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Bioengineering

CRISPR-CAS सिस्टम और एंटी-CRISPR प्रोटीन पर आधारित जीन डिजिटल सर्किट

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-CAS सिस्टम और एंटी-CRISPR प्रोटीन को Saccharomyces cerevisiae में बूलियन गेट्स की योजना में एकीकृत किया गया था। नए छोटे तर्क सर्किट ने अच्छा प्रदर्शन दिखाया और डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-आधारित प्रतिलेखन कारकों और एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन के गुणों दोनों की समझ को गहरा कर दिया।

Abstract

सिंथेटिक जीन बूलियन गेट्स और डिजिटल सर्किट में चिकित्सा निदान से लेकर पर्यावरण देखभाल तक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। CRISPR-Cas सिस्टम और उनके प्राकृतिक अवरोधकों की खोज - एंटी-CRISPR प्रोटीन (Acrs) - विवो जीन डिजिटल सर्किट में डिजाइन और कार्यान्वित करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो "डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न" जैविक इंजीनियरिंग चक्र के विचार का पालन करता है और छोटे ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क स्थापित करने के लिए उनके संबंधित एसीआर के साथ मिलकर डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए का उपयोग करता है, जिनमें से कुछ बुलियन गेट्स की तरह व्यवहार करते हैं। ये परिणाम प्रतिलेखन कारकों के रूप में dCas9 / dCas12a के गुणों को इंगित करते हैं। विशेष रूप से, जीन अभिव्यक्ति के अधिकतम सक्रियण को प्राप्त करने के लिए, dSpCas9 को एक इंजीनियर मचान आरएनए के साथ बातचीत करने की आवश्यकता होती है जो VP64 सक्रियण डोमेन (AD) की कई प्रतियां एकत्र करता है। इसके विपरीत, डीसीएएस 12 ए को सी टर्मिनस पर, मजबूत वीपी 64-पी 65-आरटीए (वीपीआर) एडी के साथ जोड़ा जाएगा। इसके अलावा, सेल में एसजीआरएनए / सीआरआरएनए की मात्रा में वृद्धि करके दोनों कैस प्रोटीन की गतिविधि को बढ़ाया नहीं जाता है। यह लेख यह भी बताता है कि CRISPR-dCas-Acr इंटरैक्शन के आधार पर बूलियन गेट कैसे बनाएं। मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर का एसीआरआईआईए 4 फ्यूज्ड हार्मोन-बाइंडिंग डोमेन β-एस्ट्राडियोल के प्रति उत्तरदायी नॉट गेट का मूल है, जबकि इंड्यूसेबल जीएएल 1 प्रमोटर द्वारा संश्लेषित एसीआरवीए एक इनपुट के रूप में गैलेक्टोज के साथ यस और नॉट गेट्स दोनों की नकल करने की अनुमति देता है। बाद के सर्किट में, AcrVA5, dLbCas12a के साथ, सबसे अच्छा तर्क व्यवहार दिखाया।

Introduction

2011 में, शोधकर्ताओं ने एक कम्प्यूटेशनल विधि का प्रस्ताव दिया और डिजिटल सिंथेटिक जीन सर्किट1 के स्वचालित डिजाइन के लिए सॉफ्टवेयर का एक संबंधित टुकड़ा विकसित किया। एक उपयोगकर्ता को इनपुट (तीन या चार) की संख्या निर्दिष्ट करनी थी और सर्किट सत्य तालिका भरनी थी; इसने इलेक्ट्रॉनिक्स से तकनीकों का उपयोग करके सर्किट संरचना प्राप्त करने के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्रदान की। सत्य तालिका का कर्णौघ मानचित्र विधि2 के माध्यम से दो बूलियन सूत्रों में अनुवाद किया गया था। प्रत्येक बूलियन सूत्र खंडों से बना होता है जो सर्किट इनपुट और उनके निषेधों (शाब्दिक) के बीच तर्क संचालन (योग या गुणन) का वर्णन करते हैं। सर्किट आउटपुट की गणना करने के लिए खंड, उनकी बारी में, या तो अभिव्यक्त (ओआर) या गुणा (एएनडी) होते हैं। प्रत्येक परिपथ को इसके दो संगत सूत्रों में से किसी एक के अनुसार महसूस किया जा सकता है: एक पीओएस (रकम का उत्पाद) रूप में लिखा गया है और दूसरा एसओपी (उत्पादों का योग) प्रतिनिधित्व में लिखा गया है। पूर्व में खंडों (यानी, बूलियन गेट) का गुणन होता है जिसमें शाब्दिक का तर्क योग होता है। उत्तरार्द्ध, इसके विपरीत, खंडों का एक योग है जहां शाब्दिक गुणा किए जाते हैं।

इलेक्ट्रिक सर्किट को ब्रेडबोर्ड पर, शारीरिक रूप से विभिन्न द्वारों को एक साथ वायर करके महसूस किया जा सकता है। विद्युत प्रवाह फाटकों के बीच संकेतों के आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जिससे आउटपुट की गणना होती है।

जीव विज्ञान में, स्थिति अधिक जटिल है। एक बूलियन गेट को प्रतिलेखन इकाई (टीयू; यानी, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अंदर अनुक्रम "प्रमोटर-कोडिंग क्षेत्र-टर्मिनेटर" के रूप में महसूस किया जा सकता है, जहां प्रतिलेखन या अनुवाद (या दोनों) को विनियमित किया जाता है। इस प्रकार, कम से कम दो प्रकार के अणु एक जैविक वायरिंग स्थापित करते हैं: प्रतिलेखन कारक प्रोटीन और गैर-कोडिंग, एंटीसेंस आरएनए1।

एक जीन डिजिटल सर्किट को गेट की दो या तीन परतों में व्यवस्थित किया जाता है, अर्थात्: 1) इनपुट परत, जो हां (बफर) से बनी होती है और गेट नहीं होती है और इनपुट रसायनों को वायरिंग अणुओं में परिवर्तित करती है; 2) आंतरिक परत, जिसमें उतने ही टीयू होते हैं जितने कि संबंधित बूलियन सूत्र में खंड होते हैं। यदि सर्किट एसओपी सूत्र के अनुसार डिज़ाइन किया गया है, तो आंतरिक परत में प्रत्येक खंड तथाकथित वितरित आउटपुट आर्किटेक्चर में सर्किट आउटपुट (जैसे, प्रतिदीप्ति) का उत्पादन करेगा। यदि योग (पीओएस) सूत्र के उत्पाद का उपयोग किया जाता है, तो एक 3) अंतिम परत की आवश्यकता होती है, जिसमें आंतरिक परत से तारों के अणुओं को इकट्ठा करने वाला एक एकल गुणक द्वार होगा।

कुल मिलाकर, सिंथेटिक जीव विज्ञान में, एक ही सर्किट के लिए कई अलग-अलग योजनाएं तैयार की जा सकती हैं। वे टीयू और वायरिंग अणुओं दोनों की संख्या और प्रकार में भिन्न होते हैं। खमीर कोशिकाओं में लागू किए जाने वाले सबसे आसान समाधान को चुनने के लिए, प्रत्येक सर्किट डिज़ाइन एक जटिलता स्कोर एस के साथ जुड़ा हुआ है, जिसे

Equation 1

जहां ए सक्रियकर्ताओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, आर दमनकारियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और ए एंटीसेंस आरएनए अणुओं की मात्रा है। यदि या तो सक्रियकर्ता या दमनकारी सर्किट से अनुपस्थित हैं, तो एस में उनका योगदान शून्य है। इसलिए, प्रयोगशाला (उच्च एस) में एक सर्किट योजना का एहसास करना अधिक कठिन है जब इसे उच्च संख्या में ऑर्थोगोनल प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है। इसका मतलब है कि डिजिटल सर्किट के अंदर पूर्ण तारों का एहसास करने के लिए नए सक्रियकर्ताओं और दमनकारियों को नए सिरे से इंजीनियर किया जाएगा। सिद्धांत रूप में, नोवेल डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को जिंक फिंगर प्रोटीन3 और टीएएल प्रभावकों4 का उपयोग करके टेम्पलेट के रूप में इकट्ठा किया जा सकता है। हालांकि, यह विकल्प बहुत कठिन और समय लेने वाला प्रतीत होता है; इसलिए, जटिल जीन सर्किट को अंतिम रूप देने के लिए ज्यादातर छोटे आरएनए और अनुवाद विनियमन पर भरोसा करना चाहिए।

मूल रूप से, यह विधि बैक्टीरिया में डिजिटल सर्किट बनाने के लिए विकसित की गई थी। दरअसल, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, एंटीसेंस आरएनए के बजाय, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) या छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 5 के बारे में बात करना अधिक उपयुक्त है। हालांकि, आरएनएआई मार्ग खमीर एस सेरेविसिया में मौजूद नहीं है। इसलिए, किसी को पूरी तरह से ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क का विकल्प चुनना चाहिए। मान लीजिए कि एक सर्किट को पांच सक्रियकर्ताओं और पांच दमनकारियों की आवश्यकता होती है; इसका जटिलता स्कोर एस = 32 होगा। सर्किट जटिलता को 10 प्रतिलेखन कारकों को एक सक्रियण डोमेन (एडी) से जुड़े एकल डीसीएएस 96 (न्यूक्लियस की कमी वाले कैस 9) के साथ बदलकर कम किया जा सकता है। जैसा कि7 में दिखाया गया है, डीसीएएस 9-एडी टाटा बॉक्स और टीएसएस (ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट) के बीच प्रमोटर को बांधते समय खमीर में एक दमनकारी के रूप में काम करता है और टाटा बॉक्स के ऊपर अच्छी तरह से बांधने पर एक उत्प्रेरक के रूप में काम करता है। इस प्रकार, एस = 11 के कुल जटिलता स्कोर के लिए 10 प्रतिलेखन कारकों को एकल डीसीएएस 9-एडी संलयन प्रोटीन और 10 एसजीआरएनए (एकल गाइड आरएनए) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। दस एसजीआरएनए को संश्लेषित करना त्वरित और आसान है, जबकि, जैसा कि पहले टिप्पणी की गई थी, 10 प्रोटीन ों की असेंबली बहुत लंबे और अधिक जटिल काम की मांग करेगी।

वैकल्पिक रूप से, कोई दो ऑर्थोगोनल डीसीएएस प्रोटीन (जैसे, डीसीएएस 9 और डीसीएएस 12 ए) का उपयोग कर सकता है: एक एडी में फ्यूज करने के लिए, और दूसरा नंगे या दमन डोमेन के साथ संयोजन में। जटिलता स्कोर केवल एक इकाई (एस = 12) से बढ़ेगा। इसलिए, CRISPR-dCas सिस्टम S. Cerevisiae में बहुत जटिल जीन डिजिटल सर्किट के निर्माण की कुंजी हैं।

यह पेपर खमीर में dCas9- और dCas12a-आधारित रिप्रेसर्स और एक्टिवेटर्स दोनों की दक्षता को गहराई से दर्शाता है। परिणाम बताते हैं कि वे अपनी गतिविधि को अनुकूलित करने के लिए एसजीआरएनए की उच्च मात्रा की मांग नहीं करते हैं, इसलिए एपिसोमल प्लास्मिड को अधिमानतः टाला जाता है। इसके अलावा, डीसीएएस 9-आधारित सक्रियकर्ता एक मचान आरएनए (एससीआरएनए) का उपयोग करते समय कहीं अधिक प्रभावी होते हैं जो वीपी 64 एडी की प्रतियां भर्ती करता है। इसके विपरीत, मजबूत वीपीआर एडी से सीधे जुड़े होने पर डीसीएएस 12 ए अच्छी तरह से काम करता है। इसके अलावा, एक सिंथेटिक सक्रिय प्रमोटर एक्टिवेटर के कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर लक्ष्य साइटों की एक चर संख्या की मांग करता है (उदाहरण के लिए, डीसीएएस 12 ए-वीपीआर का उपयोग करते समय तीन, डीसीएएस 9-वीपी 64 के लिए छह, और डीसीएएस 9 और एससीआरएनए के साथ केवल एक)। एक दमनकारी के रूप में, प्रमोटर के बजाय कोडिंग क्षेत्र को बांधते समय डीसीएएस 12 ए अधिक तीक्ष्ण दिखाई देता है।

एक दोष के रूप में, हालांकि, CRISPR-dCas9 / dCas12a सीधे रसायनों के साथ बातचीत नहीं करते हैं। इसलिए, इनपुट परत में उनका कोई उपयोग नहीं हो सकता है। इस कारण से, एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन (एसीआर) युक्त वैकल्पिक बूलियन गेट डिजाइनों की जांच की गई है। एसीआरएस (डी) सीएएस प्रोटीन पर कार्य करते हैं औरउनके काम को रोकते हैं। इसलिए, वे CRISPR-(d) CAS सिस्टम की गतिविधि को संशोधित करने का एक साधन हैं। यह पेपर टाइप II Acrs और (d) Cas9 के बीच बातचीत का पूरी तरह से विश्लेषण करता है, साथ ही साथ टाइप V Acrs और (d) Cas12a में S. cerevisiae में। चूंकि एसीआरएस सीएएस प्रोटीन की तुलना में बहुत छोटे होते हैं, इसलिए एस्ट्रोजेन β-एस्ट्राडियोल के प्रति उत्तरदायी एक नॉट गेट मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर 9-एचबीडी (एचईआर) -से एसीआरआईआईए 4 के हार्मोन-बाइंडिंग डोमेन को फ्यूज करके बनाया गया था। इसके अलावा, गैलेक्टोज के साथ प्रेरण पर डीसीएएस 12 ए (-एडी) और एसीआरवीए को संवैधानिक रूप से व्यक्त करने वाले मुट्ठी भर हां और नॉट गेट्स महसूस किए गए थे। वर्तमान में, ये द्वार केवल अवधारणा के प्रमाण के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, वे खमीर कोशिकाओं में सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट के कम्प्यूटेशनल स्वचालित डिजाइन को पूरा करने के लिए एल्गोरिदम के गहरे पुनर्विचार की दिशा में पहले कदम का भी प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Protocol

1. एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट का डिजाइन और निर्माण

नोट: दो प्रकार के एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट हैं: एक-नामित एसएनआर 5210-आरएनए पोलीमरेज़ III-निर्भर एसएनआर 52 प्रमोटर, एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अनुक्रम और एसयूपी 4 टर्मिनेटर से बना है; आरजीआर11 के रूप में संक्षिप्त एक और-आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय-निर्भर एडीएच 1 प्रमोटर, आरजीआर (राइबोजाइम-गाइड आरएनए-राइबोजाइम) संरचना होती है जिसमें दो राइबोजाइम (एक हैमरहेड राइबोजाइम-एचएच, और एक हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस राइबोजाइम-एचडीवी) और एसजीआरएनए / सीआरआरएनए का अनुक्रम होता है। कैस 9 होमोलॉग का मार्गदर्शन करने वाले एसजीआरएनए एक स्पेसर अनुक्रम और विशेषता प्रत्यक्ष दोहराव 12 से बने होते हैं, जबकि कैस12 ए प्रोटीन के लिए सीआरआरएनए में स्पेसर अनुक्रम13,14 के बाद प्रत्यक्ष दोहराव शामिल होता है (इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी डीएनए अनुक्रमों के लिए पूरक तालिका 1 देखें)।

  1. Cas9/Cas12a-मध्यस्थ ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण के लिए स्पेसर अनुक्रम डिजाइन करें।
    1. बैक्टीरियल लेक्स ऑपरेटर अनुक्रम (जिसका नाम लेक्सॉप है) को लक्ष्य साइट 15,16 होने के लिए उपयोग करें और इसे सीवाईसी 1 प्रमोटर में डालें जो खमीर-वर्धित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईईजीएफपी)17 की अभिव्यक्ति को चलाता है। इसलिए, स्पेसर अनुक्रम को सम्मिलित लेक्सॉप द्वारा परिभाषित और पूरक किया जाता है।
  2. CRISPRDIRECT टूल18 के माध्यम से स्पेसर अनुक्रम की ऑर्थोगोनलता की जांच करें।
    1. टेक्स्ट फ़ील्ड में PAM अनुक्रम के साथ लेक्सॉप अनुक्रम पेस्ट करें, PAM अनुक्रम को dCas9 के लिए NRG और dCas12a के लिए TTTV के रूप में परिभाषित करें, और ड्रॉप-डाउन सूची से प्रजातियों को नवोदित खमीर (Saccharomyces cerevisiae) S288C जीनोम के रूप में निर्दिष्ट करें। डिजाइन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि 20mer + PAM में कोई मिलान लक्ष्य साइट नहीं है और न ही 12mer + PAM खोज में।
  3. एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण करें।
    1. मानक जैविक भागों के डीएनए अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए टचडाउन पीसीआर का उपयोग करें, जैसे प्रमोटर, कोडिंग अनुक्रम और टर्मिनेटर।
      1. एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें जिसमें शामिल हैं: डीएनए टेम्पलेट का 20-40 एनजी, 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर का 1 μL (यानी, ot25, sgRNA / crRNA अभिव्यक्ति प्लास्मिड निर्माण), 10 μM रिवर्स प्राइमर का 1 μL (यानी, ot26, sgRNA / crRNA अभिव्यक्ति प्लास्मिड निर्माण), 2.5 mM dNTP मिश्रण का 5 μL, डीएनए पोलीमरेज़ का 0.5 μL, डीएनए पोलीमरेज़ का 10 μL, डीएनए पोलीमरेज़ का 10 μL, और डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच2ओ) 50 μL की कुल मात्रा तक।
        नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची के लिए पूरक तालिका 2 देखें।
      2. थर्मोसाइकलर पर टचडाउन पीसीआर प्रोग्राम चलाएं:
        चरण 1: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस।
        10 चक्रों के साथ चरण 2: 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस और 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
        25 चक्रों के साथ चरण 3: 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड के लिए 59 डिग्री सेल्सियस और 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
        चरण 4: 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
        अंत में, अनुवर्ती प्रयोगों को शुरू करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
        नोट: चरण 2 में 68 डिग्री सेल्सियस और चरण 3 में 59 डिग्री सेल्सियस आगे और पीछे दोनों प्राइमरों के पिघलने के तापमान पर निर्भर करता है, जो प्राइमरों के विभिन्न जोड़े से भिन्न होता है। चरण 2 और 3 में 72 डिग्री सेल्सियस पर समय पीसीआर उत्पाद की लंबाई और डीएनए पोलीमरेज़ की गति से निर्धारित होता है।
    2. जेल वैद्युतकणसंचलन (100 वी, 30 मिनट) के माध्यम से पीसीआर उत्पादों को अलग करें। डीएनए जेल निष्कर्षण किट के माध्यम से अगारोस जेल से डीएनए अनुक्रमों को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: 500 एनटी से अधिक लंबे टुकड़ों के लिए 0.8% एगारोस जेल, 100 एनटी और 500 एनटी के बीच के टुकड़ों के लिए 1.5% एगरोज जेल और 100 एनटी से छोटे टुकड़ों के लिए 2% एगारोस जेल की आवश्यकता होती है।
    3. सीआरआरएनए को व्यक्त करने वाले टीयू को एक पीआरएसआईआई 404/424 शटल वेक्टर19 में डालें, जिसमें एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन और खमीर-चयन योग्य ऑक्सोट्रोफिक मार्कर जीन-टीआरपी 1 शामिल हैं।
      1. शटल वेक्टर को दो प्रतिबंध एंजाइमों एसएसीआई और एसीसी 65 आई के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं। शटल वेक्टर के 5 μg, एंजाइमों की अनुशंसित मात्रा, पाचन बफर (एंजाइम निर्देशों के अनुसार), और ddH2O को 30 μL की कुल मात्रा तक जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
      2. जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से शटल वेक्टर पाचन को सत्यापित करें (सबस्टेप 1.3.2 देखें)। फिर, 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर दो एंजाइमों को निष्क्रिय करें।
      3. शुद्ध पीसीआर उत्पादों को कट-ओपन शटल वेक्टर में डालने के लिए गिब्सन असेंबली विधि 20 का उपयोग करें, जिससे 1 घंटे के लिए50 डिग्री सेल्सियस पर इक्विमोलर डीएनए मिश्रण में प्रवेश किया जा सके।
      4. हीट शॉक ट्रांसफॉर्मेशन विधि21 के माध्यम से उपरोक्त गिब्सन प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ एस्चेरिचिया कोलाई डीएच 5 सक्षम कोशिकाओं को बदलें। परिवर्तित ई कोलाई कोशिकाओं को एम्पीसिलीन (0.1 ग्राम / एल) युक्त लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेटों पर स्थानांतरित करें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को रात भर बढ़ने दें।
      5. एलबी एगर प्लेट से चार कॉलोनियों को चुनें और उन्हें एम्पीसिलिन (0.1 ग्राम / एल) युक्त एलबी समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अलग से कल्चर करें। फिर, ई कोलाई कोशिकाओं22 से प्लास्मिड निकालने के लिए मिनी-तैयारी प्रक्रिया का उपयोग करें।
      6. सेंगर विधि23 के माध्यम से सम्मिलित प्रतिलेखन इकाई को अनुक्रमित करने और पुष्टि करने के लिए प्राइमर ot18 और ot19 (ऑलिगो अनुक्रमों के लिए पूरक तालिका 2 देखें) का उपयोग करें।
        नोट: बाद के प्रयोगों में, निर्मित और पुष्टि किए गए प्लास्मिड को पीईजी / एलआईएसी प्रोटोकॉल24 के माध्यम से खमीर जीनोम में डाला जाएगा।

2. पाड़ आरएनए अभिव्यक्ति कैसेट का डिजाइन और निर्माण

नोट: पाड़ गाइड आरएनए (एससीआरएनए) एसजीआरएनए अनुक्रम और एमएस 2 हेयरपिन संरचनाओं25 से बना है। इस काम में दो प्रकार के एमएस 2 हेयरपिन संरचनाओं का उपयोग किया जाता है: जंगली प्रकार एमएस 2 हेयरपिन-डब्ल्यूटी, और एफ 6 एमएस 2 कोट प्रोटीन (एमसीपी) एपटामर-एफ 6।

  1. एक एससीआरएनए टेम्पलेट को संश्लेषित करें जो विभिन्न स्पेसर अनुक्रमों (यानी, पीएसएनआर 52-स्पेसर_DR (SpCas9)-2×MS2 (wt +f6)-SUP4t) को समायोजित करने में सक्षम है।
    नोट: इस अध्ययन में, एससीआरएनए टेम्पलेट को एक जीन संश्लेषण कंपनी द्वारा संश्लेषित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. आवश्यक स्पेसर अनुक्रमों पर पीसीआर चलाने के लिए उचित प्राइमर ( पूरक तालिका 2 देखें) डिजाइन करें।
  3. एक एससीआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट बनाने के लिए चरण 1.3 में प्रक्रियाओं का पालन करें।

3. dSpCas9 इंजीनियरिंग और अभिव्यक्ति प्लास्मिड निर्माण।

  1. प्लास्मिड pTPGI_dSpCas9_VP64 प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि (चरण 1.3 देखें) के माध्यम से पीआरएसआईआई 406 शटल वेक्टर के आधार पर स्वीकर्ता वेक्टर पीआरएसआईआई 406-पीजीपीडी-एटीजी-एक्सबीएआई-एक्सएचओआई-सीवाईसी 1 टी का निर्माण करें। प्लास्मिड एक मजबूत संवैधानिक प्रमोटर-पीजीपीडी और एक टर्मिनेटर-सीवाईसी 1 टी प्रदान करता है।
  3. pTPGI_dCas9_VP64 प्लास्मिड और नवनिर्मित स्वीकर्ता वेक्टर (1 घंटे के लिए 5 μg या रात भर के लिए 10 μg को पचाएं- संदर्भ के रूप में चरण 1.3.3.1 देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर Xbai और XHOI के साथ। चरण 1.3.2 के रूप में सम्मिलित टुकड़े और स्वीकर्ता वेक्टर को अलग और शुद्ध करें।
  4. शुद्ध सम्मिलित टुकड़े और स्वीकर्ता वेक्टर को 8 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर टी 4 डीएनए लिगेज के साथ मिलाएं। शुद्ध स्वीकर्ता वेक्टर के 50-100 एनजी, स्वीकर्ता वेक्टर के साथ सममोलर मात्रा में शुद्ध लक्ष्य टुकड़े, टी 4 बफर के 1.5 μL, T4 लिगेज के 0.5 μL, और 15 μL की कुल मात्रा तक ddH2O जोड़कर बंधाव समाधान तैयार करें।
  5. चरण 1.3.3.3 और 1.3.3.4 का पालन करें। फिर, पुष्टि करें कि नवनिर्मित प्लास्मिड एक्सबीएआई और एक्सहोल (37 डिग्री सेल्सियस, 1 एच) और जेल वैद्युतकणसंचलन (चरण 1.3.2 देखें) के साथ पाचन द्वारा सही है।

4. डीसीएएस 12 ए इंजीनियरिंग और प्लास्मिड निर्माण।

  1. डीसीएएस 12 ए-एडी को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड का निर्माण करें।
    1. दो खमीर कोडन-अनुकूलित dCas12a प्रोटीन (denAsCas12a और dLbCas12a) को BAMHI और Xhol प्रतिबंध एंजाइम साइटों से घिरा हुआ संश्लेषित करें।
      नोट: इस अध्ययन में, दो खमीर कोडन-अनुकूलित डीसीएएस 12 ए प्रोटीन को एक जीन संश्लेषण कंपनी द्वारा संश्लेषित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि (चरण 1.3 देखें) के माध्यम से स्वीकर्ता वेक्टर पीआरएसआईआई 406-प्रमोटर-एटीजी-एनएलएस-जीएस-एचआईएसटैग-जीएस-बीएएमएचआई-एसपी-एक्सएचओआई-एडी-एनएलएस-टीएए-एमटीजीयूओ 1 का निर्माण करें, जहां "प्रमोटर" या तो पीजीपीडी या पीजीएएल 1 है, "एसपी" एक संक्षिप्त यादृच्छिक अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है, और "एडी" या तो वीपीआर या वीपी 64 है।
    3. प्रत्येक डीसीएएस 12 ए प्रोटीन को बीएएमएचआई और एक्सएचओआई के साथ पाचन के माध्यम से दो नवनिर्मित स्वीकर्ता वैक्टर में डालें और टी 4 डीएनए लिगेज के साथ बंधाव करें (चरण 3.3 और 3.4 देखें)।
  2. एक नंगे डीसीएएस 12 ए को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड का निर्माण करें।
    1. टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि का उपयोग करके pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HISTAG-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t के रूप में dCas12a के गैलेक्टोज-इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति कैसेट के लिए एक स्वीकर्ता वेक्टर का निर्माण करें (चरण 1.3 देखें)।
    2. डीकैस 12 ए प्रोटीन वाले प्लास्मिड और बीएएमएचआई और एक्सहोल के साथ उपरोक्त स्वीकर्ता वेक्टर को पचाएं, फिर उन्हें प्लास्मिड पीआरएसआईआई 406-पीजीएएल 1-एसीसी 651-एटीजी-एनएलएस-जीएस-एचआईएसटैग-जीएस-बीएएमएचआई-डीसीएएस 12 ए-एक्सएचओआई-जीएस-एनएलएस-टीएए-सीवाईसी 1 टी (चरण 3.3 और 3.4 देखें) प्राप्त करने के लिए टी 4 डीएनए लिगेज के साथ मिलाएं।
    3. चरण 4.2.2 में प्राप्त प्लास्मिड को Acc65I और BAMHI के साथ पचाएं, और फिर pGAL1 को Touchdown PCR और गिब्सन असेंबली विधि के माध्यम से pGPD के साथ प्रतिस्थापित करें ताकि PRSI406-pGPD-ATG-NLS-GS-HISTAG-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t का निर्माण किया जा सके।

5. एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन इंजीनियरिंग और प्लास्मिड निर्माण

नोट: तीन प्रकार के प्रमोटरों को एसीआरएस अभिव्यक्ति को चलाने के लिए नियोजित किया गया है: एक इंड्यूसेबल प्रमोटर-पीजीएएल 1, चार खमीर संवैधानिक प्रमोटर-पीजीपीडी, पीएसीटी 1, पीटीईएफ 1, और पीटीईएफ 2, और एक सिंथेटिक संवैधानिक प्रमोटर-genCYC1t_pCYC1noTATA26।

  1. जीन संश्लेषण कंपनी से टाइप II Acrs (ACRIA2, ACRIA427, और ACRIA5 28) और प्रकार V-A Acrs (ACRVA1, ACRVA4, और ACRVA529) के अनुक्रम ों वाले प्लास्मिड प्राप्त करें।
  2. एसीआर को व्यक्त करने के लिए पीआरएसआईआई 403 शटल वेक्टर के आधार पर प्लास्मिड का निर्माण करें।
    1. ACRIA अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण।
      नोट: चार अलग-अलग प्रमोटरों (यानी, पीजीपीडी, पीएसीटी 1, पीटीईएफ 2, और genCYC1t_pCYC1noTATA), तीन प्रकार के एसीआरआईआईए, और दो टर्मिनेटर (एडीएच 1 टी और सीवाईसी 1 टी) को बढ़ाने के लिए टचडाउन पीसीआर का उपयोग करें। गिब्सन असेंबली विधि के माध्यम से , विभिन्न प्रमोटरों के तहत एसीआरआईए को व्यक्त करने वाले टीयू की एक श्रृंखला बनाएं (चरण 1.3 देखें)।
    2. एसीआरवीए अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण।
      1. स्वीकर्ता अनुक्रम को संश्लेषित करें: एटीजी-फ्लैगटैग-जीएस-बीएएमएचआई-एसपी-एक्सएचओआई-एनएलएस-जीएस-एनएलएस-एनएलएस-टीएए-टीसिंथ 6, जहां "एसपी" एक यादृच्छिक अनुक्रम है जिसे बाद में एसीआरवीए द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा।
        नोट: इस अध्ययन में, स्वीकर्ता अनुक्रमों को एक जीन संश्लेषण कंपनी (सामग्री की तालिका) द्वारा संश्लेषित किया गया था।
      2. स्वीकर्ता वैक्टर pRSII403-प्रमोटर-ATG-FLAGtag-GS-Bamhi-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6 को इकट्ठा करें, जहां "प्रमोटर" है: pGAL1, pTEF1, और genCYC1t_pCYC1noTATA। गिब्सन असेंबली विधि का उपयोग करें (चरण 1.3 देखें)।
      3. एसीआरवीए का उत्पादन करने वाले प्लास्मिड का एक सेट बनाने के लिए चरण 5.2.2.2 (टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि [चरण 1.3 देखें] के माध्यम से) में वर्णित स्वीकर्ता वेक्टर में से प्रत्येक को डालें।
  3. जीएस लिंकर और एचबीडी (एचईआर) के अनुक्रमों के साथ अपने अनुक्रम का विस्तार करके एसीआरआईआईए 4 को इंजीनियर करें। यह एक β-एस्ट्राडियोल-उत्तरदायी सर्किट के निर्माण की अनुमति देता है।
    1. GS-HBD और ACRIA4 भागों को अलग से प्राप्त करने के लिए टचडाउन पीसीआर का उपयोग करें (चरण 1.3.1 देखें)।
    2. एसीआरआईआईए 4, जीएस-एचबीडी और शटल वेक्टर को गिब्सन मिश्रण में डालें और गिब्सन विधि के माध्यम से पूर्ण प्लास्मिड का निर्माण करें (चरण 1.3.3 देखें)।

6. सीआरआरएनए डिटेक्शन: आरटी-क्यूपीसीआर और प्राइमरों का डिजाइन

नोट: सीआरआरएनए का पता लगाने को आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जिसे तीन चरणों में आयोजित किया जाता है।

  1. आरएनए किट के माध्यम से खमीर कोशिकाओं से आरएनए निष्कर्षण और शुद्धिकरण करें।
    1. 24-वेल प्लेट (240 आरपीएम, 30 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके सिंथेटिक परिभाषित पूर्ण माध्यम (एसडीसी, 1 एल मात्रा: 20 ग्राम ग्लूकोज, 2 ग्राम एए मिश्रण, 6.7 ग्राम वाईएनबी, 396 मिलीग्राम ल्यूसीन, 79.2 मिलीग्राम ट्रिप्टोफैन, 79.2 मिलीग्राम हिस्टिडाइन और 79.2 मिलीग्राम यूरैसिल) में रात भर खमीर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    2. सुबह में, सेल कल्चर (1:100) को 2 एमएल ताजा एसडीसी में पतला करें और खमीर कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस, 240 आरपीएम पर बढ़ते रहें, एक और 4 घंटे के लिए।
    3. सेल समाधान के पूरे 2 एमएल की कटाई करें और 2 मिनट के लिए 20,238 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से निकालें क्योंकि सेल गोली छोटी है।
    4. आरएनए किट का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं से आरएनए निकालें।
    5. आरएनए गुणवत्ता की जांच करें।
      1. 1% एगारोस जेल तैयार करें। प्रत्येक आरएनए नमूने के 5 μL को 1 μL डीएनए लोडिंग डाई के साथ मिलाएं। फिर मिश्रण को जेल पर लोड करें और इसे चलाएं।
      2. सुनिश्चित करें कि ~ 4,000 एनटी और ~ 2,000 एनटी पर दो स्पष्ट बैंड, राइबोसोमल आरएनए (25 एस / 18 एस) के अनुरूप, जेल पर मौजूद हैं। टीआरएनए के लिए ~ 80 एनटी पर एक और धुंधला बैंड देखा जा सकता है।
    6. सीडीएनए संश्लेषण के लिए तुरंत आरएनए नमूने का उपयोग करें या उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन: सीआरआरएनए (40 एनटी) के अनुरूप सीडीएनए का पहला स्ट्रैंड बनाने के लिए स्टेम-लूप विधि30 का उपयोग करें। एसजीआरएनए (लगभग 100 एनटी) के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए, प्रक्रिया संदर्भ जीन एसीटी 1 के सीडीएनए संश्लेषण के समान है।
    नोट: सीआरआरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की विधि एसजीआरएनए और एसीटी 1 एमआरएनए के साथ उपयोग की जाने वाली विधि से अलग है। चूंकि सीआरआरएनए बहुत छोटा है, इसलिए इसे एक माइक्रोआरएनए के रूप में माना जाता था और संबंधित सीडीएनए प्राप्त करने के लिए माइक्रोआरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन विधि (स्टेम-लूप दृष्टिकोण) का उपयोग किया जाता था। दो सीडीएनए संश्लेषण किट (सीआरआरएनए के लिए एक स्टेम-लूप किट और एसीटी 1 जीन के लिए एक सामान्य रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट) का उपयोग सीआरआरएनए परिमाणीकरण में किया गया था। प्रयोग के परिणामों को तुलनीय बनाने के लिए दो किटों (सामग्री की तालिका देखें) में आरएनए की समान मात्रा का उपयोग किया गया था। स्टेम-लूप किट के साथ उपयोग किए जाने वाले प्राइमर को स्टेम-लूप अनुक्रम और सीआरआरएनए के 3 'अंत में अंतिम छह न्यूक्लियोटाइड के अनुसार डिज़ाइन किया गया था (स्टेम-लूप और प्राइमर अनुक्रम के लिए, पूरक तालिका 2 देखें)।
    1. सीआरआरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए स्टेम-लूप विधि
      1. आरएनए टेम्पलेट, प्राइमर और बफर को फ्रीजर से बाहर निकालें और उन्हें बर्फ पर पिघलने दें।
      2. जीनोमिक डीएनए हटाने: सबसे पहले, किट निर्देशों के अनुसार प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μL तैयार करें। मिश्रण को 2 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइकलर में रखें। अंत में, इसे बर्फ पर स्थानांतरित करें।
      3. पहले सीडीएनए स्ट्रैंड का संश्लेषण: चरण 6.2.1.2 से मिश्रण के 10 μL, स्टेम-लूप प्राइमर के 1 μL (2 μM एकाग्रता), 10x RT प्रतिक्रिया बफर के 2 μL, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन एंजाइम मिश्रण के 2 μL (रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज युक्त), और 5 μL RNase-मुक्त H2O जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण का 20 μL तैयार करें।
      4. प्रतिक्रिया मिश्रण को थर्मल साइकलर में रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस। क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के लिए उत्पाद का तुरंत उपयोग करें या इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एसजीआरएनए और एसीटी 1 एमआरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन।
      1. पहली प्रतिक्रिया: किट निर्देशों के अनुसार, प्राइमर मिक्स, डीएनटीपी मिक्स, आरएनए टेम्पलेट (50 पीजी -5 μg), और RNase-मुक्त पानी (आरएनए टेम्पलेट के अलावा, सभी किट द्वारा प्रदान किए गए) से युक्त 13 μL मिश्रण तैयार करें। आरएनए टेम्पलेट के 1 μg का उपयोग करें। मिश्रण को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइकलर में डालें।
      2. दूसरी प्रतिक्रिया (cDNA संश्लेषण): अभिकर्मकों (किट निर्देशों में वर्णित के रूप में) को पहले प्रतिक्रिया समाधान के 13 μL में 20 μL की अंतिम मात्रा तक जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। मिश्रण को थर्मल साइक्लर में 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए और फिर 85 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 5 मिनट के लिए रखें। क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के लिए उत्पाद का तुरंत उपयोग करें या इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. क्यूपीसीआर के लिए एसवाईबीआर किट: सीटी वैल्यू डिटेक्शन
    नोट: सीआरआरएनए के क्यूपीसीआर में उपयोग किया जाने वाला रिवर्स प्राइमर तय किया गया है क्योंकि यह स्टेम-लूप अनुक्रम के रिवर्स पूरक से मेल खाता है ( पूरक तालिका 2 देखें)। फॉरवर्ड प्राइमर, इसके विपरीत, परिवर्तनशील है और सीआरएनए के अनुक्रम पर निर्भर करता है। एसजीआरएनए और एसीटी 1 एमआरएनए क्यूपीसीआर के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ पर डिजाइन किए गए हैं। दो प्राइमरों का चयन तब किया जाता है जब उनके पिघलने के तापमान के बीच का अंतर 2 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होता है ( पूरक तालिका 2 देखें)। प्रत्येक नमूने को तीन प्रतिकृतियों में मापा जाता है।
    1. एसवाईबीआर किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
    2. एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन में निम्न QPCR प्रोग्राम सेट करें।
      प्रीइन्क्यूबेशन: 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
      पीसीआर चरण: 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, इसके बाद 55 डिग्री सेल्सियस पर 34 सेकंड। पीसीआर चरण के चक्र को 45 बार सेट करें। पिघलने का चरण: 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड, इसके बाद 65 डिग्री सेल्सियस पर 60 एस, और अंत में 97 डिग्री सेल्सियस पर 1 एस।
    3. Pfaffl सूत्र31 के माध्यम से सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति मूल्यों की गणना करें।

7. कैस प्रोटीन का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: कैस प्रोटीन (सीएएसपी) एक His_tag से जुड़े होते हैं।

  1. खमीर सेल की तैयारी
    1. एक बाँझ लूप का उपयोग करके कुछ खमीर कोशिकाओं को चुनें और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर 240 आरपीएम पर रात भर वाईपीडी समृद्ध माध्यम के 5 मिलीलीटर में कल्चर करें। सुबह में, 20 एमएल ताजा वाईपीडी में सेल समाधान के 500 μL जोड़ें और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर 240 आरपीएम पर तब तक बढ़ाएं जब तक कि OD600 0.6 तक न पहुंच जाए।
    2. संस्कृति का 5 एमएल लें और इसे 37% फॉर्मलाडेहाइड के 500 μL के साथ मिलाएं। मिश्रण को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर रहने दें। 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई करें।
    3. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1 एमएल निर्धारण बफर (0.1 एम केएच 2 पीओ4, 0.5 एम एमजीसीएल2, 3.7% फॉर्मलाडेहाइड, पीएच = 6.5) के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल समाधान को 20 मिनट के लिए आरटी पर रखें।
    4. 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेल समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 1 मिलीलीटर वॉशिंग बफर (0.1 एम केएच 2 पीओ 4,1.2एम सोर्बिटोल, पीएच = 6.5) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, जो बीटा-मर्कैप्टोइथेनॉल के 4 μL और लाइसेट समाधान के4 μL (5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक है। सेल समाधान को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    5. 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेल समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 1 एमएल पीबीएस के साथ सेल गोली को दो बार धोएं (5 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम )।
    6. पीबीएस प्लस 0.05% ट्वीन 20 के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और 4 μL बीएसए समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। सेल समाधान को 20 मिनट के लिए आरटी पर रखें।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. 1:400 कमजोर पड़ने पर चरण 7.1.6 में मिश्रण में एंटी-हिज टैग प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। समाधान को 2 घंटे के लिए आरटी पर रखें।
    2. 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर चरण 7.2.1 में मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। सेल गोली को धोने के लिए 5 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएसटी और सेंट्रीफ्यूज (1,500 x ग्राम) जोड़ें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं। अंत में, सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और 1x PBST के 100 μL में कोशिकाओं को निलंबित करें।
  3. माइक्रोस्कोपी सेल का पता लगाना
    1. कोशिकाओं को स्लाइड पर माउंट करें; चरण 7.2.2 से सेल समाधान का 2 μL लें और इसे ग्लास स्लाइड पर रखें। इसे कवरस्लिप से कवर करें।
    2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर चालू करें। फ्लोरोसेंट लाइट स्रोत संख्या लिखें और कंप्यूटर पर माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें।
    3. स्लाइड को माइक्रोस्कोप मंच पर रखें। 40x उद्देश्य लेंस चुनें और हरी रोशनी (550 nm) के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। मोटे फोकस नॉब को तब तक हिलाएं जब तक कि खमीर कोशिकाओं की समोच्च दिखाई न दे। कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए ठीक फोकस नॉब को स्थानांतरित करें।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ कोशिकाओं का पता लगाएं। माइक्रोस्कोप फ़ील्ड ऑफ़ व्यू बंद करें और कंप्यूटर स्क्रीन पर स्विच करें। लाइव पर क्लिक करें, 3-5 सेकंड तक प्रतीक्षा करें, और तस्वीर लेने के लिए कैप्चर पर क्लिक करें। चित्र सहेजें.
    5. कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट लाइट स्रोत को बंद करें।

8. डेटा अधिग्रहण: एफएसीएस

नोट: ग्रीन फ्लोरेसेंस का पता फ्लो साइटोमेट्री (यानी, फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग [एफएसीएस] माप) के माध्यम से लगाया जाता है। खमीर कोशिकाओं को सामान्य रूप से, 30 डिग्री सेल्सियस और 240 आरपीएम पर एफएसीएस प्रयोगों को चलाने के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। हालांकि, कोशिकाएं अपनी आनुवंशिक सामग्री के आधार पर कुछ सावधानियों की मांग कर सकती हैं। जिन कोशिकाओं में डीसीएएस 12 ए-वीपीआर जीन ( जीपीडी संवैधानिक प्रमोटर द्वारा नियंत्रित) होता है, उन्हें एसडीसी समाधान में 24 घंटे तक उगाया जाना चाहिए। बाद में, कोशिकाओं को ताजा एसडीसी में 1: 100 के अनुपात में पतला किया जाता है और प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने से पहले 12 घंटे तक उगाया जाता है। एसीआरआईआईए 4-एचबीडी (एचईआर) जीन के साथ संशोधित कोशिकाएं भी कमजोर पड़ने की मांग करती हैं। इसके अलावा, OD600 को नियंत्रित करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, कोशिकाओं को रात भर (14 घंटे से अधिक) एसडीसी में बढ़ने की अनुमति दी जाती है। सुबह में, OD600 मापा जाता है। फिर संस्कृति को एसडीसी में पतला किया जाता है, जिसे β-एस्ट्राडियोल की विविध एकाग्रता के साथ आपूर्ति की जाती है, ओडी600 = 0.1 तक। एफएसीएस प्रयोगों से पहले, कोशिकाओं को एक और 7 घंटे के लिए उगाया जाता है जैसे कि ओडी600 0.8-1.0 तक पहुंच जाता है। डीसीएएस 9-वीपी 64 या डीसीएएस 12 ए-वीपी 64 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को एफएसीएस मशीन पर माप से पहले कमजोर पड़ने और आगे की वृद्धि के बिना एसडीसी में 20-24 घंटे तक उगाया जाता है।

  1. लेजर को गर्म करने के लिए माप से 20 मिनट पहले एफएसीएस मशीन पर स्विच करें।
  2. नमूने तैयार करें (कमजोर पड़ना): 20 μL सेल कल्चर को 300 μL ddH2O के साथ मिलाएं।
  3. FACS मशीन से कनेक्ट कंप्यूटर पर FACS सॉफ़्टवेयर चलाएँ और एक नया प्रयोग बनाएँ। माप पैरामीटर सेट करें (यानी, एफएससी (एसएससी)-ए / एच / डब्ल्यू और हिस्टोग्राम)।
  4. नमूने के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुसार फ़िल्टर का चयन करें। उदाहरण के लिए, यहां लक्ष्य प्रोटीन वाईईजीएफपी है, जिसकी उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 488 एनएम और 507 एनएम हैं। तो, एफआईटीसी या जीएफपी फिल्टर का चयन करें (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 488 एनएम; उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 527/32 एनएम)। अधिग्रहण सेल नंबर 10,000 पर सेट करें।
  5. फ्लोरोसेंट मोतियों की तीव्रता को मापकर एफआईटीसी फिल्टर वोल्टेज को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि लगातार दो प्रयोगों के बीच मोतियों की तीव्रता में सापेक्ष अंतर 5% से अधिक नहीं है।
  6. किसी भी संभावित अतिरिक्त मोतियों को हटाने के लिए कुछ सेकंड के लिए डीडीएच2ओ के साथ मशीन को धो लें।
  7. नमूना प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें। पूर्वावलोकन पर क्लिक करें और नमूना इंजेक्शन स्थिरता के लिए 3-5 सेकंड तक प्रतीक्षा करें। अंत में, अधिग्रहण पर क्लिक करें।
  8. प्रयोग के अंत में मोतियों को फिर से मापें। वोल्टेज वह है जिसका उपयोग प्रारंभिक मोतियों के माप के दौरान किया गया था (चरण 8.4, 438-441 वी देखें)। जांचें कि क्या दो मोतियों के माप के बीच सापेक्ष अंतर 5% से अधिक है।
  9. FACS डेटा को FCS फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।
  10. आर स्टूडियो सॉफ्टवेयर के साथ एफसीएस फ़ाइलों का विश्लेषण करें।

9. डेटा विश्लेषण

नोट: आर स्टूडियो के भीतर फ्लोकोर आर बायोकंडक्टर पैकेज32 का उपयोग करें। एफसीएस फाइलों का विश्लेषण आर भाषा में लिखी गई एक स्क्रिप्ट का उपयोग करके किया गया था।

  1. आर स्टूडियो खोलें और स्क्रिप्ट Bdverse विश्लेषण लोड करें। एफसीएस फाइलों का विश्लेषण करने के लिए आर।
  2. प्रयोग नाम (ename), निर्देशिका (पथ) सेट करें जहाँ FCS फ़ाइलें हैं
    संग्रहीत (dir_d), और जहां परिणाम फ़ाइलें बनाई जाएंगी (dir_r).
  3. प्रतिदीप्ति चैनल सेट करें। उदाहरण के लिए, select_ch = "जीपीए-ए" यदि हरे रंग की प्रतिदीप्ति को मापा गया था।
  4. मापा गया नमूनों की संख्या सेट करें (s_num).
  5. प्रत्येक डॉट प्लॉट (sxlim, sylim) के आयाम सेट करें। बार प्लॉट और बॉक्स प्लॉट (xlimit, ylimit) के लिए x और y अक्ष की अधिकतम लंबाई सेट करें। xlimit s_num से अधिक या बराबर होना चाहिए.
  6. संबंधित लाइनों से # को हटाकर गेटिंग विधि चुनें।
    नोट: मॉर्फगेट स्क्रिप्ट द्वारा की गई एक स्वचालित गेटिंग विधि है (यानी, डॉट प्लॉट का क्षेत्र जहां कोशिकाएं सघन होती हैं, प्रोग्राम द्वारा पहचाना और चुना जाता है)। बहुभुज गेट और आयताकारगेट डॉट भूखंडों को देखने और या तो बहुभुज के शीर्ष या एक आयत के किनारे को परिभाषित करने की मांग करते हैं जो उस क्षेत्र को गले लगाता है जहां अधिकांश कोशिकाएं स्थित हैं।
  7. चुनी हुई गेटिंग विधि के अनुरूप फ़्लोसेट ऑब्जेक्ट गेटेड का चयन करें। डॉट प्लॉट रिज़ॉल्यूशन का चयन करें (आरईएस; कम से कम 256 के बराबर होना चाहिए)।
  8. उन मापों को हटाने के लिए flt_low <- filter_low (एसपी) अनकमेंट करें जहां प्रतिदीप्ति नकारात्मक है। अन्य प्रयोगों के कारण आउटलायर्स को हटाने के लिए flt_sp <- फ़िल्टर (flt_lw) अनकमेंट्स।
  9. स्रोत दबाएँ और स्क्रिप्ट चलाएँ। विश्लेषण से परिणामों वाली सभी फाइलें dir_r में बनाई जाती हैं।

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Representative Results

आरएनए पोलीमरेज़ III-प्रकार प्रमोटर द्वारा एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति
सबसे पहले, इस काम ने चित्रा 1 ए में दिखाए गए ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण सर्किट (सर्किट 1) की इंजीनियरिंग को संबोधित किया। इसमें तीन बुनियादी घटक शामिल थे: 1) वाईईजीएफपी (रिपोर्टर) के लिए जीन एन्कोडिंग, जो विभिन्न सिंथेटिक प्रमोटरों की एक श्रृंखला से पहले था जो डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-एडी के लिए लक्ष्य साइट प्रदान करते थे; 2) dCas9 या dCas12a का एक खमीर कोडन-अनुकूलित संस्करण एक सक्रियण डोमेन (VP64 और VPR, क्रमशः) से जुड़ा हुआ है और इसमें एक या दो परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम (NLS) शामिल हैं। दोनों डीसीएएस प्रोटीन एक मजबूत संवैधानिक प्रमोटर-पीजीपीडी द्वारा उत्पादित किए गए थे; और 3) एक एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अनुक्रम जो डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-एडी को लक्षित साइटों पर निर्देशित करता है। dCas9 / dCas12a-आधारित सक्रियकर्ताओं की सक्रियण दक्षता की कल्पना की गई और रिपोर्टर की प्रतिदीप्ति तीव्रता (FACS प्रयोगों के माध्यम से मापा गया) द्वारा परिलक्षित किया गया।

एक dCas9 प्रोटीन (dSpCas9) और दो dCas12a प्रोटीन (denAsCas12a और dLbCas12a) का परीक्षण किया गया। VP64 AD के साथ अपने C टर्मिनस पर dspcas9 विस्तारित के साथ 3.36 गुना सक्रियण हासिल किया गया था और YEGFP के सिंथेटिक प्रमोटर-अपस्ट्रीम को बाध्य किया गया था- जिसमें लेक्सऑप लक्ष्य साइट की छह प्रतियां थीं। एसजीआरएनए को एक एकीकृत शटल वेक्टर में रखा गया था और आरएनए पोलीमरेज़ III-निर्भर एसएनआर 52 प्रमोटर (एसएनआर 52 आई कॉन्फ़िगरेशन, चित्रा 1 बी देखें) द्वारा स्थानांतरित किया गया था। dCas12a के मामले में, denAsCas12a-VPR ने तीन ऑपरेटरों के साथ सिंथेटिक प्रमोटर से उच्चतम सक्रियण (4.45 गुना) लौटाया जब CRRNA को SNR52i कॉन्फ़िगरेशन (चित्रा 1C) के माध्यम से व्यक्त किया गया था। उसी परिस्थितियों में, डीएलबीकैस 12 ए-वीपीआर ने अपनी सर्वश्रेष्ठ प्रतिदीप्ति वृद्धि (3.21 गुना) हासिल की (चित्रा 1 डी)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि तुलना शब्द, हर प्रयोग में, एक सर्किट था जिसका एसजीआरएनए / सीआरआरएनए लेक्स ऑपरेटरों को बांध नहीं सकता था।

मल्टीकॉपी प्लास्मिड आवश्यक नहीं हैं
एसएनआर 52 आई एसजीआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट को एक मामूली मजबूत प्रमोटर-पीएडीएच 1 द्वारा व्यक्त आरजीआर संरचना के साथ बदल दिया गया था। हालांकि, डीसीएएस 9 और डीसीएएस 12 ए दोनों मामलों में, आरजीआर के स्व-दरार द्वारा उत्पन्न एसजीआरएनए / सीआरआरएनए की उपस्थिति में सक्रियण एसएनआर 52 आई के माध्यम से उत्पादित एसजीआरएनए / सीआरआरएनए के साथ प्राप्त की तुलना में या उससे भी कम दिखाई दिया, इस तथ्य के बावजूद कि पीएसएनआर 52 को एक कमजोर प्रमोटर माना गया था (डीसीएएस 12 ए के साथ प्राप्त पहले परिणामों के लिए चित्रा 1 सी, डी देखें)।

एसजीआरएनए/सीआरआरएनए राशि और सक्रियण दक्षता के बीच संबंध का पता लगाने के लिए, दो एसजीआरएनए/सीआरआरएनए अभिव्यक्ति प्रणालियों को एक एपिसोमल प्लास्मिड में डाला गया, जिसे सेल द्वारा 10-40 प्रतियों में लिया जा सकता है और एसजीआरएनए / सीआरएनए की अधिक मात्रा उत्पन्न की जा सकती है। जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है, एक एकीकृत प्लास्मिड (या तो एसएनआर 52 आई या आरजीआरआई) पर स्थित सीआरआरएनए द्वारा सक्रियण 1.4- से 2.4 गुना अधिक था जब एक ही सीआरआरएनए को एपिसोमल प्लास्मिड (या तो एसएनआर 52 एम या आरजीआरएम) द्वारा व्यक्त किया गया था। एसजीआरएनए द्वारा प्रवृत्ति की पुष्टि की गई थी। इस मामले में, एकीकृत प्लास्मिड ने 1.1- से 1.5 गुना अधिक सक्रियण की गारंटी दी (चित्रा 2 बी)। यह बाहर करने के लिए कि परिणाम एपिसोमल प्लास्मिड के नुकसान के कारण हुए थे, आरटी-क्यूपीसीआर को विवो में एसजीआरएनए / सीआरआरएनए सापेक्ष बहुतायत को निर्धारित करने के लिए किया गया था। चित्रा 2 सी, डी में परिणामों ने सत्यापित किया कि एपिसोमल वेक्टर ने एकीकृत वेक्टर की तुलना में एसजीआरएनए / सीआरआरएनए के बहुत अधिक स्तर का उत्पादन किया, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि अभिव्यक्ति प्रणाली (आरजीआर या एसएनआर 52)। इन परिणामों से पता चला कि एसएनआर 52 प्रणाली आरजीआर प्रणाली से भी बेहतर काम कर सकती है, और सेल में एसजीआरएनए / सीआरआरएनए की अधिक मात्रा सीआरआईएसपीआर-सीएएस प्रणाली द्वारा उच्च सक्रियण की गारंटी नहीं देती है। इसलिए, एपिसोमल प्लास्मिड को जीन डिजिटल सर्किट के निर्माण में नियोजित नहीं किया जाना चाहिए जहां dCas9 / dCas12a-AD का उपयोग किया जाता है।

मचान आरएनए इंजीनियरिंग
एक एससीआरएनए को एमएस 2 हेयरपिन संरचनाओं के साथ एसजीआरएनए के अनुक्रम का विस्तार करके इंजीनियर किया गया था जो एमएस 2 कोट प्रोटीन (एमसीपी, चित्रा 3 ए देखें) से जुड़े होने पर वीपी 64 एडी को भर्ती करने की अनुमति देता था। इस तरह, डीसीएएस 9 की कोई इंजीनियरिंग या संशोधन आवश्यक नहीं थे। दो एमएस 2 वेरिएंट की कोशिश की गई: डब्ल्यूटी और एफ 6। एकल एमएस 2 हेयरपिन -1 × एमएस 2 (डब्ल्यूटी) और 1× एमएस 2 (एफ 6) युक्त एससीआरएनए ने क्रमशः 5.27 गुना और 4.34 गुना सक्रियण दिया। हालांकि, दो हेयरपिन -2 × एमएस 2 (डब्ल्यूटी + एफ 6) के संयोजन के साथ एससीआरएनए ने इस अध्ययन में समग्र उच्चतम सक्रियण लौटाया (7.54 गुना, चित्रा 3 बी देखें)। इन परिणामों से पता चला कि एक एससीआरएनए इंजीनियरिंग किसी भी सक्रियण डोमेन को सीधे dsCapas9 में फ्यूज करने की तुलना में कहीं अधिक प्रभावी थी।

बूलियन गेट एसीआर प्रोटीन पर आधारित है।
CRISPR-CAS सिस्टम द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को और नियंत्रित करने और ट्यून करने के लिए, सर्किट 1 को एंटी-CRISPR प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए चौथे टीयू के सम्मिलन के साथ संशोधित किया गया था (देखें ACRIAs के लिए चित्रा 4A और ACRVA के लिए चित्रा 5A देखें)। यह दिखाने के बाद कि एसीआरएस प्रभावी थे, एस सेरेविसिया में, डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-एडी के कारण सक्रियण के विपरीत, डीसीएएस 12 ए-आधारित रिप्रेसर्स पर एसीआरवीए कार्रवाई का परीक्षण करने के लिए एक नया सर्किट बनाया गया था ( चित्रा 5 डी देखें) (पिछले काम33 ने पहले ही दिखाया था कि एसीआरआईए डीसीएएस डीकैस 9-आधारित जीन डाउन-रेगुलेशन को रोक सकता है)। नए, एसीआर युक्त छोटे नेटवर्क ने सरल बूलियन गेट्स (हां और नहीं) के रूप में काम किया, जिससे अधिक जटिल सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट की इनपुट परत का पुनर्नवीनीकरण हो सकता है।

AcrIIA4 dSpCas9 का एक मजबूत अवरोधक है
तीन प्रकार के एसीआरआईआईए2, एसीआरआईआईए4 और एसीआरआईआईए5 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए विविध शक्तियों वाले चार अलग-अलग प्रमोटरों का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि तीन एसीआरआई ने एस सेरेविसिया में खुराक-निर्भर तरीके से काम किया। जब एक मजबूत प्रमोटर-पीजीपीडी द्वारा व्यक्त किया जाता है- तो उन्होंने dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt +f6)-MCP-VP64 द्वारा प्राप्त प्रतिदीप्ति स्तर को क्रमशः इसके मूल्य के 0.21, 0.11 और 0.13 तक कम कर दिया (चित्रा 4बी)। चूंकि ACRIA4 एकमात्र ऐसा था जो एक कमजोर, सिंथेटिक प्रमोटर-genCYC1t_pCYC1noTATA द्वारा उत्पादित होने पर भी प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति के उच्च निषेध का कारण बना- हम यह अनुमान लगा सकते हैं कि ACRIA4 तीन ACRIs के बीच सबसे मजबूत अवरोधक था। इसके बाद, एचबीडी (ईआर) को β-एस्ट्राडियोल सेंसिंग डिवाइस बनाने के लिए एसीआरआईआईए 4 के सी टर्मिनस से जोड़ा गया था ( चित्रा 4 सी देखें)। एस्ट्रोजेन β-एस्ट्राडियोल की उपस्थिति में, एसीआरआईआईए 4-एचबीडी (ईआर) नाभिक में स्थानांतरित हो सकता है और फिर डीएसपीसीएएस 9-आधारित उत्प्रेरक के कार्य को बेअसर कर सकता है। चित्रा 4 डी में अनुमापन वक्र से पता चलता है कि सर्किट 2.3 के करीब आने वाले ऑन/ऑफ अनुपात के साथ नॉट गेट की तरह व्यवहार करता है।

एसीआरवीए डीसीएएस 12 ए प्रोटीन के दमनकारी हैं।
सर्किट 1 में पीजीएएल 1-ड्राइविंग एसीआरवीए अभिव्यक्ति कैसेट डालकर एक नॉट गेट डिजाइन और बनाया गया था। इस तरह, एसीआरवीए संश्लेषण, और डीसीएएस 12 ए-एडी के परिणामस्वरूप दमन, गैलेक्टोज (चित्रा 5 ए) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 5 बी, सी में दिखाया गया है, एसीआरवीए 1 ने सर्किट योजना के आधार पर प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति को 19% से 71% तक कम करके सक्रियकर्ताओं के रूप में डेनएएससीएएस 12 ए और डीएलबीकैस 12 ए दोनों को बाधित किया। AcrVA4 और ACRVA5 denAsCas12a34 पर कोई कार्रवाई नहीं कर सकते हैं। हालांकि, उन्होंने 84% (ACRVA5) और 82% (ACRVA4) तक प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति को कम करके dLbCas12a-आधारित सक्रियकर्ताओं का एक मजबूत निषेध किया। कुल मिलाकर, AcrVA5 इन तीन ACRVA में सबसे विश्वसनीय साबित हुआ, dLbCas12a-आधारित सक्रियकर्ताओं को रोकने में क्योंकि यह विभिन्न सर्किटों में, 70% से अधिक दमन की गारंटी देता है।

ACRVA1 कार्रवाई एकाग्रता-निर्भर है
विवो एकाग्रता में एसीआरवीए और डेनएएस / डीएलबीसीएएस 12 ए के आधार पर सक्रियकर्ताओं और दमनकारियों दोनों पर उनके निरोधात्मक प्रभावों के बीच संबंध का भी अध्ययन किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, प्रत्येक एसीआरवीए को अलग-अलग प्रमोटरों के तहत व्यक्त किया गया था: मजबूत पीजीएएल 1, मध्यम शक्ति पीटीईएफ 1, और कमजोर genCYC1t_pCYC1noTATA। जैसा कि चित्रा 5 ई में दिखाया गया है, एसीआरवीए 1 ने अपने संश्लेषण का नेतृत्व करने वाले प्रमोटर के आधार पर अपने प्रदर्शन में बड़े उतार-चढ़ाव प्रदर्शित किए। ACRVA1 ने केवल PGAL1 द्वारा उत्पादित होने पर काफी अच्छी तरह से काम किया। पीटीईएफ 1 और genCYC1t_pCYC1noTATA के तहत, एसीआरवीए 1 ने केवल नंगे डीएलबीकैस 12 ए पर कुछ दमन दिखाया। इसके विपरीत, AcrVA4 और ACRVA5, उनकी एकाग्रता के प्रति कम संवेदनशील दिखाई देते हैं, खासकर जब नंगे dLbCas12a के साथ बातचीत करते हैं।

इस डेटा से पता चला है कि AcrVA4 और ACRVA5 ने आम तौर पर S. Cerevisiae में dLbCas12a-आधारित प्रतिलेखन कारकों को रोकने में ACRVA1 से बेहतर प्रदर्शन किया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि AcrVA5 में एक अजीब कार्य तंत्र है, क्योंकि यह एक एंजाइम के रूप में कार्य करता है जो LbCas12a को स्थायी रूप से संशोधित करता है। हालांकि, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, AcrVA5 (AcrVA4 के साथ) denAsCas12a के साथ बातचीत नहीं कर सकता है।

जब ACRVAs को pGAL1 के तहत व्यक्त किया गया था, तो सर्किट या तो YES गेट बन जाते हैं (dCas12a को AD से जोड़ा गया था) या गेट नहीं (नंगे dCas12a)। पूर्व सभी अत्यधिक प्रदर्शन करने वाला दिखता था, जबकि बाद वाला एसीआरवीए 4 या एसीआरवीए 5 की उपस्थिति में बेहतर काम करता दिखाई दिया।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण dCas9 / dCas12a-AD द्वारा मध्यस्थ। (ए) सर्किट 1 आरेख। वाईईजीएफपी के सिंथेटिक प्रमोटरों में क्रमशः डीसीएएस 9 या डीसीएएस 12 ए के लिए लक्ष्य साइटों की छह (6x) और तीन (3x) प्रतियां थीं। उसके बाद, dCas9/dCas12a-AD sgRNA/crRNA के साथ गठबंधन करता है; सक्रियण डोमेन की उपस्थिति के कारण सिंथेटिक प्रमोटर को लक्षित और सक्रिय किया जाता है। (बी) डीएसपीसीएएस 9-वीपी 64 की सबसे अच्छी सक्रियण दक्षता तब हासिल की गई थी जब सिंथेटिक प्रमोटर पर छह लेक्सॉप लक्ष्य साइटें थीं, और एसजीआरएनए को एसएनआर 52 आई द्वारा स्थानांतरित किया गया था। (C, D) डीसीएएस 12 ए-वीपीआर की उच्चतम सक्रियण दक्षता तब प्राप्त की गई थी जब लेक्सॉप की तीन प्रतियां सिंथेटिक प्रमोटर में डाली गई थीं, और सीआरआरएनए एसएनआर 52 आई द्वारा उत्पन्न किया गया था। एसएनआर 52 आई का मतलब है कि एसजीआरएनए / सीआरआरएनए पीएसएनआर 52 द्वारा निर्मित किया गया था, और अभिव्यक्ति कैसेट को एक एकीकृत शटल वेक्टर के अंदर रखा गया था। आरजीआरआई का अर्थ है एक एकीकृत प्लास्मिड जो एसजीआरएनए / सीआरआरएनए को व्यक्त करने के लिए आरजीआर कैसेट की मेजबानी करता है। नकारात्मक नियंत्रण, "-", एक एसजीआरएनए / सीआरआरएनए का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें एक स्क्रैम्बल्ड स्पेसर अनुक्रम होता है जो लेक्सोप साइट के साथ मेल नहीं खाता है और न ही खमीर जीनोम के साथ किसी भी अनुक्रम के साथ। "बीए" इंगित करता है कि एसजीआरएनए / सीआरआरएनए लक्ष्य डीएनए के एंटीसेंस स्ट्रैंड को बांधता है, जबकि "बीएस" सेंस स्ट्रैंड को बांधने के लिए खड़ा है। प्रत्येक प्रतिदीप्ति स्तर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (यानी, अलग-अलग दिनों में किए गए) से औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य का मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एकीकृत और एपिसोमल प्लास्मिड-उत्पादक एसजीआरएनए / सीआरएनए की तुलना। (ए) वाईईजीएफपी के प्रमोटर अपस्ट्रीम पर एकल साइट को लक्षित करते समय डीएलबीकैस 12 ए-वीपीआर: सीआरआरएनए की सक्रियण दक्षता। (बी) dSpCas9-VP64: sgRNA सक्रिय n× सिंथेटिक प्रमोटर ("n" लेक्सऑप लक्ष्य साइटों की संख्या के लिए खड़ा है)। (C, D) सामान्यीकृत एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति स्तर15,16। "आई" का अर्थ है कि एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट को एक एकीकृत शटल वेक्टर में रखा गया था, जबकि "एम" का अर्थ मल्टीकॉपी (यानी, एपिसोमल) प्लास्मिड है। "बीए"/"बीएस" इंगित करता है कि एसजीआरएनए / सीआरआरएनए डीएनए के एंटीसेंस / सेंस स्ट्रैंड को बांधता है। "सीटीआरएल" एक नकारात्मक नियंत्रण है, जहां एक स्क्रैम्बल्ड एसजीआरएनए / सीआरआरएनए व्यक्त किया गया था। प्रत्येक प्रतिदीप्ति स्तर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (यानी, अलग-अलग दिनों में किए गए) से औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य का मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक scRNA के साथ जटिल में नंगे dSpCas9 की सक्रियण दक्षता। (A) scRNA, MCP-VP64, और नंगे dSpCas9 16 के बीच अंतःक्रियाओं का योजनाबद्ध आरेख। बैंगनी रंग में टोपी जैसी संरचना एमसीपी (एमएस 2 कोट प्रोटीन) का प्रतिनिधित्व करती है। एक एमएस 2 हेयरपिन (एससीआरएनए में बैंगनी संरचना) एमसीपी की दो प्रतियों को भर्ती और बांध सकता है। इस प्रकार, एक एससीआरएनए न केवल डीएसपीसीएएस 9 द्वारा डीएनए-बाइंडिंग को सक्षम बनाता है, बल्कि एमसीपी-वीपी 64 की भर्ती के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के सक्रियण को भी सक्षम करता है। (बी) डीएसपीसीएएस 9: एससीआरएनए-एमसीपी-वीपी 64 की सक्रियण दक्षता। तीन प्रकार के एससीआरएनए का परीक्षण किया गया: एक जंगली-प्रकार एमएस 2 हेयरपिन -1×एमएस 2 (डब्ल्यूटी) ले गया, दूसरा एफ 6 एमसीपी एपटामर -1×एमएस 2 (एफ 6) के साथ इंजीनियर किया गया, और अंतिम में हेयरपिन -2×एमएस 2 (डब्ल्यूटी + एफ 6) दोनों शामिल थे, जो सबसे अधिक प्रदर्शन करने वाला निकला। प्रत्येक प्रतिदीप्ति स्तर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (यानी, अलग-अलग दिनों में किए गए) से औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य का मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसीआरआईआईए से संबंधित सर्किट और परिणाम । (ए) एसीआरआईआईए अभिव्यक्ति कैसेट सर्किट 1 में डाला गया था। इस अतिरिक्त टीयू में पीजीपीडी शामिल है जो डीएसपीसीएएस 9: scRNA_2×एमएस 2 (डब्ल्यूटी + एफ 6) -एमसीपी-वीपी 64 का मुकाबला करने के लिए एसीआरआईए की अभिव्यक्ति का नेतृत्व करता है। (बी) चित्रा 3 बी में सर्वश्रेष्ठ डीएसपीसीएएस 9-आधारित एक्टिवेटर पर एसीआरआईए की निषेध दक्षता। ब्लैक डैश्ड लाइन डीएसपीसीएएस 9-आधारित एक्टिवेटर की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करती है। प्रत्येक कॉलम के ऊपर के आंकड़े ऑफ/ओएन अनुपात के रूप में गणना की गई निषेध दक्षता दिखाते हैं (यानी, किसी भी एसीआरआईआईए की अनुपस्थिति में प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजित एसीआरआईआईए की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति स्तर)। किंवदंती में, चार संवैधानिक प्रमोटरों की ताकत धीरे-धीरे ऊपर से नीचे तक बढ़ जाती है। (सी) एसीआरआईआईए 4-एचबीडी (एचईआर) को व्यक्त करने वाले β-एस्ट्राडियोल सेंसिंग डिवाइस (नॉट गेट) का आरेख। (डी) सर्किट का अनुमापन वक्र (सी) 16 में। हरा वक्र कार्यात्मक सर्किट में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को संदर्भित करता है। काला वक्र एसीआरआईआईए 4-एचबीडी (एचईआर) की अभिव्यक्ति के बिना तनाव से लिया गया था - नकारात्मक नियंत्रण। ग्रे रंग में धराशायी रेखा ने संतुलन पर प्रतिदीप्ति पठार को चिह्नित किया। इसकी गणना β-एस्ट्राडियोल की सांद्रता पर प्रतिदीप्ति मूल्यों के औसत के रूप में की गई थी, जो 125 एनएम से कम नहीं थी। प्रत्येक प्रतिदीप्ति स्तर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (यानी, अलग-अलग दिनों में किए गए) से औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य का मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एसीआरवीए से संबंधित सर्किट और परिणाम । (ए) एसीआरवीए अभिव्यक्ति कैसेट सर्किट 1 में डाला गया था। नए टीयू में एसीआरवीए जीन के अपस्ट्रीम इंड्यूसेबल प्रमोटर पीजीएएल 1 शामिल हैं जो डीसीएएस 12 ए-एडी के काम को बेअसर करते हैं। नया सर्किट गैलेक्टोज द्वारा विनियमित एक नॉट गेट है। (बी, सी) (ए) में गैलेक्टोज-उत्तरदायी नॉट गेट के परिणाम। यहां, पीजीएएल 1 एसीआरवीए के संश्लेषण को चलाता है, जो तब डीसीएएस 12 ए-एडी15 के साथ बातचीत करता है। सापेक्ष प्रतिदीप्ति ऑफ / ऑन अनुपात से मेल खाती है। (डी) गैलेक्टोज-उत्तरदायी यस गेट। यह पीजीएएल 1 और नंगे डीसीएएस 12 एएस के नियंत्रण में एसीआरवीए को नियोजित करता है जो वाईईजीएफपी के संश्लेषण को दबाता है। (ङ)विभिन्न संख्या ओं के प्रवर्तकों द्वारा व्यक्त की गई एसीआरवीए की अवरोध क्षमता ओं की तुलना। समूह "दमन पर एसीआरवी प्रभाव" और "नंगे डीएलबी" सर्किट को (डी) में संदर्भित करते हैं। समूह "सक्रियण पर एसीआरवी प्रभाव" और "डीएलबी-वीपीआर" (ए) में नॉट गेट के परिणाम हैं। प्रत्येक प्रतिदीप्ति स्तर कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (यानी, अलग-अलग दिनों में किए गए) से औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य का मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी डीएनए अनुक्रमों की एक सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की एक सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फाइलें: एफसीएस फाइलों का विश्लेषण करने के लिए आर स्टूडियो स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल ने "डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न" (डीबीटीएल) जैविक इंजीनियरिंग चक्र और ड्राई-लैब और वेट-लैब प्रयोगों दोनों के संबंध में सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट के लिए एक संभावित पूर्ण वर्कफ़्लो दिखाया। यहां, हमने CRISPR-Cas प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया, मुख्य रूप से dsCapas9, denAsCas12a, dLbCas12a, और संबंधित एंटी-CRISPR प्रोटीन, S. Cerevisiae छोटे ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क में डिजाइन और निर्माण करके। उनमें से कुछ ने बूलियन गेट्स की नकल की, जो डिजिटल सर्किट के मूल घटक हैं। यहां वर्णित सभी सर्किटों ने हमें एस सेरेविसिया में सीआरआईएसपीआर से जुड़े और एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन के गुणों और विशेषताओं को चित्रित करने की अनुमति दी। जीन डिजिटल सर्किट की योजना में इन प्रोटीनों को शामिल करने के लिए ये परिणाम आवश्यक हैं।

डीबीटीएल अवधारणा सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक रूपरेखा प्रदान करती है, जबकि एक नई कलाकृति का परीक्षण करने के बाद कई अनुकूलन और सुधार किए जाएंगे। उदाहरण के लिए, सर्किट 1 में, शुरू में वाईईजीएफपी के सिंथेटिक प्रमोटर अपस्ट्रीम पर डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-एडी के लिए केवल एक लक्ष्य साइट (लेक्सओपी की एक प्रति) थी। उस सर्किट कॉन्फ़िगरेशन का परीक्षण करने के बाद, हमने पाया कि यह15,16 से अधिक सक्रियण प्राप्त नहीं कर सकता है। फिर, हमने माना कि लेक्सॉप की प्रतियों की संख्या में वृद्धि करके, जैसा कि7 में है, हम एक उच्च ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण तक पहुंच सकते हैं। दरअसल, तीन से छह लेक्सॉप साइटों (चित्रा 1) का उपयोग करके एक उच्च प्रतिदीप्ति स्तर प्राप्त किया गया था। इसके अलावा, हमने एक एससीआरएनए को इंजीनियरिंग करके डीएसपीसीएएस 9 की मेजबानी करने वाले सर्किट के प्रदर्शन में और सुधार किया, जो एक या अधिक एडी को डीएसपीसीएएस 9 (चित्रा 3) जैसे बड़े प्रोटीन में फ्यूज करने से आसान है। इसके अतिरिक्त, हमारे द्वारा चुने गए तीन एसीआरआईआईए का उत्पादन करने के लिए विभिन्न शक्तियों के प्रमोटर का उपयोग करके, हमने निष्कर्ष निकाला कि एसीआरआईए 4 उनमें से सबसे मजबूत अवरोधक था। इस प्रकार, हमने एचबीडी (ईआर) को एसीआरआईए 4 में फ्यूज करके और हमारे सर्वश्रेष्ठ डीएसपीसीएएस 9-आधारित एक्टिवेटर (चित्रा 4) पर एसीआरआईए 4 के मजबूत दमन का फायदा उठाकर β-एस्ट्राडियोल के लिए उत्तरदायी एक नया नॉट गेट बनाया।

इसी तरह, हमने खमीर में डेनएस्कास 12 ए और डीएलबीकैस 12 ए के काम और तीन एसीआरवीए के साथ उनकी बातचीत दोनों को गहराई से चित्रित किया (चित्रा 5)। प्रत्येक dCas12a-AcrVA जोड़ी के लिए, हमने एक NOT (dCas12a को एक AD से जोड़ा गया था) और गैलेक्टोज के लिए उत्तरदायी एक YES (नंगे dCas12a) गेट बनाया। कुल मिलाकर, DLbCas12a, AcrVA5 के साथ मिलकर, सरल तर्क कार्यों की गणना करने के लिए सबसे अच्छी प्रणाली का परिणाम है।

यहां वर्णित विधि ने कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत किए। सभी प्रोटीन डीएनए अनुक्रमों को एस सेरेविसिया में उच्च अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए खमीर कोडन-अनुकूलित किया गया था। S. cerevisiae जीनोम में dsCapas9/denAsCas12a/dLbCas12a के विशिष्ट लक्ष्यों से बचने के लिए, हमने लेक्सओपी जैसे एक जीवाणु ऑपरेटर का चयन किया। इसके अलावा, जीएएल 1 प्रमोटर वाले उपभेदों ने एक महत्वपूर्ण वृद्धि देरी दिखाई जो सिंथेटिक जीन सर्किट15 के लिए पीजीएएल 1 की प्रयोज्यता को सीमित कर सकती है।

समग्र विधि में कुछ चरणों में कुछ संशोधन भी लाए जा सकते हैं। पाचन-बंधाव प्रक्रिया की दक्षता में सुधार करने के लिए, 1 घंटे में केवल 5 μg के बजाय सम्मिलित प्लास्मिड और स्वीकर्ता वैक्टर दोनों के 10 μg (रात भर) को पचाना बेहतर होता है। इस तरह, क्षालन चरण के बाद एक उच्च डीएनए एकाग्रता तक पहुंच जाती है। टी 4-लिगेशन के लिए समय 1 घंटे (निर्माता के प्रोटोकॉल) से 8 घंटे तक बढ़ाया जाना चाहिए। अंत में, डीसीएएस 12 ए-वीपीआर संलयन प्रोटीन वाले उपभेदों को 24 घंटे की संस्कृति के बाद पतला किया जाना चाहिए और एफएसीएस प्रयोग चलाने से पहले 12 घंटे तक उगाया जाना चाहिए। इस स्थिति के तहत, विभिन्न कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति स्तरों के बीच परिवर्तनशीलता अब बहुत अधिक नहीं है, और एक स्वीकार्य मानक विचलन एक सेल आबादी पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के औसत मूल्य के साथ होता है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल ने बताया कि डीसीएएस प्रोटीन और संभवतः, एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन का उपयोग करके जीन डिजिटल सर्किट के डिजाइन को कैसे सरल बनाया जाए। इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमने विस्तार से दिखाया कि प्रोटीन के ये परिवार एस सेरेविसिया में कैसे काम करते हैं और उनमें से कौन सा डिजिटल नेटवर्क के अंदर भविष्य के उपयोग के लिए सबसे आशाजनक है। एक अनसुलझी समस्या CRISPR-dCas / एंटी-CRISPR सिस्टम और रसायनों का युग्मन है, जो सर्किट इनपुट का प्रतिनिधित्व करते हैं और सीधे DCAS प्रोटीन या एंटी-CRISPR को बांध नहीं सकते हैं। यहां, हमने या तो इंड्यूसेबल जीएएल 1 प्रमोटर या एसीआरआईआईए 4 से जुड़े एचबीडी (ईआर) का उपयोग करके समस्या को दरकिनार कर दिया। हालांकि, सर्किट इनपुट परत की वास्तुकला को सामान्य बनाने का एक तरीका विभिन्न बायोइंजीनियरिंग क्षेत्रों जैसे चयापचय इंजीनियरिंग, बायोसिंथेसिस, बायोसेंसिंग, बायोडायग्नोस्टिक्स और बायोरेमेडिएशन के लिए सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट को डिजाइन करने के लिए आवश्यक है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम सिंथेटिक जीवविज्ञान प्रयोगशाला-एसपीएसटी, टीजेयू-के सभी छात्रों को उनकी सामान्य मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही एफएसीएस प्रयोगों में उनकी सहायता के लिए झी ली और जियांगयांग झांग के साथ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

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References

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रिट्रेक्शन इश्यू 188 सीआरआईएसपीआर-कैस सिस्टम डीएसपीसीएएस 9 डेनएएससीएएस 12 ए डीएलबीकैस 12 ए टाइप II-ए एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन टाइप वी-ए एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन जीन डिजिटल सर्किट सैकरोमाइसेस सेरेविसिया सिंथेटिक जीव विज्ञान।
CRISPR-CAS सिस्टम और एंटी-CRISPR प्रोटीन पर आधारित जीन डिजिटल सर्किट
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Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

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