים והמדכא המתאים שלהם המתמזג לחלבון פלואורסצנטי 2,13. לחלופין, ניתן לזהות סינתזת DNA על ידי מיקרוסקופיה באמצעות אנלוגים של תימידין14,15. השתמשנו ב-EdU כדי לנטר את אזורי הדנ"א התת-גרעיניים שעוברים סינתזת דנ"א. לשם כך, סימנו בפולסים תאי WT ו-cdc6-1 אסינכרוניים עם EdU (10 μM) למשך 3 דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ודימאנו אותם לאחר תגובת ה-Click. ציפינו לזהות שינויים בעוצמות האות של EdU בהתאם לקצב הסינתזה של הדנ"א ולהתקדמות התא במחזור התא במהלך פולס ה-EdU של 3 דקות (כלומר, תאים שמבלים את כל 3 הדקות בשלב ה-S יציגו אות חזק יותר מאלה שנכנסים או יוצאים משלב S במהלך הפולס). בהתאם לכך, תאי פאזת WT S הציגו בגרעין שלהם אות EdU שהיה בעל עוצמה משתנה (איור 4A). ניתן להסיק בקלות את משך שלב ה-S מניתוח זה. ואכן, נקבע משני שכפולים ביולוגיים (לפחות 150 תאים נספרו), כי 34% ± 3% ו -38% ± 3% מתאי WT ו- cdc6-1 היו חיוביים ל- EdU, בהתאמה. כמו בתנאי גדילה אלה, זמן ההכפלה היה 90 דקות ו-123 דקות עבור תאי WT ו-cdc6-1, בהתאמה (טבלה 2), ועשינו אקסטרפולציה לכך ששלב ה-S נמשך 31 דקות ו-47 דקות, בהתאמה. התוצאה הראשונה עולה בקנה אחד עם זו המתקבלת מניתוחי FACS שלנו (טבלה 3), המצביעה על כך שזיהוי תאים חיוביים ל-EdU על ידי מיקרוסקופיה מאפשר לקבוע את משך שלב ה-S. יש לציין שהאחרון גבוה יותר ממשך שלב ה-S שנלקח מניתוחי ה-FACS שלנו מאחר שלא הייתה הבחנה ברורה בין אוכלוסיות S ו-G2 + M (איור 2D). מוקדי ה-EdU נצפו בקלות בתאי ה-WT (איור 4B), אך היו מעומעמים יותר ופחות בתאי ה-cdc6-1 (איור 4C). כדי לשלול את האפשרות שהפרש עוצמת האות EdU בין תאי WT ו-cdc6-1 תלוי בשלב של שלב S, העוצמה כומתה מתאים מסונכרנים. כצפוי, עוצמת האות הממוצעת של EdU הייתה נמוכה פי שלושה בתאי cdc6-1 (איור 4D), בהתאם לשכפול הדנ"א שהחל ממקורות שכפול פחותים. אות ה-EdU הוגבל לגרעין, קולוקליזציה עם אות DAPI חזק, ואורגן בתבניות כדוריות, בהתאם לארגון שכפול הדנ"א באזורים גרעיניים או במפעלי שכפול. חשוב לציין ש-EdU זוהה רק בתאים לא ניצנים או בעלי ניצנים קטנים ומעולם לא היה נוכח בתאים עם ניצנים גדולים, מה שמעיד על כך שתאי השמרים של WT סיימו את השכפול עד שהם נכנסו למיטוזה. שיטה זו היא, אם כן, רגישה להדמיה של שכפול DNA ברזולוציה מרחבית גבוהה, כמו גם לאיתור וכימות פגמים קלים בשכפול DNA.

Figure 1
איור 1: ניתוחי FACS מייצגים. (A) ניתוחי FACS ירוקים מייצגים של Sytox עבור תאי WT הגדלים בטמפרטורה של 25 °C. (B,C) ניתוחי FACS דו-כיווניים מייצגים של EdU-PI עבור תאי WT הגדלים ב-25 °C ומסומנים בפולסים למשך 5 דקות עם EdU (10 μM) או 1 μL של DMSO. המצולעים היו זהים בשני הניתוחים. C שימש לתיחום ה-EdU-negative מהתאים החיוביים ל-EdU (בדרך כלל, הגבול נקבע בעוצמה >1× 10 4-2 × 104). שער המצולע העליון הגדיר את התאים החיוביים ל-EdU (שבר פאזת S). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שבר התאים בשלבי מחזור התאים G 1, S ו-G2 + M באוכלוסיות תאים אסינכרוניות. (A) זנים WT ו-cdc6-1 זוהו בדילולים סדרתיים של פי חמישה על מדיום עשיר וגדלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 28 מעלות צלזיוס או 34 מעלות צלזיוס. (B) זמן הכפלת האוכלוסייה. תאי WT ו-cdc6-1 אסינכרוניים גודלו ב-25 מעלות צלזיוס או 28 מעלות צלזיוס, וריכוז התאים נמדד מדי שעה במשך 7 שעות. (C,D) ניתוח FACS דו-כיווני של תאי WT ו-cdc6-1 שגודלו ב-28 מעלות צלזיוס ומסומנים בפולסים במשך 5 דקות עם EdU (10 מיקרומטר). הכפלת זמן הכפלת האוכלוסייה בשבר שלב S מספקת את משך הזמן של שלב S. העוצמות הממוצעות של התאים החיוביים EdU וה-EdU-שליליים חושבו כממוצע העוצמה של כל ערך במצולע המתאים. העוצמות הממוצעות של התאים השליליים WT ו-cdc6-1 EdU (5,077 ו-4,454, בהתאמה) נורמלו ל-1. העוצמות הממוצעות של תאים חיוביים ל-WT ו-cdc6-1 EdU (52,604 ו-36,141, בהתאמה) חולקו בגורם הנורמליזציה ששימש לכל זן. הערכים שהתקבלו היו 10.4 ו-8.1, בהתאמה (כלומר, ירידה של 25%, כפי שצוין בטקסט). קיצורים: WT = סוג פראי; EdU = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; PI = פרופידיום יודיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קביעת משך שלב ה-S בתאים מסונכרנים. (A) ניתוח מהלך הזמן של תכולת הדנ"א של תאי WT לאחר שחרור גורם α ב-28 מעלות צלזיוס. הזמן המצוין לוקח בחשבון את משך דופק EdU (5 דקות). (ב-י) ניתוחי FACS דו-כיווניים של EdU-PI עבור תאי WT מסונכרנים המסומנים בדופק למשך 5 דקות עם EdU (10 μM) ונאספים בזמנים המצוינים לאחר השחרור ממעצר G1. קיצורים: WT = סוג פראי; EdU = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; PI = פרופידיום יודיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי וכימות של EdU באמצעות מיקרוסקופיה. זנים אסינכרוניים מסוג WT ו-cdc6-1 גודלו במשך שעתיים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן תויגו בפולסים במשך 3 דקות עם EdU (10 μM) וצולמו על ידי מיקרוסקופיה רחבת שדה באמצעות מסנני עירור/פליטה מתאימים. (A) תמונות מייצגות ממיקרוסקופיית שדה רחב עבור תאים בודדים מסוג WT ו-(B,C) עבור WT ו-cdc6-1 המוצגות באופן חזותי על-ידי DIC ומוכתמות ב-DAPI או ב-EdU, כפי שצוין. פסי קנה המידה ב- (A) ו- (B,C) הם 10 מיקרומטר ו- 2 מיקרומטר, בהתאמה. (D) מדידות עוצמת EdU על תאי WT ו-CDC6-1 סינכרוניים שגודלו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס 30 דקות לאחר השחרור ממעצר G1. הגרף מייצג איגום של שלושה שכפולים ביולוגיים (לפחות 50 תאים נספרו בכל שכפול ביולוגי). ממוצע ± SD מוצגים בגרף. מבחן t דו-זנבי לא מזווג בין תאי WT ו- cdc6-1 מסומן על ידי **** (p < 0.0001). קיצורים: WT = סוג פראי; EdU = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; A.U. = יחידות שרירותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם גנוטיפ איורים וטבלאות
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 איור 1, איור 2A,B,C, איור 3, איור 4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 טבלאות2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 איור 2A,B,D, איור 4 C,D, Supp Fig.1, טבלאות2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) סופה איור 4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 סופה איור 4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 סופה איור 4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 סופה איור 4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 סופה איור 4

טבלה 1: רשימת הזנים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.

WT CDC6-1
25 מעלות צלזיוס 28 מעלות צלזיוס 25 מעלות צלזיוס 28 מעלות צלזיוס
הכפלת זמן (מינימום) 120 90 118 123
SD ± 13 דק' ± 3 דק' ± 10 דקות ± 6 דק'

טבלה 2: זמני הכפלה ממוצעים של זני WT ו-cdc6-1 שגדלו ב-25 °C ו-28 °C. זמני ההכפלה חושבו משלושה שכפולים ביולוגיים (ארבעה שכפולים טכניים לכל שכפול ביולוגי) באמצעות הנוסחה הבאה: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), כאשר Cf ו-Ci מתאימים לריכוזי התאים הסופיים וההתחלתיים, בהתאמה, ו-Δt מתאים להבדל בדקות בין tf ל-ti, כאשר Cf ו-Ci נמדדו, בהתאמה.

WT CDC6-1
25 מעלות צלזיוס 28 מעלות צלזיוס 25 מעלות צלזיוס 28 מעלות צלזיוס
אחוז משך
(מינימום)		 אחוז משך
(מינימום)		 אחוז משך
(מינימום)		 אחוז משך
(מינימום)
ז1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
ז2+מ 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

טבלה 3: שברים ממוצעים של תאים ומשך הזמן של פאזות G 1, S ו- G2 + M בתאי WT ו- cdc6-1 הגדלים ב- 25 °C ו- 28 °C. שברי התאים נקבעו משלושה שכפולים ביולוגיים (שני שכפולים טכניים לכל שכפול ביולוגי). ההבדלים במשך G 1, S ו- G2 + M בין תאי WT ו- cdc6-1 שגדלו ב- 28 °C היו מובהקים סטטיסטית (מבחן t דו-זנבי לא מזווג, p <0.1).

איור משלים S1: חלק מהתאים בשלבי S המוקדמים והמאוחרים בתאי WT ו-cdc6-1 שגודלו ב-28 מעלות צלזיוס. שני מצולעים זהים בשם S1 ו-S2 עבור שלבי ה-S המוקדמים והמאוחרים, בהתאמה, צוירו בחלק של תאים חיוביים ל-EdU כדי לפצל אותו לשני חצאים בניתוחי FACS דו-כיווניים של EdU-PI עבור (A) תאי WT שגדלו ב-28 מעלות צלזיוס ו-(B) תאי cdc6-1 שגודלו ב-28 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: התקדמות מחזור התאים של תאים המסומנים בפולסים של EdU לאחר שחרור ממעצר G1 שהומחשה על-ידי FACS דו-כיווני של EdU-PI. אליקוט של תאים היה מסומן בדופק במשך 5 דקות עם 10 μM EdU כל 5 דקות לאחר שחרור ממעצר גורם α ב 28 מעלות צלזיוס ועד 80 דקות, כפי שצוין. קיצורים: EdU = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; PI = פרופידיום יודיד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: התקדמות מחזור התא של תאים שטופלו ב-DMSO לאחר שחרור ממעצר G1 שהומחשה על-ידי FACS דו-כיווני של EdU-PI. זה זהה לאיור משלים 2, אבל התאים דוגרו במשך 5 דקות עם 1 μL DMSO (דימתיל סולפוקסיד). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תוספת איור S4: רעילות BrdU ו-EdU בתאי שמרים מסוג TK hENT1. תאים של הגנוטיפ המצוין זוהו בדילולים סדרתיים של פי חמישה על לוחות YPD המכילים ריכוזים הולכים וגדלים של BrdU או EdU וגדלו במשך 40 שעות ב -30 מעלות צלזיוס. קיצורים: DMSO = דימתיל סולפוקסיד; BrdU = ברומודאוקסיורידין; Edu = 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין; TK = תימידין קינאז; hENT1 = טרנספורטר נוקלאוזיד שיווי משקל אנושי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שמרים הם אורגניזם מודל ראשוני לחקר מחזור התא, אך האפיון של שלב ה-S שלו נפגע זה מכבר בשל חוסר יכולתו לשלב נוקלאוזידים אקסוגניים, כגון BrdU, המשמשים כעקבות של שכפול DNA. הצטיידות שמרים בביטוי גבוה של הרפס סימפלקס תימידין קינאז (TK) ותוספת של טרנספורטר נוקלאוזיד אנושי (hENT) פתרו במידה רבה את הבעיה הזו15,16. EdU הוא רב-תכליתי יותר מ-BrdU מכיוון שהזיהוי שלו עם אזיד פלואורסצנטי קטן וכימיה של קליק מקובל על תאי שמרים מחלחלים וניתוח FACS, בניגוד לנוגדנים נגד BrdU17. כאן, ביצענו אופטימיזציה של התנאים של תיוג וזיהוי EdU בזן TK-hENT1 זה והראינו שניתן לכמת פגמים בשכפול שלא זוהו בעבר באמצעות פרוטוקול זה על ידי FACS או מיקרוסקופיה.

חקר מנגנון ביולוגי באמצעות כלים שעלולים להפריע לאותו מנגנון הוא נושא נפוץ בביולוגיה. מכיוון של-EdU יש השפעה ציטוטוקסית ידועה, חיפשנו ריכוזי EdU שאינם רעילים בחשיפה כרונית לזן TK-hENT1 המהונדס ומצאנו ש-10 μM הם מינון מתאים. תאי TK-hENT1 אינם מצליחים להתרבות בקצב של 25 μM EdU, בעוד שתאי TK-alone או תאי hENT1 לבדם עומדים בקלות ב-100 μM EdU (איור משלים S4). למרות שתאי שמרים רגישים הרבה יותר ל-EdU מאשר BrdU, מצאנו שההתרבות פחתה רק לאחר מחזור התאים השני לאחר חשיפה ל-EdU, מה שמרמז על כך שיש לשלב אותו בשני הגדילים כדי להשפיע על התפשטות התאים (הנתונים לא מוצגים). כדי להישאר בצד הבטוח, השתמשנו ב-10 μM EdU לאורך כל הפרוטוקול הזה, עם פולסים קצרים בלבד (3 דקות למיקרוסקופיה; 5 דקות ל-FACS), ומצאנו שזה מתאים לזיהוי טוב באמצעות פרוטוקול ממוטב זה.

פגמים עדינים בשכפול הדנ"א עשויים להשפיע רבות על סידור מחדש של כרומוזומים4. לכן, פיתוח טכניקות ופרוטוקולים המסוגלים לזהות פגמים עדינים אלה הוא המפתח לחשיפת האטיולוגיה של סטיות כרומוזומליות. כאן אנו מראים שהפרוטוקול הממוטב הזה של שילוב וזיהוי EdU יכול למדוד הפחתה של עד פי שלושה בעוצמת האות (איור 2 ואיור 4), מה שמצביע על כך שקצב סינתזת הדנ"א מופחת בתאי cdc6-1 רגישים לטמפרטורה שגדלים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, שנכון לעכשיו לא מראים פגמים במבחני הכדאיות של הלוחות (איור 2A ). פרוטוקול זה של שילוב וכימות EdU יכול, לפיכך, לשמש לסינון מוטנטים אחרים שעבורם פגמים בשכפול אינם חשודים בתחילה. בנוסף, זה עשוי להיות שימושי כדי לזהות סינתזת DNA מיטוטית (MiDAS), סינתזת DNA תלוית רקומבינציה מיוטית, או סינתזת DNA ארוכת טווח אחרת.

חסרון אחד הוא שזיהוי EdU יכול להתבצע על תאים קבועים בלבד, מה שמונע אנליזה חיה כמו ב-PCNA-GFP או קריאות פלואורסצנטיות אחרות של שכפול DNA, הסובלות מעצמן מהפוטוטוקסיות הגבוהה של קרני הלייזר המשמשות להדמיה. גידול תאים בתווך סינתטי הוא חיוני לזיהוי מיטבי, שכן נראה כי שרידי YPD מרווה באופן משמעותי את תגובת הקליק. באופן מעניין, הפרדה של תאי פאזת S באמצעות ניתוח FACS דו-כיווני של EdU-PI על אוכלוסיות מסונכרנות מאפשרת להעריך את משך שלב ה-S ל-20 דקות בתאים בודדים (איור 3, איור משלים S2 ואיור משלים S3). עם זאת, אפילו כאשר סינכרון לאחר שחרור גורם α נראה כמעט מושלם כמו בניתוח FACS ירוק קלאסי של Sytox (איור 3A), מתברר מניתוח FACS דו-ערכי של EdU-PI שתאים נכנסים לשלב S באופן אסינכרוני יחסית (איור 3B-I).

במאמר זה נתאר שלוש שיטות לקביעת משך שלב ה-S באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה על תאים סינכרוניים ואסינכרוניים הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה. משכי הזמן הממוצעים של פאזת S שנקבעו בתאי WT אסינכרוניים ברמת האוכלוסייה דומים באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה, ב-29 דקות ו-31 דקות, בהתאמה, בעוד שהגישה המסונכרנת שלנו המבוססת על תאים בודדים מראה שמשך הזמן יכול להיות קצר עד כדי 20 דקות (איור 2, איור 3, איור 4 וטבלה 3 ). הפער בין ערכים אלה מפתיע אך ניתן להסבירו בקלות. ואכן, בגישה מבוססת התאים הבודדים שלנו, משך שלב ה-S נקבע על סמך האירועים המוקדמים ביותר (כלומר, התאים הראשונים שנכנסים ויוצאים משלב S, איור 3C,G), אך אין זה אומר ששלב ה-S נמשך 20 דקות בכל תא באוכלוסייה. נתונים אלה יתמכו ברעיון הבלתי צפוי שיש רמה מסוימת של הטרוגניות במשך שלב S בין תאים.

פרוטוקולים משופרים או טכניקות חדשות יכולים להפיל דוגמות ארוכות שנים או רעיונות חדשניים. יש שלושה שהנתונים האלה מאתגרים. ראשית, הוא האמין כי סינתזת DNA הוא במקביל עם הופעת ניצן ב S. cerevisiae. איור 4A-C מראה כי צביעת EdU היא החזקה ביותר בתאים לא ניצנים ובעלי ניצנים קטנים, למרות הפיגור של 3 דקות בתיוג, מה שמצביע על כך ששלב ה-S מתחיל בבירור לפני הניצנים, כפי שהוצג קודםלכן 16. שנית, מדווח כי לתאי שמרים אין פאזה G2, עם צירים מיטוטיים הנוצרים במקביל לסינתזה של DNA. הפולסים הקצרים מאוד בשילוב עם זיהוי EdU רגיש על-ידי FACS (איור 3, איור משלים S2 ואיור משלים S3) או מיקרוסקופיה (איור 4) מאפשרים לקבוע במדויק מתי שלב ה-S מתחיל ומסתיים בתאים בודדים. על-ידי כך, מצאנו שסינתזת דנ"א בתפזורת מסתיימת 40 דקות לאחר שחרור α גורמים (איור 3, איור משלים S2 ואיור משלים S3), בעוד שצירים מיטוטיים קצרים נוצרים רק 20 דקות מאוחר יותר16 (הנתונים לא מוצגים). אנו מסיקים שלתאי שמרים יש שלב G2. שלישית, לאחרונה הוצע כי עד 30% מתאי השמרים ישלימו את סינתזת הדנ"א באנפאזה-טלופאז18. באמצעות פרוטוקול ממוטב זה, לא זיהינו שילוב של EdU בתאים המציגים ציר אנאפאז/טלופאזה (נתונים שאינם מוצגים), אך איננו יכולים לשלול שהגל השני של סינתזת הדנ"א נמצא מתחת לסף הגילוי המשמש. בהתחשב ביחס האות / רעש החזק, אנו מחשיבים את האפשרות השנייה כבלתי סבירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לסוכנות הלאומית דה לה רשרש (ANR) ולאגודה לסרטן (ARC) על מלגות הדוקטורט ל- J.d.D.B.T. ול- Agence Nationale pour la Recherche (ANR) לתמיכה כספית (מענק ANR-18-CE12-0018-01). ציטומטריה ומיקרוסקופיה בוצעו במתקן ההדמיה BioCampus MRI במונפלייה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 188
קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין <em>בסקרומיצס cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter