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Bioengineering

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.

Abstract

I gate booleani e i circuiti digitali dei geni sintetici hanno una vasta gamma di applicazioni, dalla diagnostica medica alla cura dell'ambiente. La scoperta dei sistemi CRISPR-Cas e dei loro inibitori naturali, le proteine anti-CRISPR (Acrs), fornisce un nuovo strumento per progettare e implementare circuiti digitali genici in vivo . Qui, descriviamo un protocollo che segue l'idea del ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" e fa uso di dCas9 / dCas12a insieme ai loro corrispondenti Acr per stabilire piccole reti trascrizionali, alcune delle quali si comportano come porte booleane, in Saccharomyces cerevisiae. Questi risultati evidenziano le proprietà di dCas9/dCas12a come fattori di trascrizione. In particolare, per ottenere la massima attivazione dell'espressione genica, dSpCas9 deve interagire con un RNA scaffold ingegnerizzato che raccoglie più copie del dominio di attivazione VP64 (AD). Al contrario, dCas12a deve essere fuso, al terminale C, con il forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Inoltre, l'attività di entrambe le proteine Cas non è potenziata aumentando la quantità di sgRNA/crRNA nella cellula. Questo articolo spiega anche come costruire porte booleane basate sull'interazione CRISPR-dCas-Acr. Il dominio di legame ormonale fuso AcrIIA4 del recettore degli estrogeni umani è il nucleo di un gate NOT sensibile al β-estradiolo, mentre gli AcrVA sintetizzati dal promotore inducibile GAL1 consentono di imitare sia le porte SÌ che NOT con galattosio come input. In questi ultimi circuiti, AcrVA5, insieme a dLbCas12a, ha mostrato il miglior comportamento logico.

Introduction

Nel 2011, i ricercatori hanno proposto un metodo computazionale e sviluppato un software corrispondente per la progettazione automatica di circuiti genetici sintetici digitali1. Un utente doveva specificare il numero di ingressi (tre o quattro) e compilare la tabella di verità del circuito; Ciò ha fornito tutte le informazioni necessarie per derivare la struttura del circuito utilizzando tecniche dall'elettronica. La tavola di verità è stata tradotta in due formule booleane tramite il metodo 2 della mappa di Karnaugh. Ogni formula booleana è composta da clausole che descrivono le operazioni logiche (somma o moltiplicazione) tra (parte di) gli ingressi del circuito e le loro negazioni (i letterali). Le clausole, a loro volta, vengono sommate (OR) o moltiplicate (AND) per calcolare l'uscita del circuito. Ogni circuito può essere realizzato secondo una qualsiasi delle sue due formule corrispondenti: una scritta in forma POS (prodotto di somme) e l'altra in rappresentazione SOP (somma di prodotti). Il primo consiste in una moltiplicazione di clausole (cioè porte booleane) che contengono una somma logica dei letterali. Quest'ultimo, al contrario, è una somma di clausole in cui i valori letterali sono moltiplicati.

I circuiti elettrici possono essere realizzati, su una breadboard, collegando fisicamente diversi cancelli insieme. La corrente elettrica consente lo scambio di segnali tra i gate, che porta al calcolo dell'uscita.

In biologia, la situazione è più complessa. Un gate booleano può essere realizzato come unità di trascrizione (TU; cioè la sequenza "promotore-codificante regione-terminatore" all'interno di cellule eucariotiche), dove la trascrizione o la traduzione (o entrambe) sono regolate. Quindi, almeno due tipi di molecole stabiliscono un cablaggio biologico: le proteine del fattore di trascrizione e gli RNA antisenso non codificanti1.

Un circuito digitale genico è organizzato in due o tre strati di porte, vale a dire: 1) lo strato di ingresso, che è costituito da SÌ (buffer) e NON porte e converte le sostanze chimiche in ingresso in molecole di cablaggio; 2) il livello interno, che consiste di tanti TU quante sono le clausole nella corrispondente formula booleana. Se il circuito è progettato secondo la formula SOP, ogni clausola nello strato interno produrrà l'uscita del circuito (ad esempio, fluorescenza) in una cosiddetta architettura di uscita distribuita. Se viene utilizzata la formula del prodotto della somma (POS), è necessario uno strato finale 3), che conterrà un singolo gate moltiplicativo che raccoglie le molecole di cablaggio dallo strato interno.

Nel complesso, in biologia sintetica, molti schemi diversi possono essere progettati per lo stesso circuito. Differiscono nel numero e nel tipo di TU e molecole di cablaggio. Al fine di scegliere la soluzione più semplice da implementare nelle cellule di lievito, ogni progetto di circuito è associato a un punteggio di complessità S, definito come

Equation 1

dove A rappresenta il numero di attivatori, R rappresenta il numero di repressori e A è la quantità di molecole di RNA antisenso. Se gli attivatori o i repressori sono assenti dal circuito, il loro contributo a S è zero. Pertanto, è più difficile realizzare uno schema circuitale in laboratorio (alto S) quando richiede un numero elevato di fattori di trascrizione ortogonali. Ciò significa che nuovi attivatori e repressori devono essere progettati de novo per realizzare il cablaggio completo all'interno dei circuiti digitali. In linea di principio, nuove proteine leganti il DNA possono essere assemblate utilizzando le proteine Zinc Finger3 e gli effettori TAL4 come modelli. Tuttavia, questa opzione appare troppo ardua e richiede tempo; pertanto, si dovrebbe fare affidamento principalmente su piccoli RNA e regolazione della traduzione per finalizzare circuiti genici complessi.

Originariamente, questo metodo è stato sviluppato per fabbricare circuiti digitali nei batteri. Infatti, nelle cellule eucariotiche, invece che di RNA antisenso, è più adatto parlare di microRNA (miRNA) o piccoli RNA interferenti (siRNA)5. Tuttavia, la via dell'RNAi non è presente nel lievito S. cerevisiae. Quindi, si dovrebbe optare per reti completamente trascrizionali. Supponiamo che un circuito abbia bisogno di cinque attivatori e cinque repressori; il suo punteggio di complessità sarebbe S = 32. La complessità del circuito può essere ridotta sostituendo i 10 fattori di trascrizione con un singolo dCas96 (Cas9 carente di nucleasi) fuso in un dominio di attivazione (AD). Come mostrato in7, dCas9-AD funziona come repressore nel lievito quando lega un promotore tra la scatola TATA e il TSS (sito di inizio della trascrizione) e come attivatore quando si lega bene a monte della scatola TATA. Pertanto, è possibile sostituire 10 fattori di trascrizione con una singola proteina di fusione dCas9-AD e 10 sgRNA (RNA guida singola) per un punteggio di complessità totale di S = 11. È facile e veloce sintetizzare dieci sgRNA, mentre, come precedentemente commentato, l'assemblaggio di 10 proteine richiederebbe un lavoro molto più lungo e complicato.

In alternativa, si potrebbero usare due proteine dCas ortogonali (ad esempio, dCas9 e dCas12a): una per fondersi con un AD, e l'altra nuda o in combinazione con un dominio di repressione. Il punteggio di complessità aumenterebbe di una sola unità (S = 12). Quindi, i sistemi CRISPR-dCas sono la chiave per la costruzione di circuiti digitali genici molto complessi in S. cerevisiae.

Questo documento caratterizza profondamente l'efficienza dei repressori e degli attivatori basati su dCas9 e dCas12a nel lievito. I risultati mostrano che non richiedono un'elevata quantità di sgRNA per ottimizzare la loro attività, quindi i plasmidi episomiali sono preferenzialmente evitati. Inoltre, gli attivatori basati su dCas9 sono molto più efficaci quando si utilizza uno scaffold RNA (scRNA) che recluta copie del VP64 AD. Al contrario, dCas12a funziona bene se fuso direttamente al potente VPR AD. Inoltre, un promotore sintetico attivato richiede un numero variabile di siti bersaglio, a seconda della configurazione dell'attivatore (ad esempio, tre quando si utilizza dCas12a-VPR, sei per dCas9-VP64 e solo uno con dCas9 e uno scRNA). Come repressore, dCas12a appare più incisivo quando si lega la regione codificante piuttosto che il promotore.

Come svantaggio, tuttavia, CRISPR-dCas9 / dCas12a non interagiscono direttamente con le sostanze chimiche. Pertanto, potrebbero non essere utili nel livello di input. Per questo motivo, sono stati studiati progetti alternativi di gate booleani contenenti proteine anti-CRISPR (Acrs). Gli Acr agiscono sulle proteine (d)Cas e ne inibiscono il funzionamento8. Quindi, sono un mezzo per modulare l'attività dei sistemi CRISPR-(d)Cas. Questo articolo analizza a fondo le interazioni tra il tipo II Acrs e (d)Cas9, così come il tipo V Acrs e (d)Cas12a in S. cerevisiae. Poiché gli Acr sono molto più piccoli delle proteine Cas, è stato costruito un gate NOT sensibile all'estrogeno β-estradiolo fondendo il dominio legante l'ormone del recettore degli estrogeni umani9-HBD (hER) ad AcrIIA4. Inoltre, sono state realizzate una manciata di porte SÌ e NON che esprimevano costitutivamente dCas12a(-AD) e AcrVA dopo induzione con galattosio. Al momento, queste porte servono solo come prova di concetto. Tuttavia, rappresentano anche il primo passo verso un profondo ripensamento dell'algoritmo per effettuare la progettazione automatica computazionale di circuiti digitali genici sintetici nelle cellule di lievito.

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Protocol

1. Progettazione e costruzione della cassetta di espressione sgRNA/crRNA

NOTA: Esistono due tipi di cassette di espressione sgRNA/crRNA: SNR5210-è composto dal promotore SNR52 RNA polimerasi III-dipendente, dalla sequenza sgRNA/crRNA e dal terminatore SUP4; un altro, abbreviato in RGR11, è costituito dal promotore ADH1 RNA polimerasi II-dipendente, dalla struttura RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) che contiene due ribozimi (un ribozima martello-HH e un ribozima delta virus dell'epatite ribozima-HDV) e la sequenza del sgRNA/crRNA intermedio e il terminatore ADH1. Gli omologhi sgRNA che guidano Cas9 sono costituiti da una sequenza distanziatrice e dalla caratteristica ripetizione diretta12, mentre il crRNA per le proteine Cas12a comprende la ripetizione diretta seguita dalla sequenza spaziatrice13,14 (vedere la Tabella supplementare 1 per tutte le sequenze di DNA utilizzate in questo studio).

  1. Progettare la sequenza distanziatrice per l'attivazione trascrizionale mediata da Cas9/Cas12a.
    1. Sfruttare la sequenza batterica dell'operatore lex (denominata lexOp) come sito bersaglio 15,16 e inserirla nel promotore CYC1 che guida l'espressione della proteina fluorescente verde potenziata dal lievito (yEGFP)17. Quindi, la sequenza di spaziatori è definita e complementare al lexOp inserito.
  2. Controllare l'ortogonalità della sequenza distanziatrice tramite lo strumento CRISPRDIRECT18.
    1. Incollare la sequenza lexOp affiancata dalla sequenza PAM nel campo di testo, definire la sequenza PAM come NRG per dCas9 e TTTV per dCas12a e specificare la specie dall'elenco a discesa come Lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Clicca su Design. Assicurati che non ci sia alcun sito di destinazione corrispondente nella ricerca 20mer + PAM né nella ricerca 12mer + PAM.
  3. Costruire la cassetta di espressione sgRNA/crRNA.
    1. Utilizzare la PCR touchdown per amplificare le sequenze di DNA di parti biologiche standard, come promotori, sequenze di codifica e terminatori.
      1. Preparare una miscela di reazione contenente: 20-40 ng di modello di DNA, 1 μL di primer forward da 10 μM (cioè ot25, costruzione plasmidica di espressione sgRNA/crRNA), 1 μL di primer inverso da 10 μM (cioè ot26, costruzione plasmidica di espressione sgRNA/crRNA), 5 μL di miscela dNTP da 2,5 mM, 0,5 μL di DNA polimerasi, 10 μL di tampone di reazione 5x DNA polimerasi, e acqua bidistillata (ddH2O) fino ad un volume totale di 50 μL.
        NOTA: Fare riferimento alla Tabella supplementare 2 per un elenco dei primer utilizzati in questo studio.
      2. Eseguire il programma PCR touchdown su un termociclatore:
        Fase 1: 98 °C per 30 s.
        Fase 2 con 10 cicli: 98 °C per 10 s, 68 °C per 20 s e 72 °C per 15 s.
        Fase 3 con 25 cicli: 98 °C per 10 s, 59 °C per 20 s e 72 °C per 15 s.
        Tappa 4: 72 °C per 2 min.
        Infine, tenere a 4 °C fino all'inizio degli esperimenti di follow-up.
        NOTA: I 68 °C nella fase 2 e i 59 °C nella fase 3 dipendono dalle temperature di fusione dei primer sia avanti che indietro, che variano da diverse coppie di primer. Il tempo a 72 °C negli stadi 2 e 3 è determinato dalla lunghezza del prodotto PCR e dalla velocità della DNA polimerasi.
    2. Isolare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel (100 V, 30 min). Eluire le sequenze di DNA dal gel di agarosio tramite un kit di estrazione del gel di DNA (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Un gel di agarosio allo 0,8% è richiesto per frammenti più lunghi di 500 nt, un gel di agarosio all'1,5% per frammenti tra 100 nt e 500 nt e un gel di agarosio al 2% per frammenti più corti di 100 nt.
    3. Inserire l'TU che esprime sgRNA/crRNA in un vettore shuttle19 pRSII404/424, che contiene il gene di resistenza all'ampicillina e il gene marcatore auxotrofico selezionabile dal lievito-TRP1.
      1. Digerire il vettore shuttle a 37 °C per 1 ora con i due enzimi di restrizione SacI e Acc65I. Preparare la miscela di reazione aggiungendo 5 μg del vettore shuttle, le quantità raccomandate di enzimi, tampone di digestione (secondo le istruzioni enzimatiche) e ddH2O fino a un volume totale di 30 μL.
      2. Verificare la digestione vettoriale dello shuttle mediante elettroforesi su gel (vedere il sottopassaggio 1.3.2). Quindi, inattivare i due enzimi a 65 °C per 20 minuti.
      3. Utilizzare il metodo di assemblaggio Gibson 20 per inserire i prodotti PCR purificati nel vettore shuttle cut-open lasciando entrare la miscela di DNA equimolare a50 °C per 1 ora.
      4. Trasformare le cellule competenti di Escherichia coli DH5α con la miscela di reazione di Gibson sopra riportata tramite il metodo di trasformazione da shock termico21. Trasferire le cellule trasformate di E. coli su piastre di agar Luria-Bertani (LB) contenenti ampicillina (0,1 g/L). Mettere le piastre nell'incubatore a 37 °C e lasciare crescere le cellule durante la notte.
      5. Prelevare quattro colonie dalla piastra di agar LB e coltivarle separatamente per una notte a 37 °C in soluzione di ampicillina contenente ampicillina (0,1 g/L). Quindi, utilizzare la procedura di mini-preparazione per estrarre i plasmidi dalle cellule di E. coli 22.
      6. Utilizzare i primer ot18 e ot19 (vedere la Tabella supplementare 2 per le sequenze oligo) per sequenziare e confermare l'unità di trascrizione inserita tramite il metodo Sanger23.
        NOTA: In esperimenti successivi, i plasmidi costruiti e confermati saranno inseriti nel genoma del lievito tramite il protocollo PEG / LiAc24.

2. Progettazione e costruzione della cassetta di espressione dell'RNA dello scaffold

NOTA: L'RNA guida dello scaffold (scRNA) è composto dalla sequenza di sgRNA e dalle strutture a forcina MS225. In questo lavoro vengono utilizzati due tipi di strutture a forcina MS2: hairpin-wt MS2 wild-type e aptamer-f6 MS2 coat protein (MCP).

  1. Sintetizzare un modello di scRNA che è in grado di ospitare diverse sequenze di spaziatori (ad esempio, pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    NOTA: In questo studio, il modello di scRNA è stato sintetizzato da una società di sintesi genica (vedi Tabella dei materiali).
  2. Progettare primer appropriati (vedere Tabella supplementare 2) per eseguire la PCR sulle sequenze di distanziatori necessarie.
  3. Seguire le procedure descritte al punto 1.3 per costruire una cassetta di espressione scRNA.

3. Ingegneria dSpCas9 e costruzione di plasmidi di espressione

  1. Ottenere il pTPGI_dSpCas9_VP64 plasmidico (vedere Tabella dei materiali).
  2. Costruire il vettore accettore pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basato sul vettore shuttle pRSII406, tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passo 1.3). Il plasmide fornisce un forte promotore costitutivo-pGPD e un terminatore-CYC1t.
  3. Digerire il plasmide pTPGI_dCas9_VP64 e il vettore accettore di nuova costruzione (5 μg per 1 ora o 10 μg per la notte; vedere il punto 1.3.3.1 come riferimento) con XbaI e XhoI a 37 °C. Separare e purificare il frammento di inserto e il vettore accettore come al punto 1.3.2.
  4. Argare il frammento di inserto purificato e il vettore accettore con T4 DNA ligasi a 16 °C per 8 ore. Preparare la soluzione di legatura aggiungendo 50-100 ng del vettore accettore purificato, frammenti bersaglio purificati in quantità equimolare con il vettore accettore, 1,5 μL di tampone T4, 0,5 μL di T4 ligasi e ddH2O fino ad un volume totale di 15 μL.
  5. Seguire i passaggi 1.3.3.3 e 1.3.3.4. Quindi, confermare che il plasmide di nuova costruzione sia corretto mediante digestione con XbaI e Xhol (37 °C, 1 ora) ed elettroforesi su gel (vedere punto 1.3.2).

4. Ingegneria dCas12a e costruzione di plasmidi

  1. Costruire i plasmidi che esprimono dCas12a-AD.
    1. Sintetizzare due proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito (denAsCas12a e dLbCas12a) affiancate da siti enzimatici di restrizione BamHI e Xhol.
      NOTA: In questo studio, le due proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito sono state sintetizzate da una società di sintesi genica (vedi Tabella dei materiali).
    2. Costruire il vettore accettore pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson (vedere passo 1.3), dove il "promotore" è pGPD o pGAL1, "sp" rappresenta una breve sequenza casuale e "AD" è VPR o VP64.
    3. Inserire ciascuna proteina dCas12a nei due vettori accettori di nuova costruzione tramite digestione con BamHI e XhoI e legatura con T4 DNA ligasi (fare riferimento ai punti 3.3 e 3.4).
  2. Costruire i plasmidi che esprimono un dCas12a nudo.
    1. Costruire un vettore accettore per le cassette di espressione inducibili dal galattosio di dCas12a come pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t usando la PCR touchdown e il metodo di assemblaggio Gibson (vedere il passo 1.3).
    2. Digerire i plasmidi contenenti le proteine dCas12a e il vettore accettore sopra riportato con BamHI e Xhol, quindi ligarli con T4 DNA ligasi per ottenere il plasmide pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (fare riferimento ai passaggi 3.3 e 3.4).
    3. Digerire il plasmide ottenuto al punto 4.2.2 con Acc65I e BamHI, quindi sostituire pGAL1 con pGPD tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson per costruire pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Ingegneria proteica anti-CRISPR e costruzione di plasmidi

NOTA: Tre tipi di promotori sono stati impiegati per guidare l'espressione di Acrs: un promotore inducibile-pGAL1, quattro promotori costitutivi del lievito-pGPD, pACT1, pTEF1 e pTEF2 e un promotore costitutivo sintetico-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. Ottenere i plasmidi contenenti le sequenze di Acr di tipo II (AcrIIA2, AcrIIA427 e AcrIIA528) e di tipo V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 e AcrVA529) da una società di sintesi genica.
  2. Costruire i plasmidi in base al vettore shuttle pRSII403 per esprimere Acrs.
    1. Costruire cassette di espressione AcrIIA.
      NOTA: Utilizzare la PCR touchdown per amplificare quattro diversi promotori (cioè pGPD, pACT1, pTEF2 e genCYC1t_pCYC1noTATA), i tre tipi di AcrIIA e due terminatori (ADH1t e CYC1t). Costruire una serie di TU che esprimono AcrIIA, sotto diversi promotori, tramite il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passaggio 1.3).
    2. Costruire cassette di espressione AcrVA.
      1. Sintetizzare la sequenza accettore: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, dove "sp" è una sequenza casuale che verrà sostituita da AcrVA in seguito.
        NOTA: In questo studio, le sequenze accettori sono state sintetizzate da una società di sintesi genica (Table of Materials).
      2. Assemblare i vettori accettori pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, dove il "promotore" è: pGAL1, pTEF1 e genCYC1t_pCYC1noTATA. Utilizzare il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passaggio 1.3).
      3. Inserire ciascuno dei tre AcrVA nel vettore accettore descritto al punto 5.2.2.2 (tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson [vedere punto 1.3]) per costruire un insieme di plasmidi che producono AcrVA.
  3. Ingegnerizzare ulteriormente AcrIIA4 estendendo la sua sequenza con le sequenze del linker GS e HBD(hER). Ciò consente la costruzione di un circuito β-estradiolo-responsivo.
    1. Utilizzare la PCR touchdown per ottenere separatamente le parti GS-HBD e AcrIIA4 (vedere il punto 1.3.1).
    2. Inserire AcrIIA4, GS-HBD e il vettore shuttle nella miscela Gibson e costruire il plasmide completo utilizzando il metodo Gibson (vedere il punto 1.3.3).

6. Rilevazione di crRNA: RT-qPCR e progettazione di primer

NOTA: il rilevamento del crRNA è stato ottenuto tramite RT-qPCR, che è organizzato in tre fasi.

  1. Eseguire l'estrazione e la purificazione dell'RNA dalle cellule di lievito tramite un kit di RNA.
    1. Colture di cellule di lievito per una notte in 2 mL di terreno completo definito sintetico (SDC, 1 L volume: 20 g di glucosio, 2 g di miscela AA, 6,7 g di YNB, 396 mg di leucina, 79,2 mg di triptofano, 79,2 mg di istidina e 79,2 mg di uracile) utilizzando una piastra a 24 pozzetti (240 rpm, 30 °C).
    2. Al mattino, diluire la coltura cellulare (1:100) in 2 ml di SDC fresco e continuare a far crescere le cellule di lievito a 30 °C, 240 giri/min, per altre 4 ore.
    3. Raccogliere tutti i 2 ml della soluzione cellulare e centrifugare a 20.238 x g per 2 minuti. Rimuovere accuratamente il surnatante poiché il pellet cellulare è piccolo.
    4. Estrarre l'RNA dalle cellule di lievito utilizzando un kit di RNA.
    5. Controllare la qualità dell'RNA.
      1. Preparare un gel di agarosio all'1%. Mescolare 5 μL di ciascun campione di RNA con 1 μL di colorante di carico del DNA. Quindi caricare la miscela sul gel ed eseguirla.
      2. Assicurarsi che sul gel siano presenti due bande chiare a ~4.000 nt e ~2.000 nt, corrispondenti all'RNA ribosomiale (25S/18S). Un'ulteriore banda sfocata può essere vista a ~ 80 nt per il tRNA.
    6. Utilizzare immediatamente i campioni di RNA per la sintesi del cDNA o conservarli a -80 °C per un uso futuro.
  2. Trascrizione inversa: utilizzare il metodo stem-loop 30 per formare il primo filamento di cDNA corrispondente al crRNA (40 nt). Per la trascrizione inversa dello sgRNA (quasi 100 nt), la procedura è la stessa di quella per la sintesi di cDNA del gene di riferimento ACT1.
    NOTA: Il metodo per la trascrizione inversa del crRNA è diverso da quello utilizzato con l'sgRNA e l'mRNA ACT1 . Poiché il crRNA è molto corto, è stato trattato come un microRNA e ha utilizzato il metodo di trascrizione inversa dei microRNA (approccio stem-loop) per ottenere il corrispondente cDNA. Due kit di sintesi del cDNA (un kit stem-loop per il crRNA e un usuale kit di trascrizione inversa per il gene ACT1 ) sono stati utilizzati nella quantificazione del crRNA. La stessa quantità di RNA è stata utilizzata nei due kit (vedi Tabella dei materiali) per rendere comparabili i risultati dell'esperimento. Il primer utilizzato con il kit stem-loop è stato progettato secondo la sequenza stem-loop e gli ultimi sei nucleotidi all'estremità 3' del crRNA (per la sequenza stem-loop e primer, vedi Tabella supplementare 2).
    1. Metodo stem-loop per la trascrizione inversa di crRNA
      1. Prendi il modello di RNA, il primer e i tamponi dal congelatore e lasciali sciogliere sul ghiaccio.
      2. Rimozione del DNA genomico: in primo luogo, preparare 10 μL della miscela di reazione secondo le istruzioni del kit. Mettere la miscela in un termociclatore a 42 °C per 2 min. Infine, trasferirlo sul ghiaccio.
      3. Sintesi del primo filamento di cDNA: preparare 20 μL della miscela di reazione aggiungendo 10 μL della miscela dal punto 6.2.1.2, 1 μL di primer stem-loop (concentrazione di 2 μM), 2 μL di tampone di reazione RT 10x, 2 μL di miscela enzimatica di trascrizione inversa (contenente la trascrittasi inversa) e 5 μL di H2O privo di RNasi.
      4. Mettere la miscela di reazione in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 25 °C per 5 min, 50 °C per 15 min e 85 °C per 5 min. Utilizzare immediatamente il prodotto per la reazione qPCR o conservarlo a -80 °C.
    2. trascrizione inversa di sgRNA e mRNA ACT1
      1. Prima reazione: preparare una miscela da 13 μL composta dalla miscela di primer, miscela dNTP, modello di RNA (50 pg-5 μg) e acqua priva di RNasi (a parte il modello di RNA, tutto fornito dal kit), secondo le istruzioni del kit. Utilizzare 1 μg di modello di RNA. Mettere la miscela in un termociclatore a 70 °C per 10 minuti.
      2. Seconda reazione (sintesi del cDNA): preparare la miscela di reazione aggiungendo i reagenti (come descritto nelle istruzioni del kit) ai 13 μL della prima soluzione di reazione fino ad un volume finale di 20 μL. Porre la miscela in un termociclatore per 15 minuti a 50 °C e poi per altri 5 minuti a 85 °C. Utilizzare immediatamente il prodotto per la reazione qPCR o conservarlo a -80 °C.
  3. Kit SYBR per qPCR: rilevamento del valore Ct
    NOTA: Il primer inverso utilizzato nella qPCR del crRNA è fisso perché corrisponde al complemento inverso della sequenza stem-loop (vedi Tabella supplementare 2). Il primer in avanti, al contrario, è variabile e dipende dalla sequenza del crRNA. I primer avanti e indietro per la qPCR di sgRNA e ACT1 mRNA sono progettati in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Due primer vengono scelti quando la differenza tra le loro temperature di fusione non è superiore a 2 °C (vedi tabella supplementare 2). Ogni campione viene misurato in tre repliche.
    1. Preparare la miscela di reazione qPCR secondo le istruzioni del produttore per il kit SYBR.
    2. Impostare il seguente programma qPCR in una macchina real-time PCR.
      Preincubazione: 10 min a 95 °C.
      Stadio PCR: 15 s a 95 °C, seguito da 34 s a 55 °C. Impostare il ciclo della fase PCR su 45 volte. Fase di fusione: 10 s a 95 °C, seguita da 60 s a 65 °C e infine 1 s a 97 °C.
    3. Calcolare i valori relativi di espressione dell'mRNA tramite la formula31 di Pfaffl.

7. Immunofluorescenza per rilevare le proteine Cas

NOTA: Le proteine Cas (CasP) sono fuse in un His_tag.

  1. Preparazione delle cellule di lievito
    1. Prelevare alcune cellule di lievito usando un ciclo sterile e coltivarle in 5 ml di terreno ricco di YPD durante la notte a 240 giri / min a 30 ° C. Al mattino, aggiungere 500 μL della soluzione cellulare a 20 ml di YPD fresco e farli crescere a 240 giri/min a 30 °C fino a quando OD600 raggiunge 0,6.
    2. Prendi 5 ml di coltura e mescolala con 500 μL di formaldeide al 37%. Lasciare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.500 x g per 5 minuti.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di tampone di fissazione (0,1 M KH 2 PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7% formaldeide, pH = 6,5). Mantenere la soluzione cellulare a RT per 20 minuti.
    4. Centrifugare la soluzione cellulare a 1.500 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio (0,1 M KH 2 PO 4,1,2M sorbitolo, pH = 6,5) integrato con 4 μL di beta-mercaptoetanolo e4 μL di soluzione di lisato (5 mg/ml). Mettere la soluzione cellulare in un incubatore a 37 °C per 20 minuti.
    5. Centrifugare la soluzione cellulare a 1.500 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet cellulare due volte con 1 mL di PBS mediante centrifugazione (1.500 x g per 5 minuti).
    6. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS più 0,05% Tween 20 e aggiungere 4 μL di soluzione di BSA (10 mg/ml). Mantenere la soluzione cellulare a RT per 20 minuti.
  2. Incubazione con anticorpo primario
    1. Aggiungere l'anticorpo primario anti-His tag alla miscela al punto 7.1.6 con una diluizione 1:400. Mantenere la soluzione a RT per 2 ore.
    2. Centrifugare la miscela al punto 7.2.1 a 1.500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBST e centrifugare (1.500 x g) per 5 minuti per lavare il pellet cellulare. Ripetere questa operazione due volte. Infine, scartare il surnatante e sospendere le cellule in 100 μL di 1x PBST.
  3. Rilevamento di cellule al microscopio
    1. Montare le celle su una diapositiva; prelevare 2 μL della soluzione cellulare dal punto 7.2.2 e posizionarla su un vetrino. Coprilo con un foglietto.
    2. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza. Accendere la sorgente luminosa fluorescente, il microscopio e il computer. Annotare il numero della sorgente luminosa fluorescente e aprire il software del microscopio sul computer.
    3. Metti il vetrino sul palco del microscopio. Scegli l'obiettivo 40x e osserva le celle sotto la luce verde (550 nm). Spostare la manopola di messa a fuoco grossolana fino a quando non appare il contorno delle cellule di lievito. Spostare la manopola di messa a fuoco fine per mettere a fuoco le celle.
    4. Rileva le cellule con il software del microscopio. Chiudere il campo visivo del microscopio e passare allo schermo del computer. Fare clic su Live, attendere 3-5 secondi e fare clic su Cattura per scattare una foto. Salvare l'immagine.
    5. Spegnere il computer, il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente.

8. Acquisizione dati: FACS

NOTA: La fluorescenza verde viene rilevata tramite citometria a flusso (cioè misurazioni di selezione cellulare attivata da fluorescenza [FACS]). Le cellule di lievito vengono coltivate, in generale, a 30 °C e 240 giri/min per eseguire esperimenti FACS. Tuttavia, le cellule potrebbero richiedere alcune precauzioni a seconda del loro contenuto genetico. Le cellule che contengono il gene dCas12a-VPR (controllato dal promotore costitutivo GPD ) devono essere coltivate per 24 ore nella soluzione SDC. Successivamente, le cellule vengono diluite con un rapporto di 1:100 in SDC fresco e coltivate per altre 12 ore prima di misurare l'intensità della fluorescenza. Anche le cellule modificate con il gene AcrIIA4-HBD(hER) richiedono la diluizione. Inoltre, OD600 deve essere controllato. In primo luogo, le cellule possono crescere in SDC durante la notte (oltre 14 ore). Al mattino, viene misurato OD600 . Quindi la coltura viene diluita in SDC, fornita con una concentrazione diversificata di β-estradiolo, fino a OD600 = 0,1. Prima degli esperimenti FACS, le cellule vengono coltivate per altre 7 ore in modo tale che OD600 raggiunga 0,8-1,0. Le cellule che esprimono dCas9-VP64 o dCas12a-VP64 vengono coltivate in SDC per 20-24 ore senza diluizione e ulteriore crescita prima delle misurazioni presso la macchina FACS.

  1. Accendere la macchina FACS 20 minuti prima delle misurazioni per riscaldare il laser.
  2. Preparare i campioni (diluizione): mescolare 20 μL della coltura cellulare con 300 μL di ddH2O.
  3. Eseguire il software FACS sul computer collegato al computer FACS e creare un nuovo esperimento. Impostare i parametri di misurazione (ad esempio, FSC(SSC)-A/H/W e istogramma).
  4. Selezionare il filtro in base alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei campioni. Ad esempio, la proteina bersaglio qui è yEGFP, le cui lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono rispettivamente 488 nm e 507 nm. Quindi, selezionare il filtro FITC o GFP (lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm; lunghezza d'onda di emissione: 527/32 nm). Impostare il numero di cella di acquisizione su 10.000.
  5. Regolare la tensione del filtro FITC misurando l'intensità delle sfere fluorescenti. Assicurarsi che la differenza relativa nell'intensità delle perle tra due esperimenti consecutivi non superi il 5%.
  6. Lavare la macchina con ddH2O per alcuni secondi per rimuovere eventuali perline in eccesso.
  7. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione. Fare clic su Anteprima e attendere 3-5 s per la stabilità dell'iniezione del campione. Infine, fai clic su Acquisisci.
  8. Misurare nuovamente le perline alla fine dell'esperimento. La tensione è quella utilizzata durante la misurazione iniziale delle sfere (vedere passo 8.4, 438-441 V). Controllare se la differenza relativa tra le misure delle due perle supera il 5%.
  9. Esportare i dati FACS come file FCS.
  10. Analizza i file FCS con il software R Studio.

9. Analisi dei dati

NOTA: utilizzare il pacchetto 32 di Flowcore R Bioconductor all'interno di R studio. I file FCS sono stati analizzati utilizzando uno script scritto in linguaggio R.

  1. Aprire R studio e caricare l'analisi Bdverse dello script. R per analizzare i file FCS.
  2. Impostare il nome dell'esperimento (ename), la directory (percorso) in cui si trovano i file FCS
    Archiviato (dir_d) e dove verranno creati i file dei risultati (dir_r).
  3. Impostare il canale di fluorescenza. Ad esempio, select_ch = "GPA-A" se è stata misurata la fluorescenza verde.
  4. Impostare il numero di campioni misurati (s_num).
  5. Impostate le dimensioni di ciascun dot plot (sxlim, sylim). Impostate la lunghezza massima degli assi x e y per i grafici a barre e i box plot (xlimit, ylimit). xlimit deve essere maggiore o uguale a s_num.
  6. Scegliere il metodo di gating rimuovendo il # dalle righe corrispondenti.
    NOTA: morphGate è un metodo di gating automatico eseguito dallo script (cioè, la regione dei grafici di punti in cui le celle sono più dense viene riconosciuta e selezionata dal programma). polygonGate e rectangleGate richiedono di esaminare i grafici a punti e definire i vertici di un poligono o il lato di un rettangolo che abbraccia la zona in cui si trova la maggior parte delle celle.
  7. Selezionare l'oggetto flowSet gated, corrispondente al metodo di gating scelto. Selezionare la risoluzione del dot plot (res; deve essere almeno uguale a 256).
  8. Decommentare flt_low <- filter_low(sp) per rimuovere le misurazioni in cui la fluorescenza è negativa. Rimuovi il commento flt_sp <- filter(flt_lw) per rimuovere i valori anomali dovuti ad altri esperimenti.
  9. Premere Source ed eseguire lo script. Tutti i file contenenti i risultati dell'analisi vengono creati in dir_r.

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Representative Results

Espressione di sgRNA/crRNA da parte di un promotore di tipo III della RNA polimerasi
In primo luogo, questo lavoro ha affrontato l'ingegneria del circuito di attivazione trascrizionale (circuito 1) mostrato nella Figura 1A. Conteneva tre componenti di base: 1) il gene che codifica per yEGFP (il reporter), che è stato preceduto da una serie di diversi promotori sintetici che hanno fornito siti bersaglio per dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versione ottimizzata per il codone di lievito di dCas9 o dCas12a fusa in un dominio di attivazione (VP64 e VPR, rispettivamente) e contenente una o due sequenze di localizzazione nucleare (NLS). Entrambe le proteine dCas sono state prodotte da un forte promotore costitutivo-pGPD; e 3) una sequenza di sgRNA/crRNA che ha guidato dCas9/dCas12a-AD verso i siti bersaglio. L'efficienza di attivazione degli attivatori basati su dCas9/dCas12a è stata visualizzata e riflessa dall'intensità di fluorescenza del reporter (misurata tramite esperimenti FACS).

Sono state testate una proteina dCas9 (dSpCas9) e due proteine dCas12a (denAsCas12a e dLbCas12a). Un'attivazione di 3,36 volte è stata ottenuta con dSpCas9 esteso, al suo terminale C, con VP64 AD e legando un promotore sintetico a monte di yEGFP contenente sei copie del sito target lexOp. L'sgRNA è stato inserito in un vettore shuttle integrativo e trascritto dal promotore SNR52 RNA polimerasi III-dipendente (configurazione SNR52i , vedi Figura 1B). Nel caso di dCas12a, denAsCas12a-VPR ha restituito la massima attivazione (4,45 volte) da un promotore sintetico con tre operatori quando il crRNA è stato espresso tramite la configurazione SNR52i (Figura 1C). Nelle stesse condizioni, dLbCas12a-VPR ha ottenuto il suo miglior miglioramento della fluorescenza (3,21 volte) (Figura 1D). Va notato che il termine di confronto, in ogni esperimento, era un circuito il cui sgRNA/crRNA non poteva legare gli operatori lex.

I plasmidi multicopia non sono necessari
La cassetta di espressione dell'sgRNA SNR52i è stata sostituita con una struttura RGR espressa da un promotore-pADH1 moderatamente forte. Tuttavia, in entrambi i casi di dCas9 e dCas12a, l'attivazione in presenza di uno sgRNA/crRNA generato dall'autoscissione di RGR è apparsa paragonabile o addirittura inferiore a quella ottenuta con uno sgRNA/crRNA prodotto tramite SNR52i, nonostante il fatto che pSNR52 fosse considerato un promotore debole (vedi Figura 1C,D per i primi risultati ottenuti con dCas12a).

Per esplorare ulteriormente la connessione tra la quantità di sgRNA/crRNA e l'efficienza di attivazione, i due sistemi di espressione di sgRNA/crRNA sono stati inseriti in un plasmide episomiale, che può essere assorbito dalla cellula in 10-40 copie e generare una maggiore quantità di sgRNA/crRNA. Come mostrato nella Figura 2A, l'attivazione da parte del crRNA localizzato su un plasmide integrativo (SNR52i o RGRi) era da 1,4 a 2,4 volte superiore a quella ottenuta quando lo stesso crRNA era espresso da un plasmide episomiale (SNR52m o RGRm). La tendenza è stata confermata dallo sgRNA. In questo caso, il plasmide integrativo ha garantito un'attivazione da 1,1 a 1,5 volte superiore (Figura 2B). Per escludere che i risultati fossero causati da una perdita dei plasmidi episomiali, è stata effettuata RT-qPCR per quantificare l'abbondanza relativa di sgRNA/crRNA in vivo. I risultati, in Figura 2C,D, hanno verificato che il vettore episomiale produceva un livello molto più alto di sgRNA/crRNA rispetto al vettore integrativo, indipendentemente dal sistema di espressione (RGR o SNR52). Questi risultati hanno mostrato che il sistema SNR52 potrebbe funzionare anche meglio del sistema RGR, e una maggiore quantità di sgRNA / crRNA nella cellula non garantisce una maggiore attivazione da parte del sistema CRISPR-Cas. Pertanto, i plasmidi episomiali non dovrebbero essere impiegati nella costruzione di circuiti digitali genici in cui vengono utilizzati dCas9/dCas12a-AD.

Ingegneria dell'RNA dello scaffold
Uno scRNA è stato progettato estendendo la sequenza di uno sgRNA con strutture a forcina MS2 che hanno permesso di reclutare VP64 AD quando fuso alla proteina di rivestimento MS2 (MCP, vedi Figura 3A). In questo modo, non è stata necessaria alcuna ingegnerizzazione né modifica di dCas9. Sono state provate due varianti MS2: wt e f6. Lo scRNA contenente la singola forcina MS2 - 1×MS2 (wt) e 1×MS2 (f6) - ha dato un'attivazione rispettivamente di 5,27 volte e 4,34 volte. Tuttavia, lo scRNA con una combinazione delle due forcine - 2×MS2 (wt + f6) - ha restituito la più alta attivazione complessiva in questo studio (7,54 volte, vedi Figura 3B). Questi risultati hanno dimostrato che l'ingegnerizzazione di uno scRNA era molto più efficace della fusione diretta di qualsiasi dominio di attivazione con dSpCas9.

Gate booleano a base di proteine Acr
Per controllare ulteriormente e sintonizzare l'attivazione trascrizionale da parte dei sistemi CRISPR-Cas, il circuito 1 è stato modificato con l'inserimento di una quarta TU per l'espressione delle proteine anti-CRISPR (vedi Figura 4A per AcrIIAs e Figura 5A per AcrVAs). Dopo aver dimostrato che gli Acr erano efficaci, in S. cerevisiae, nel contrastare l'attivazione dovuta a dCas9/dCas12a-AD, è stato costruito un nuovo circuito (vedi Figura 5D) per testare l'azione di AcrVA su repressori basati su dCas12a (un precedente lavoro33 aveva già dimostrato che gli AcrIIA potevano inibire la down-regulation genica basata su dCas9). Le nuove piccole reti contenenti Acr hanno funzionato come semplici porte booleane (SÌ e NOT), che potrebbero portare a un restyling dello strato di ingresso di circuiti digitali di geni sintetici più complessi.

AcrIIA4 è un forte inibitore di dSpCas9
Quattro diversi promotori con diversi punti di forza sono stati utilizzati per guidare l'espressione di tre tipi di AcrII: AcrIIA2, AcrIIA4 e AcrIIA5. I risultati hanno mostrato che i tre AcrII hanno funzionato in modo dose-dipendente in S. cerevisiae. Quando espressi da un forte promotore, pGPD, hanno ridotto il livello di fluorescenza raggiunto da dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 rispettivamente a 0,21, 0,11 e 0,13 del suo valore (Figura 4B). Poiché AcrIIA4 era l'unico che causava un'elevata inibizione dell'espressione di fluorescenza anche quando prodotto da un debole promotore sintetico genCYC1t_pCYC1noTATA, potremmo dedurre che AcrIIA4 era l'inibitore più forte tra i tre AcrII. Successivamente, l'HBD(ER) è stato fuso al terminale C di AcrIIA4 per costruire un dispositivo di rilevamento del β-estradiolo (vedi Figura 4C). In presenza dell'estrogeno β-estradiolo, AcrIIA4-HBD(ER) potrebbe traslocare nel nucleo e quindi neutralizzare la funzione dell'attivatore basato su dSpCas9. La curva di titolazione nella Figura 4D mostra che il circuito si comporta come un gate NOT con un rapporto ON/OFF che si avvicina a 2,3.

Gli AcrVA sono repressori delle proteine dCas12a
Un gate NOT è stato progettato e costruito inserendo la cassetta di espressione AcrVA con pilotaggio pGAL1 nel circuito 1. In questo modo, la sintesi di AcrVA, e la conseguente repressione di dCas12a-AD, potrebbe essere indotta dal galattosio (Figura 5A). Come mostrato in Figura 5B,C, AcrVA1 ha ostacolato sia denAsCas12a che dLbCas12a come attivatori riducendo l'espressione di fluorescenza dal 19% al 71%, a seconda dello schema circuitale. AcrVA4 e AcrVA5 non possono esercitare alcuna azione su denAsCas12a34. Tuttavia, hanno eseguito una forte inibizione degli attivatori basati su dLbCas12a riducendo l'espressione della fluorescenza fino all'84% (AcrVA5) e all'82% (AcrVA4). Nel complesso, AcrVA5 si è rivelato il più affidabile, tra questi tre AcrVA, nell'inibire gli attivatori basati su dLbCas12a perché garantiva, in diversi circuiti, una repressione superiore al 70%.

L'azione di AcrVA1 dipende dalla concentrazione
È stata inoltre studiata la relazione tra la concentrazione in vivo di AcrVA e i loro effetti inibitori sia sugli attivatori che sui repressori basati su denAs/dLbCas12a. A questo scopo, ogni AcrVA è stato espresso sotto diversi promotori: il pGAL1 forte, il pTEF1 a media resistenza e il genCYC1t_pCYC1noTATA debole. Come illustrato nella Figura 5E, AcrVA1 ha mostrato grandi fluttuazioni nelle sue prestazioni a seconda del promotore che ha guidato la sua sintesi. AcrVA1 ha funzionato ragionevolmente bene solo quando prodotto da pGAL1. Sotto pTEF1 e genCYC1t_pCYC1noTATA, AcrVA1 ha mostrato una certa repressione solo sul nudo dLbCas12a. AcrVA4 e AcrVA5, al contrario, sembrano essere meno sensibili alla loro concentrazione, specialmente quando interagiscono con il nudo dLbCas12a.

Questi dati hanno mostrato che AcrVA4 e AcrVA5 hanno generalmente ottenuto risultati migliori rispetto ad AcrVA1 nell'inibire i fattori di trascrizione basati su dLbCas12a in S. cerevisiae. Va notato che AcrVA5 ha un meccanismo di funzionamento peculiare, poiché agisce come un enzima che modifica LbCas12a in modo permanente. Tuttavia, come accennato in precedenza, AcrVA5 (insieme ad AcrVA4) non può interagire con denAsCas12a.

Quando gli AcrVA sono espressi sotto pGAL1, i circuiti diventano porte SÌ (dCas12a è stato fuso con un AD) o porte NOT (nudo dCas12a). I primi sembravano tutti altamente performanti, mentre i secondi sembravano funzionare meglio in presenza di AcrVA4 o AcrVA5.

Figure 1
Figura 1: Attivazione trascrizionale mediata da dCas9/dCas12a-AD. (A) Schema del circuito 1. I promotori sintetici di yEGFP contenevano sei (6x) e tre (3x) copie di siti target per dCas9 o dCas12a, rispettivamente. Successivamente, dCas9 / dCas12a-AD si combina con sgRNA / crRNA; Il promotore sintetico è mirato e attivato a causa della presenza dei domini di attivazione. (B) La migliore efficienza di attivazione di dSpCas9-VP64 è stata raggiunta quando c'erano sei siti bersaglio lexOp sul promotore sintetico, e l'sgRNA è stato trascritto da SNR52i. (C,D) La massima efficienza di attivazione di dCas12a-VPR è stata ottenuta quando tre copie di lexOp sono state inserite nel promotore sintetico e il crRNA è stato generato da SNR52i. SNR52i significa che l'sgRNA/crRNA è stato prodotto da pSNR52, e la cassetta di espressione è stata posta all'interno di un vettore shuttle integrativo. RGRi significa che è stato utilizzato un plasmide integrativo che ospita la cassetta RGR per esprimere sgRNA/crRNA. Il controllo negativo, "-", rappresenta uno sgRNA/crRNA contenente una sequenza di distanziatori codificati che non corrisponde al sito lexOp né ad alcuna sequenza lungo il genoma del lievito. "bA" indica che l'sgRNA/crRNA lega il filamento antisenso del DNA bersaglio, mentre "bS" sta per legare il filamento di senso. Ogni livello di fluorescenza rappresenta il valore medio di almeno tre esperimenti indipendenti (cioè condotti in giorni diversi). Le barre di errore sono la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il confronto tra sgRNA/crRNA produttore di plasmidi integrativi ed episomiali. (A) Efficienza di attivazione di dLbCas12a-VPR:crRNA quando si prende di mira un singolo sito sul promotore a monte di yEGFP. (B) dSpCas9-VP64:sgRNA attivato n× promotore sintetico ("n" sta per il numero di siti bersaglio lexOp). (C,D) Livello di espressione normalizzata di sgRNA/crRNA15,16. "i" significa che la cassetta di espressione sgRNA/crRNA è stata inserita in un vettore shuttle integrativo, mentre "m" sta per plasmide multicopia (cioè episomiale). "bA"/"bS" indica che lo sgRNA/crRNA lega il filamento antisenso/senso del DNA. "ctrl" è un controllo negativo, in cui è stato espresso un sgRNA / crRNA codificato. Ogni livello di fluorescenza rappresenta il valore medio di almeno tre esperimenti indipendenti (cioè condotti in giorni diversi). Le barre di errore sono la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'efficienza di attivazione del dSpCas9 nudo in complesso con uno scRNA. (A) Il diagramma schematico delle interazioni tra scRNA, MCP-VP64 e dSpCas916. La struttura a forma di cappuccio in viola rappresenta MCP (MS2 coat protein). Una forcina MS2 (la struttura viola nello scRNA) può reclutare e legare due copie di MCP. Pertanto, uno scRNA consente non solo il legame al DNA da parte di dSpCas9, ma anche l'attivazione dell'espressione genica attraverso il reclutamento di MCP-VP64. (B) L'efficienza di attivazione di dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. Sono stati testati tre tipi di scRNA: uno che trasportava la forcina MS2 wild-type-1×MS2(wt), un altro ingegnerizzato con l'aptamero MCP f6-1×MS2(f6), e l'ultimo contenente entrambe le forcine-2×MS2(wt+f6), che si è rivelato il più performante. Ogni livello di fluorescenza rappresenta il valore medio di almeno tre esperimenti indipendenti (cioè condotti in giorni diversi). Le barre di errore sono la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Circuiti correlati ad AcrIIA e risultati. (A) La cassetta di espressione AcrIIA è stata inserita nel circuito 1. Questa TU aggiuntiva include pGPD che guida l'espressione di AcrIIA per contrastare dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64. (B) L'efficienza di inibizione degli AcrIIA sul miglior attivatore basato su dSpCas9 nella Figura 3B. La linea tratteggiata nera rappresenta la fluorescenza in presenza dell'attivatore basato su dSpCas9. Le cifre sopra ciascuna colonna mostrano l'efficienza di inibizione calcolata come rapporto OFF/ON (cioè il livello di fluorescenza in presenza di AcrIIA diviso per la fluorescenza in assenza di AcrIIA). Nella leggenda, la forza dei quattro promotori costitutivi aumenta gradualmente dall'alto verso il basso. (C) Diagramma del dispositivo sensibile al β-estradiolo (NOT gate) che esprime AcrIIA4-HBD(hER). (D) Curva di titolazione del circuito in (C)16. La curva verde si riferisce alla variazione della fluorescenza nel circuito funzionale. La curva nera è stata derivata dalla deformazione senza l'espressione di AcrIIA4-HBD(hER), il controllo negativo. La linea tratteggiata in grigio segnava il plateau di fluorescenza all'equilibrio. È stata calcolata come media dei valori di fluorescenza a concentrazioni di β-estradiolo non inferiori a 125 nM. Ogni livello di fluorescenza rappresenta il valore medio di almeno tre esperimenti indipendenti (cioè condotti in giorni diversi). Le barre di errore sono la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Circuiti correlati ad AcrVA e risultati. (A) La cassetta di espressione AcrVA è stata inserita nel circuito 1. La nuova TU contiene il promotore inducibile pGAL1 a monte dei geni AcrVA che neutralizzano il funzionamento di dCas12a-AD. Il nuovo circuito è un cancello NOT regolato da galattosio. (B,C) Risultati dal gate NOT sensibile al galattosio in (A). Qui, pGAL1 guida la sintesi di AcrVA, che poi interagiscono con dCas12a-AD15. La fluorescenza relativa corrisponde al rapporto OFF/ON. (D) Porta SÌ sensibile al galattosio. Impiega AcrVA sotto il controllo di pGAL1 e del nudo dCas12as che reprime la sintesi di yEGFP. (E) Confronto delle efficienze di inibizione degli AcrVA espresse da promotori di diversa intensità15. I gruppi "AcrV effects on repression" e "bare dLb" si riferiscono al circuito di cui al punto (D). I gruppi "AcrV effects on activation" e "dLb-VPR" sono i risultati del gate NOT in (A). Ogni livello di fluorescenza rappresenta il valore medio di almeno tre esperimenti indipendenti (cioè condotti in giorni diversi). Le barre di errore sono la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Un elenco di tutte le sequenze di DNA utilizzate in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Un elenco di primer utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementari: lo script R Studio per analizzare i file FCS. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo ha mostrato un possibile flusso di lavoro completo per circuiti digitali di geni sintetici, seguendo il ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e riguardante sia esperimenti di laboratorio secco che di laboratorio umido. Qui, ci siamo concentrati sul sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a e le corrispondenti proteine anti-CRISPR, progettando e costruendo in S. cerevisiae piccole reti trascrizionali. Alcuni di loro imitavano le porte booleane, che sono i componenti di base dei circuiti digitali. Tutti i circuiti qui descritti ci hanno permesso di rappresentare le proprietà e le caratteristiche delle proteine associate a CRISPR e anti-CRISPR in S. cerevisiae. Questi risultati sono essenziali per includere queste proteine nello schema dei circuiti digitali genici.

Il concetto DBTL fornisce un quadro di riferimento nella biologia sintetica, mentre molte ottimizzazioni e miglioramenti devono essere fatti dopo aver testato un nuovo artefatto. Ad esempio, nel circuito 1, inizialmente c'era un solo sito target (una copia di lexOp) per dCas9/dCas12a-AD sul promotore sintetico a monte di yEGFP. Dopo aver testato quella configurazione del circuito, abbiamo scoperto che non poteva raggiungere più di una doppia attivazione15,16. Quindi, abbiamo ipotizzato che aumentando il numero di copie di lexOp, come in7, avremmo potuto raggiungere una maggiore attivazione trascrizionale. In effetti, un livello di fluorescenza più elevato è stato ottenuto utilizzando da tre a sei siti lexOp (Figura 1). Inoltre, abbiamo ulteriormente migliorato le prestazioni dei circuiti che ospitano dSpCas9 ingegnerizzando uno scRNA, che è più facile che fondere uno o più AD con una grande proteina come dSpCas9 (Figura 3). Inoltre, utilizzando un promotore di diversi dosaggi per produrre i tre AcrIIA che abbiamo scelto, abbiamo concluso che AcrIIA4 era l'inibitore più forte tra loro. Pertanto, abbiamo costruito un nuovo gate NOT reattivo al β-estradiolo fondendo l'HBD(ER) con AcrIIA4 e sfruttando la forte repressione di AcrIIA4 sul nostro miglior attivatore basato su dSpCas9 (Figura 4).

Allo stesso modo, abbiamo caratterizzato profondamente sia il lavoro di denAsCas12a e dLbCas12a nel lievito che le loro interazioni con tre AcrVA (Figura 5). Per ogni coppia dCas12a-AcrVA, abbiamo costruito un gate NOT (dCas12a è stato fuso con un AD) e un gate SÌ (dCas12a nudo) reattivo al galattosio. Nel complesso, dLbCas12a, insieme ad AcrVA5, ha prodotto il miglior sistema per calcolare semplici funzioni logiche.

Il metodo qui descritto ha presentato alcuni passaggi critici. Tutte le sequenze di DNA proteico sono state ottimizzate per il codone di lievito per garantire una maggiore espressione in S. cerevisiae. Per evitare bersagli non specifici di dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a nel genoma di S. cerevisiae , abbiamo selezionato un operatore batterico come lexOp. Inoltre, ceppi contenenti il promotore GAL1 hanno mostrato un significativo ritardo di crescita che potrebbe limitare l'applicabilità di pGAL1 ai circuiti genici sintetici15.

Alcune modifiche potrebbero anche essere apportate ad alcune fasi del metodo generale. Al fine di migliorare l'efficienza della procedura di legatura della digestione, è preferibile digerire 10 μg (durante la notte) sia del plasmide contenente l'inserto che dei vettori accettori, piuttosto che solo 5 μg in 1 ora. In questo modo, una maggiore concentrazione di DNA viene raggiunta dopo la fase di eluizione. Il tempo per la legatura T4 dovrebbe essere esteso da 1 ora (protocollo del produttore) a 8 ore. Infine, i ceppi contenenti la proteina di fusione dCas12a-VPR devono essere diluiti dopo una coltura di 24 ore e coltivati per ulteriori 12 ore prima di eseguire un esperimento FACS. In questa condizione, la variabilità tra i livelli di fluorescenza da cellule diverse non è più troppo elevata e una deviazione standard accettabile accompagna il valore medio dell'intensità di fluorescenza su una popolazione cellulare.

In sintesi, questo protocollo ha spiegato come semplificare la progettazione di circuiti digitali genici facendo uso di proteine dCas e, possibilmente, proteine anti-CRISPR. Ancora più importante, abbiamo mostrato in dettaglio come funzionano queste famiglie di proteine in S. cerevisiae e quali di esse sono le più promettenti per un futuro utilizzo all'interno delle reti digitali. Un problema irrisolto è l'accoppiamento di sistemi CRISPR-dCas / anti-CRISPR e sostanze chimiche, che rappresentano gli ingressi del circuito e non possono legare direttamente le proteine dCas o anti-CRISPR. Qui, abbiamo aggirato il problema usando il promotore GAL1 inducibile o l'HBD (ER) collegato ad AcrIIA4. Tuttavia, è necessario un modo per generalizzare l'architettura dello strato di ingresso del circuito per progettare circuiti digitali di geni sintetici per diverse aree di bioingegneria come l'ingegneria metabolica, la biosintesi, il biorilevamento, la biodiagnostica e il biorisanamento.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Acknowledgments

Vogliamo ringraziare tutti gli studenti del laboratorio di biologia sintetica - SPST, TJU - per il loro aiuto generale, insieme a Zhi Li e Xiangyang Zhang per la loro assistenza negli esperimenti FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

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References

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Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

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