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Bioengineering

Circuits numériques géniques basés sur des systèmes CRISPR-CAS et des protéines anti-CRISPR

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

Les systèmes CRISPR-Cas et les protéines anti-CRISPR ont été intégrés dans le schéma des portes booléennes chez Saccharomyces cerevisiae. Les nouveaux petits circuits logiques ont montré de bonnes performances et approfondi la compréhension des facteurs de transcription basés sur dCas9 / dCas12a et des propriétés des protéines anti-CRISPR.

Abstract

Les portes booléennes géniques synthétiques et les circuits numériques ont un large éventail d’applications, du diagnostic médical à la protection de l’environnement. La découverte des systèmes CRISPR-Cas et de leurs inhibiteurs naturels, les protéines anti-CRISPR (Acrs), fournit un nouvel outil pour concevoir et mettre en œuvre des circuits numériques géniques in vivo . Ici, nous décrivons un protocole qui suit l’idée du cycle de génie biologique « Design-Build-Test-Learn » et utilise dCas9 / dCas12a avec leurs Acrs correspondants pour établir de petits réseaux transcriptionnels, dont certains se comportent comme des portes booléennes, chez Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats soulignent les propriétés de dCas9/dCas12a comme facteurs de transcription. En particulier, pour obtenir une activation maximale de l’expression génique, dSpCas9 doit interagir avec un ARN d’échafaudage modifié qui collecte plusieurs copies du domaine d’activation (AD) VP64. En revanche, dCas12a doit être fusionné, à l’extrémité C, avec le puissant VP64-p65-Rta (VPR) AD. De plus, l’activité des deux protéines Cas n’est pas améliorée par l’augmentation de la quantité d’ARNg / ARNcr dans la cellule. Cet article explique également comment construire des portes booléennes basées sur l’interaction CRISPR-dCas-Acr. Le domaine de liaison hormonale fusionné AcrIIA4 du récepteur humain des œstrogènes est le cœur d’une porte NOT sensible au β-estradiol, tandis que les AcrVAs synthétisés par le promoteur GAL1 inductible permettent d’imiter les portes YES et NOT avec le galactose comme entrée. Dans ces derniers circuits, AcrVA5, avec dLbCas12a, a montré le meilleur comportement logique.

Introduction

En 2011, des chercheurs ont proposé une méthode de calcul et développé un logiciel correspondant pour la conception automatique de circuits génétiques synthétiques numériques1. Un utilisateur devait spécifier le nombre d’entrées (trois ou quatre) et remplir la table de vérité du circuit; Cela a fourni toutes les informations nécessaires pour dériver la structure du circuit en utilisant des techniques de l’électronique. La table de vérité a été traduite en deux formules booléennes via la méthode2 de la carte de Karnaugh. Chaque formule booléenne est constituée de clauses qui décrivent des opérations logiques (somme ou multiplication) entre (partie de) les entrées du circuit et leurs négations (les littéraux). Les clauses, à leur tour, sont soit additionnées (OR) ou multipliées (ET) pour calculer la sortie du circuit. Chaque circuit peut être réalisé selon l’une de ses deux formules correspondantes : l’une écrite sous forme POS (produit des sommes) et l’autre en SOP (somme des produits). Le premier consiste en une multiplication de clauses (c’est-à-dire des portes booléennes) qui contiennent une somme logique des littéraux. Ce dernier, en revanche, est une somme de clauses où les littéraux sont multipliés.

Les circuits électriques peuvent être réalisés, sur une planche à pain, en câblant physiquement différentes portes ensemble. Le courant électrique permet l’échange de signaux entre les portes, ce qui conduit au calcul de la sortie.

En biologie, la situation est plus complexe. Une porte booléenne peut être réalisée comme une unité de transcription (TU; c’est-à-dire la séquence « promoteur-codant région-terminateur » à l’intérieur des cellules eucaryotes), où la transcription ou la traduction (ou les deux) sont régulées. Ainsi, au moins deux sortes de molécules établissent un câblage biologique : les protéines du facteur de transcription et les ARN antisens non codants1.

Un circuit numérique génétique est organisé en deux ou trois couches de portes, à savoir: 1) la couche d’entrée, qui est faite de portes YES (tampon) et NOT et convertit les produits chimiques d’entrée en molécules de câblage; 2) la couche interne, qui se compose d’autant de TU qu’il y a de clauses dans la formule booléenne correspondante. Si le circuit est conçu selon la formule SOP, chaque clause de la couche interne produira la sortie du circuit (par exemple, la fluorescence) dans une architecture dite de sortie distribuée. Si la formule du produit de somme (POS) est utilisée, alors une couche finale 3) est nécessaire, qui contiendra une seule porte multiplicative collectant les molécules de câblage de la couche interne.

Dans l’ensemble, en biologie synthétique, de nombreux schémas différents peuvent être conçus pour le même circuit. Ils diffèrent par le nombre et le type de TU et de molécules de câblage. Afin de choisir la solution la plus simple à mettre en œuvre dans les cellules de levure, chaque conception de circuit est associée à un score de complexité S, défini par

Equation 1

où A représente le nombre d’activateurs, R représente le nombre de répresseurs et a est la quantité de molécules d’ARN antisens. Si les activateurs ou les répresseurs sont absents du circuit, leur contribution à S est nulle. Par conséquent, il est plus difficile de réaliser un schéma de circuit en laboratoire (S élevé) lorsqu’il nécessite un nombre élevé de facteurs de transcription orthogonaux. Cela signifie que de nouveaux activateurs et répresseurs doivent être conçus de novo afin de réaliser le câblage complet à l’intérieur des circuits numériques. En principe, de nouvelles protéines de liaison à l’ADN peuvent être assemblées en utilisant les protéines Zinc Finger3 et les effecteurs TAL4 comme modèles. Cependant, cette option semble trop ardue et prend trop de temps; par conséquent, il faut s’appuyer principalement sur les petits ARN et la régulation de la traduction pour finaliser des circuits génétiques complexes.

À l’origine, cette méthode a été développée pour fabriquer des circuits numériques dans des bactéries. En effet, dans les cellules eucaryotes, au lieu d’ARN antisens, il est plus approprié de parler de microARN (miARN) ou de petits ARN interférents (siRNAs)5. Cependant, la voie ARNi n’est pas présente dans la levure S. cerevisiae. Par conséquent, il faut opter pour des réseaux entièrement transcriptionnels. Supposons qu’un circuit ait besoin de cinq activateurs et de cinq répresseurs; son score de complexité serait S = 32. La complexité du circuit peut être réduite en remplaçant les 10 facteurs de transcription par un seul dCas96 (Cas9 déficient en nucléase) fusionné à un domaine d’activation (AD). Comme le montrele point 7, dCas9-AD fonctionne comme un répresseur dans la levure lors de la liaison d’un promoteur entre la boîte TATA et le TSS (site de début de transcription) et comme activateur lors de la liaison bien en amont de la boîte TATA. Ainsi, on peut remplacer 10 facteurs de transcription par une seule protéine de fusion dCas9-AD et 10 sgRNA (ARN guides uniques) pour un score de complexité totale de S = 11. Il est rapide et facile de synthétiser dix ARNg, alors que, comme indiqué précédemment, l’assemblage de 10 protéines nécessiterait un travail beaucoup plus long et plus compliqué.

Alternativement, on peut utiliser deux protéines orthogonales dCas (par exemple, dCas9 et dCas12a): l’une pour fusionner avec une AD, et l’autre nue ou en combinaison avec un domaine de répression. Le score de complexité n’augmenterait que d’une unité (S = 12). Par conséquent, les systèmes CRISPR-dCas sont la clé de la construction de circuits numériques de gènes très complexes chez S. cerevisiae.

Cet article caractérise en profondeur l’efficacité des répresseurs et des activateurs à base de dCas9 et dCas12a chez la levure. Les résultats montrent qu’ils ne nécessitent pas une grande quantité d’ARNg pour optimiser leur activité, de sorte que les plasmides épisomiques sont préférentiellement évités. De plus, les activateurs basés sur dCas9 sont beaucoup plus efficaces lorsqu’ils utilisent un ARN d’échafaudage (scRNA) qui recrute des copies du VP64 AD. En revanche, dCas12a fonctionne bien lorsqu’il est fusionné directement avec le puissant VPR AD. De plus, un promoteur activé synthétique exige un nombre variable de sites cibles, en fonction de la configuration de l’activateur (par exemple, trois lors de l’utilisation de dCas12a-VPR, six pour dCas9-VP64 et un seul avec dCas9 et un scRNA). En tant que répresseur, dCas12a apparaît plus incisif lors de la liaison de la région de codage plutôt que du promoteur.

Cependant, CRISPR-dCas9 / dCas12a n’interagissent pas directement avec les produits chimiques. Par conséquent, ils peuvent ne pas être utiles dans la couche d’entrée. Pour cette raison, d’autres conceptions de portes booléennes contenant des protéines anti-CRISPR (Acrs) ont été étudiées. Les ACRS agissent sur les protéines (d)Cas et inhibent leur fonctionnement8. Par conséquent, ils sont un moyen de moduler l’activité des systèmes CRISPR-(d)Cas. Cet article analyse en profondeur les interactions entre les Acrs de type II et (d)Cas9, ainsi que les Acrs de type V et (d)Cas12a chez S. cerevisiae. Étant donné que les Acr sont beaucoup plus petits que les protéines Cas, une porte NOT sensible à l’œstrogène β-estradiol a été construite en fusionnant le domaine de liaison hormonale du récepteur humaindes œstrogènes 9-HBD(hER)-à AcrIIA4. En outre, une poignée de portes YES et NOT qui exprimaient dCas12a (-AD) de manière constitutive et AcrVAs lors de l’induction avec du galactose ont été réalisées. À l’heure actuelle, ces portes ne servent que de preuve de concept. Cependant, ils représentent également la première étape vers une refonte profonde de l’algorithme pour réaliser la conception automatique computationnelle de circuits numériques de gènes synthétiques dans les cellules de levure.

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Protocol

1. Conception et construction de la cassette d’expression sgRNA/ARNcr

NOTE: Il existe deux types de cassettes d’expression sgRNA/ARNcr : SNR5210-est composé du promoteur SNR52 dépendant de l’ARN polymérase III, de la séquence sgRNA/ARNcr et du terminateur SUP4 ; un autre, abrégé en RGR11, se compose du promoteur ADH1 dépendant de l’ARN polymérase II, de la structure RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) qui contient deux ribozymes (un ribozyme-HH à tête de marteau et un ribozyme-HDV du virus de l’hépatite delta) et la séquence de l’ARNg / ARNcr entre les deux, et le terminateur ADH1. Les homologues d’ARNg guidant Cas9 sont constitués d’une séquence d’espacement et de la répétition directe caractéristique12, tandis que l’ARNcr pour les protéines Cas12a comprend la répétition directe suivie de la séquence d’espacement13,14 (voir le tableau supplémentaire 1 pour toutes les séquences d’ADN utilisées dans cette étude).

  1. Concevoir la séquence d’espacement pour l’activation transcriptionnelle médiée par Cas9/Cas12a.
    1. Exploitez la séquence bactérienne de l’opérateur lex (appelée lexOp) pour en faire le site cible 15,16 et insérez-la dans le promoteur CYC1 qui entraîne l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée par la levure (yEGFP)17. Par conséquent, la séquence d’espacement est définie par et complémentaire du lexOp inséré.
  2. Vérifiez l’orthogonalité de la séquence d’espacement via l’outil CRISPRDIRECT18.
    1. Collez la séquence lexOp flanquée de la séquence PAM dans le champ de texte, définissez la séquence PAM comme NRG pour dCas9 et TTTV pour dCas12a, et spécifiez les espèces de la liste déroulante comme Levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Cliquez sur Conception. Assurez-vous qu’il n’y a pas de site cible correspondant dans 20mer + PAM ni dans la recherche 12mer + PAM.
  3. Construisez la cassette d’expression sgRNA/ARNcr.
    1. Utilisez la PCR d’atterrissage pour amplifier les séquences d’ADN de parties biologiques standard, telles que les promoteurs, les séquences codantes et les terminateurs.
      1. Préparer un mélange réactionnel contenant : 20 à 40 ng de matrice d’ADN, 1 μL d’amorce directe de 10 μM (c.-à-d. ot25, construction plasmidique d’expression sgRNA/ARNcr), 1 μL d’amorce inverse de 10 μM (c.-à-d. ot26, construction plasmidique d’expression sgRNA/ARNcr), 5 μL de mélange de dNTP 2,5 mM, 0,5 μL d’ADN polymérase, 10 μL de tampon réactionnel ADN polymérase 5x, et double eau distillée (ddH2O) jusqu’à un volume total de 50 μL.
        REMARQUE : Veuillez consulter le tableau supplémentaire 2 pour obtenir la liste des amorces utilisées dans la présente étude.
      2. Exécutez le programme de PCR d’atterrissage sur un thermocycleur :
        Étape 1: 98 °C pendant 30 s.
        Étape 2 avec 10 cycles : 98 °C pendant 10 s, 68 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 15 s.
        Étape 3 avec 25 cycles : 98 °C pendant 10 s, 59 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 15 s.
        Étape 4 : 72 °C pendant 2 min.
        Enfin, maintenir à 4 °C jusqu’au début des expériences de suivi.
        REMARQUE : Les 68 °C à l’étape 2 et les 59 °C à l’étape 3 dépendent des températures de fusion des amorces avant et inverse, variant d’une paire d’amorces différentes. Le temps à 72 °C dans les stades 2 et 3 est déterminé par la longueur du produit PCR et la vitesse de l’ADN polymérase.
    2. Isoler les produits PCR par électrophorèse sur gel (100 V, 30 min). Éluer les séquences d’ADN du gel d’agarose à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Un gel d’agarose à 0,8 % est requis pour les fragments de plus de 500 nt, un gel d’agarose à 1,5 % pour les fragments entre 100 nt et 500 nt, et un gel d’agarose à 2 % pour les fragments de moins de 100 nt.
    3. Insérez le TU exprimant l’ARNg/ARNcr dans un vecteur navette19 pRSII404/424, qui contient le gène de résistance à l’ampicilline et le gène marqueur auxotrophe sélectionnable par levure-TRP1.
      1. Digérer le vecteur navette à 37 °C pendant 1 h avec les deux enzymes de restriction SacI et Acc65I. Préparer le mélange réactionnel en ajoutant 5 μg du vecteur navette, les quantités recommandées d’enzymes, un tampon de digestion (selon les instructions enzymatiques) et duddH2Ojusqu’à un volume total de 30 μL.
      2. Vérifier la digestion du vecteur navette par électrophorèse sur gel (voir sous-étape 1.3.2). Ensuite, inactivez les deux enzymes à 65 °C pendant 20 min.
      3. Utiliser la méthode d’assemblageGibson 20 pour insérer les produits PCR purifiés dans le vecteur navette coupé-ouvert en laissant entrer le mélange d’ADN équimolaire à 50 °C pendant 1 h.
      4. Transformer les cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α avec le mélange réactionnel Gibson ci-dessus par la méthode de transformation par choc thermique21. Transférer les cellules E . coli transformées sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) contenant de l’ampicilline (0,1 g/L). Mettez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et laissez les cellules se développer pendant la nuit.
      5. Prélever quatre colonies dans la plaque de gélose LB et les cultiver séparément pendant la nuit à 37 °C dans une solution LB contenant de l’ampicilline (0,1 g/L). Ensuite, utilisez la procédure de mini-préparation pour extraire les plasmides des cellules E. coli22.
      6. Utilisez les amorces ot18 et ot19 (voir le tableau supplémentaire 2 pour les séquences oligo) pour séquencer et confirmer l’unité de transcription insérée via la méthode de Sanger23.
        REMARQUE: Dans des expériences ultérieures, les plasmides construits et confirmés seront insérés dans le génome de la levure via le protocole PEG / LiAc24.

2. Conception et construction de la cassette d’expression de l’ARN de l’échafaudage

NOTE: L’ARN guide de l’échafaudage (scRNA) est composé de la séquence sgRNA et des structures en épingle à cheveux MS225. Deux types de structures en épingle à cheveux MS2 sont utilisés dans ce travail : l’épingle à cheveux MS2 de type sauvage et l’aptamère f6 MS2 coat protein (MCP) f6.

  1. Synthétiser un modèle scRNA capable de s’adapter à différentes séquences d’espacement (c.-à-d. espaceur pSNR52_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    REMARQUE : Dans cette étude, le modèle d’ARNsc a été synthétisé par une société de synthèse génique (voir le tableau des matériaux).
  2. Concevoir des amorces appropriées (voir le tableau supplémentaire 2) pour exécuter la PCR sur les séquences d’espacement nécessaires.
  3. Suivez les procédures de l’étape 1.3 pour construire une cassette d’expression scRNA.

3. Ingénierie dSpCas9 et construction plasmidique d’expression

  1. Procurez-vous le plasmide pTPGI_dSpCas9_VP64 (voir Tableau des matériaux).
  2. Construire le vecteur accepteur pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basé sur le vecteur navette pRSII406, via la PCR tactile et la méthode d’assemblage Gibson (voir étape 1.3). Le plasmide fournit un puissant promoteur constitutif-pGPD, et un terminateur-CYC1t.
  3. Digérer le plasmide pTPGI_dCas9_VP64 et le vecteur accepteur nouvellement construit (5 μg pendant 1 h ou 10 μg pendant la nuit - voir l’étape 1.3.3.1 comme référence) avec XbaI et XhoI à 37 °C. Séparer et purifier le fragment d’insertion et le vecteur accepteur comme indiqué à l’étape 1.3.2.
  4. Litruer le fragment d’insert purifié et le vecteur accepteur avec l’ADN ligase T4 à 16 °C pendant 8 h. Préparer la solution de ligature en ajoutant 50-100 ng du vecteur accepteur purifié, des fragments cibles purifiés en quantité équimolaire avec le vecteur accepteur, 1,5 μL de tampon T4, 0,5 μL de T4 ligase etddH2Ojusqu’à un volume total de 15 μL.
  5. Suivez les étapes 1.3.3.3 et 1.3.3.4. Ensuite, confirmez que le plasmide nouvellement construit est correct par digestion avec XbaI et Xhol (37 °C, 1 h) et électrophorèse sur gel (voir étape 1.3.2).

4. dCas12a ingénierie et construction plasmidique

  1. Construire les plasmides exprimant dCas12a-AD.
    1. Synthétiser deux protéines dCas12a optimisées pour les codons de levure (denAsCas12a et dLbCas12a) flanquées de sites enzymatiques de restriction BamHI et Xhol.
      REMARQUE : Dans cette étude, les deux protéines dCas12a optimisées pour les codons de levure ont été synthétisées par une société de synthèse génique (voir le tableau des matériaux).
    2. Construisez le vecteur accepteur pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via la PCR tactile et la méthode d’assemblage de Gibson (voir étape 1.3), où le « promoteur » est pGPD ou pGAL1, « sp » représente une courte séquence aléatoire et « AD » est VPR ou VP64.
    3. Insérez chaque protéine dCas12a dans les deux vecteurs accepteurs nouvellement construits par digestion avec BamHI et XhoI et ligature avec T4 DNA ligase (voir étapes 3.3 et 3.4).
  2. Construire les plasmides exprimant un dCas12a nu.
    1. Construire un vecteur accepteur pour les cassettes d’expression inductibles par le galactose de dCas12a en tant que pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t en utilisant la PCR tactile et la méthode d’assemblage Gibson (voir étape 1.3).
    2. Digérer les plasmides contenant les protéines dCas12a et le vecteur accepteur ci-dessus avec BamHI et Xhol, puis les ligaturer avec l’ADN ligase T4 pour obtenir le plasmide pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (voir les étapes 3.3 et 3.4).
    3. Digérer le plasmide obtenu à l’étape 4.2.2 avec Acc65I et BamHI, puis remplacer pGAL1 par pGPD via la PCR tactile et la méthode d’assemblage Gibson pour construire pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Ingénierie des protéines anti-CRISPR et construction plasmidique

REMARQUE: Trois types de promoteurs ont été utilisés pour stimuler l’expression Acrs: un promoteur inductible-pGAL1, quatre promoteurs constitutifs de levure-pGPD, pACT1, pTEF1 et pTEF2, et un promoteur constitutif synthétique-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. Obtenir les plasmides contenant les séquences des Acrs de type II (AcrIIA2, AcrIIA427 et AcrIIA5 28) et des Acrs de type V-A (AcrVA1, AcrVA4 et AcrVA529) auprès d’une société de synthèse de gènes.
  2. Construisez les plasmides en fonction du vecteur navette pRSII403 pour exprimer Acrs.
    1. Construire des cassettes d’expression AcrIIA.
      REMARQUE: Utilisez la PCR d’atterrissage pour amplifier quatre promoteurs différents (c’est-à-dire pGPD, pACT1, pTEF2 et genCYC1t_pCYC1noTATA), les trois types d’AcrIIA et deux terminateurs (ADH1t et CYC1t). Construire une série d’UT exprimant des AcrIIA, sous différents promoteurs, via la méthode d’assemblage Gibson (voir étape 1.3).
    2. Construire des cassettes d’expression AcrVA.
      1. Synthétisez la séquence acceptrice : ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, où « sp » est une séquence aléatoire qui sera remplacée par AcrVAs plus tard.
        NOTE: Dans cette étude, les séquences acceptrices ont été synthétisées par une société de synthèse de gènes (Table of Materials).
      2. Assemblez les vecteurs accepteurs pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, où le « promoteur » est : pGAL1, pTEF1 et genCYC1t_pCYC1noTATA. Utilisez la méthode d’assemblage Gibson (reportez-vous à l’étape 1.3).
      3. Insérer chacune des trois AcrVA dans le vecteur accepteur décrit à l’étape 5.2.2.2 (via la PCR au toucher des roues et la méthode d’assemblage de Gibson [voir étape 1.3]) pour construire un ensemble de plasmides produisant des AcrVA.
  3. Poursuite de l’ingénierie AcrIIA4 en étendant sa séquence avec les séquences du linker GS et HBD(hER). Cela permet la construction d’un circuit sensible au β-estradiol.
    1. Utilisez la PCR tactile pour obtenir séparément les pièces GS-HBD et AcrIIA4 (voir étape 1.3.1).
    2. Introduire AcrIIA4, GS-HBD et le vecteur navette dans le mélange de Gibson et construire le plasmide complet par la méthode de Gibson (voir étape 1.3.3).

6. Détection de l’ARNcr : RT-qPCR et conception des amorces

REMARQUE: La détection de l’ARNcr a été réalisée via RT-qPCR, qui est organisée en trois étapes.

  1. Effectuer l’extraction et la purification de l’ARN des cellules de levure via un kit d’ARN.
    1. Culture de cellules de levure pendant une nuit dans 2 mL de milieu complet défini synthétique (SDC, volume de 1 L : 20 g de glucose, 2 g de mélange AA, 6,7 g de YNB, 396 mg de leucine, 79,2 mg de tryptophane, 79,2 mg d’histidine et 79,2 mg d’uracile) en utilisant une plaque de 24 puits (240 rpm, 30 °C).
    2. Le matin, diluez la culture cellulaire (1:100) dans 2 ml de SDC frais et continuez à faire pousser les cellules de levure à 30 °C, 240 rpm, pendant encore 4 h.
    3. Prélever la totalité des 2 mL de la solution cellulaire et centrifuger à 20 238 x g pendant 2 min. Retirez le surnageant avec précaution car la pastille de la cellule est petite.
    4. Extraire l’ARN des cellules de levure à l’aide d’un kit d’ARN.
    5. Vérifiez la qualité de l’ARN.
      1. Préparez un gel d’agarose à 1%. Mélanger 5 μL de chaque échantillon d’ARN avec 1 μL de colorant de chargement d’ADN. Ensuite, chargez le mélange sur le gel et exécutez-le.
      2. Assurez-vous que deux bandes claires à ~4 000 nt et ~2 000 nt, correspondant à l’ARN ribosomique (25S/18S), sont présentes sur le gel. Une autre bande floue peut être vue à ~80 nt pour l’ARNt.
    6. Utilisez immédiatement les échantillons d’ARN pour la synthèse de l’ADNc ou stockez-les à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Transcription inverse: Utilisez la méthode de la boucle souche30 pour former le premier brin d’ADNc correspondant à l’ARNcr (40 nt). Pour la transcription inverse de l’ARNg (près de 100 nt), la procédure est la même que pour la synthèse de l’ADNc du gène de référence ACT1.
    NOTE: La méthode de transcription inverse de l’ARNcr est différente de celle utilisée avec l’ARNg et l’ARNm ACT1 . Comme l’ARNcr est très court, il a été traité comme un microARN et a utilisé la méthode de transcription inverse du microARN (approche de la boucle tige) pour obtenir l’ADNc correspondant. Deux kits de synthèse d’ADNc (un kit de boucle souche pour l’ARNcr et un kit de transcription inverse habituel pour le gène ACT1 ) ont été utilisés dans la quantification de l’ARNcr. La même quantité d’ARN a été utilisée dans les deux trousses (voir le tableau des matériaux) pour rendre les résultats de l’expérience comparables. L’amorce utilisée avec le kit tige-boucle a été conçue en fonction de la séquence tige-boucle et des six derniers nucléotides à l’extrémité 3' de l’ARNcr (pour la séquence de la boucle tige et de l’amorce, voir le tableau supplémentaire 2).
    1. Méthode de boucle souche pour la transcription inverse de l’ARNcr
      1. Sortez le gabarit d’ARN, l’apprêt et les tampons du congélateur et laissez-les fondre sur la glace.
      2. Élimination de l’ADN génomique: Tout d’abord, préparez 10 μL du mélange réactionnel selon les instructions du kit. Mettre le mélange dans un thermocycleur à 42 °C pendant 2 min. Enfin, transférez-le sur la glace.
      3. Synthèse du premier brin d’ADNc : Préparer 20 μL du mélange réactionnel en ajoutant 10 μL du mélange de l’étape 6.2.1.2, 1 μL d’amorce tige-boucle (concentration de 2 μM), 2 μL de tampon réactionnel RT 10x, 2 μL de mélange d’enzymes de transcription inverse (contenant la transcriptase inverse) et 5 μL deH2Osans RNase.
      4. Placer le mélange réactionnel dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant : 25 °C pendant 5 min, 50 °C pendant 15 min et 85 °C pendant 5 min. Utilisez immédiatement le produit pour la réaction qPCR ou conservez-le à -80 °C.
    2. Transcription inverse de l’ARNg et de l’ARNm ACT1
      1. Première réaction : Préparez un mélange de 13 μL composé du mélange d’amorce, du mélange de dNTP, de la matrice d’ARN (50 pg-5 μg) et de l’eau sans RNase (à l’exception de la matrice d’ARN, tous fournis par le kit), conformément aux instructions du kit. Utilisez 1 μg de matrice d’ARN. Mettre le mélange dans un thermocycleur à 70 °C pendant 10 min.
      2. Deuxième réaction (synthèse de l’ADNc): Préparer le mélange réactionnel en ajoutant les réactifs (comme décrit dans les instructions du kit) aux 13 μL de la première solution réactionnelle jusqu’à un volume final de 20 μL. Placer le mélange dans un thermocycleur pendant 15 min à 50 °C, puis pendant 5 minutes supplémentaires à 85 °C. Utilisez immédiatement le produit pour la réaction qPCR ou conservez-le à -80 °C.
  3. Kit SYBR pour qPCR : détection de la valeur Ct
    NOTE: L’amorce inverse utilisée dans la qPCR de l’ARNcr est fixe car elle correspond au complément inverse de la séquence tige-boucle (voir tableau supplémentaire 2). L’amorce avant, en revanche, est variable et dépend de la séquence de l’ARNcr. Les amorces avant et arrière pour la qPCR de l’ARNg et de l’ARNm ACT1 sont conçues à https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Deux amorces sont choisies lorsque la différence entre leurs températures de fusion n’est pas supérieure à 2 °C (voir tableau supplémentaire 2). Chaque échantillon est mesuré en trois répétitions.
    1. Préparez le mélange réactionnel qPCR conformément aux instructions du fabricant pour le kit SYBR.
    2. Définissez le programme qPCR suivant dans une machine de PCR en temps réel.
      Préincubation : 10 min à 95 °C.
      Stade PCR : 15 s à 95 °C, suivi de 34 s à 55 °C. Réglez le cycle de l’étape PCR à 45 fois. Phase de fusion : 10 s à 95 °C, puis 60 s à 65 °C, et enfin 1 s à 97 °C.
    3. Calculer les valeurs relatives d’expression de l’ARNm via la formule de Pfaffl31.

7. Immunofluorescence pour détecter les protéines Cas

REMARQUE: Les protéines Cas (CasP) sont fusionnées à une His_tag.

  1. Préparation de cellules de levure
    1. Prélever des cellules de levure à l’aide d’une boucle stérile et les cultiver dans 5 mL de milieu riche en YPD pendant une nuit à 240 rpm à 30 °C. Le matin, ajouter 500 μL de la solution cellulaire à 20 mL de YPD frais et les cultiver à 240 rpm à 30 °C jusqu’à ce que le diamètre DO600 atteigne 0,6.
    2. Prenez 5 mL de la culture et mélangez-la avec 500 μL de formaldéhyde à 37%. Laisser le mélange à température ambiante (RT) pendant 10 min. Récolter les cellules par centrifugation à 1 500 x g pendant 5 min.
    3. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 1 mL de tampon de fixation (0,1 M KH2PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7 % de formaldéhyde, pH =6,5). Conserver la solution cellulaire à TA pendant 20 min.
    4. Centrifuger la solution cellulaire à 1 500 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lavage (0,1 M KH 2 PO 4,1,2M de sorbitol, pH = 6,5) complété par 4 μL de bêta-mercaptoéthanol et4 μL de solution de lysat (5 mg/mL). Placer la solution cellulaire dans un incubateur à 37 °C pendant 20 min.
    5. Centrifuger la solution cellulaire à 1 500 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Laver la pastille de cellule deux fois avec 1 mL de PBS par centrifugation (1 500 x g pendant 5 min).
    6. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de PBS plus 0,05% de Tween 20 et ajoutez 4 μL de solution BSA (10 mg/mL). Conserver la solution cellulaire à TA pendant 20 min.
  2. Incubation avec anticorps primaire
    1. Ajouter l’anticorps primaire anti-His au mélange à l’étape 7.1.6 à une dilution de 1:400. Conserver la solution à TA pendant 2 h.
    2. Centrifuger le mélange à l’étape 7.2.1 à 1 500 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Ajouter 1 mL de PBST et centrifuger (1 500 x g) pendant 5 min pour laver la pastille de cellule. Répétez cette opération deux fois. Enfin, jetez le surnageant et suspendez les cellules dans 100 μL de 1x PBST.
  3. Détection de cellules de microscopie
    1. Montez les cellules sur une diapositive; prélever 2 μL de la solution cellulaire de l’étape 7.2.2 et la placer sur une lame de verre. Couvrez-le d’un bordereau.
    2. Observez les cellules au microscope à fluorescence. Allumez la source de lumière fluorescente, le microscope et l’ordinateur. Notez le numéro de la source de lumière fluorescente et ouvrez le logiciel du microscope sur l’ordinateur.
    3. Placez la lame sur la scène du microscope. Choisissez l’objectif 40x et observez les cellules sous la lumière verte (550 nm). Déplacez le bouton de mise au point grossière jusqu’à ce que le contour des cellules de levure apparaisse. Déplacez le bouton de mise au point fine pour concentrer les cellules.
    4. Détectez les cellules avec le logiciel de microscope. Fermez le champ de vision du microscope et passez à l’écran de l’ordinateur. Cliquez sur Live, attendez 3-5 s et cliquez sur Capturer pour prendre une photo. Enregistrez l’image.
    5. Éteignez l’ordinateur, le microscope et la source lumineuse fluorescente.

8. Acquisition de données : FACS

REMARQUE : La fluorescence verte est détectée par cytométrie en flux (c.-à-d. mesures de tri cellulaire activées par fluorescence [FACS]). Les cellules de levure sont cultivées, en général, à 30 °C et 240 rpm pour exécuter des expériences FACS. Cependant, les cellules peuvent exiger certaines précautions en fonction de leur contenu génétique. Les cellules qui contiennent le gène dCas12a-VPR (contrôlé par le promoteur constitutif GPD ) doivent être cultivées pendant 24 h dans la solution SDC. Ensuite, les cellules sont diluées dans un rapport de 1:100 dans du SDC frais et cultivées pendant 12 heures supplémentaires avant de mesurer l’intensité de fluorescence. Les cellules modifiées avec le gène AcrIIA4-HBD(hER) exigent également une dilution. En outre, la DO600 doit être contrôlée. Tout d’abord, les cellules sont autorisées à se développer en SDC pendant la nuit (plus de 14 h). Le matin, OD600 est mesuré. Ensuite, la culture est diluée dans du SDC, fourni avec une concentration variée de β-estradiol, jusqu’àOD 600 = 0,1. Avant les expériences FACS, les cellules sont cultivées pendant encore 7 heures de sorte que OD600 atteigne 0,8-1,0. Les cellules exprimant dCas9-VP64 ou dCas12a-VP64 sont cultivées en SDC pendant 20-24 h sans dilution ni croissance supplémentaire avant les mesures à la machine FACS.

  1. Allumez la machine FACS 20 min avant les mesures pour réchauffer le laser.
  2. Préparer les échantillons (dilution) : mélanger 20 μL de la culture cellulaire avec 300 μL deddH2O.
  3. Exécutez le logiciel FACS sur l’ordinateur connecté à la machine FACS et créez une nouvelle expérience. Réglez les paramètres de mesure (c.-à-d. FSC(SSC)-A/H/W et histogramme).
  4. Sélectionnez le filtre en fonction des longueurs d’onde d’excitation et d’émission des échantillons. Par exemple, la protéine cible ici est yEGFP, dont les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement de 488 nm et 507 nm. Sélectionnez donc le filtre FITC ou GFP (longueur d’onde d’excitation : 488 nm ; longueur d’onde d’émission : 527/32 nm). Définissez le numéro de cellule d’acquisition sur 10 000.
  5. Ajustez la tension du filtre FITC en mesurant l’intensité des billes fluorescentes. S’assurer que la différence relative d’intensité des billes entre deux expériences consécutives ne dépasse pas 5 %.
  6. Lavez la machine avec ddH2O pendant quelques secondes pour éliminer tout excès de billes éventuel.
  7. Mesurer l’intensité de fluorescence de l’échantillon. Cliquez sur Aperçu et attendez 3-5 s pour la stabilité de l’injection de l’échantillon. Enfin, cliquez sur Acquérir.
  8. Mesurez à nouveau les perles à la fin de l’expérience. La tension est celle qui a été utilisée lors de la mesure initiale des billes (voir étape 8.4, 438-441 V). Vérifiez si la différence relative entre les mesures des deux perles dépasse 5%.
  9. Exportez les données FACS sous forme de fichiers FCS.
  10. Analysez les fichiers FCS avec le logiciel R Studio.

9. Analyse des données

REMARQUE: Utilisez le package Flowcore R Bioconductor 32 dans R studio. Les fichiers FCS ont été analysés à l’aide d’un script écrit en langage R.

  1. Ouvrez R studio et chargez le script d’analyse Bdverse. R pour analyser les fichiers FCS.
  2. Définissez le nom de l’expérience (ename), le répertoire (chemin) dans lequel se trouvent les fichiers FCS
    Stocké (dir_d) et où les fichiers de résultats seront créés (dir_r).
  3. Réglez le canal de fluorescence. Par exemple, select_ch = « GPA-A » si la fluorescence verte a été mesurée.
  4. Définissez le nombre d’échantillons mesurés (s_num).
  5. Définissez les dimensions de chaque diagramme à points (sxlim, sylim). Définissez la longueur maximale des axes x et y pour les diagrammes à barres et les diagrammes en boîte (xlimit, ylimit). xlimit doit être supérieur ou égal à s_num.
  6. Choisissez la méthode de contrôle en supprimant le # des lignes correspondantes.
    REMARQUE: morphGate est une méthode de contrôle automatique effectuée par le script (c’est-à-dire que la région des diagrammes de points où les cellules sont plus denses est reconnue et sélectionnée par le programme). polygonGate et rectangleGate demandent d’examiner les diagrammes de points et de définir les sommets d’un polygone ou le côté d’un rectangle qui embrasse la zone où se trouvent la plupart des cellules.
  7. Sélectionnez l’objet flowSet gated, correspondant à la méthode de contrôle choisie. Sélectionnez la résolution du graphique à points (res ; doit être au moins égale à 256).
  8. Décommenter flt_low <- filter_low(sp) pour supprimer les mesures où la fluorescence est négative. Décommentez flt_sp < filtre(flt_lw s) pour supprimer les valeurs aberrantes dues à d’autres expériences.
  9. Appuyez sur Source et exécutez le script. Tous les fichiers contenant les résultats de l’analyse sont créés dans dir_r.

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Representative Results

Expression d’ARNg/ARNcr par un promoteur de type ARN polymérase III
Tout d’abord, ces travaux ont porté sur l’ingénierie du circuit d’activation transcriptionnelle (circuit 1) illustré à la figure 1A. Il contenait trois composants de base: 1) le gène codant pour yEGFP (le rapporteur), qui a été précédé par une série de promoteurs synthétiques différents qui ont fourni des sites cibles pour dCas9 / dCas12a-AD; 2) une version optimisée pour les codons de levure de dCas9 ou dCas12a fusionnée à un domaine d’activation (VP64 et VPR, respectivement) et contenant une ou deux séquences de localisation nucléaire (NLS). Les deux protéines dCas ont été produites par un puissant promoteur constitutif, le pGPD; et 3) une séquence d’ARNg/ARNcr qui a guidé dCas9/dCas12a-AD vers les sites cibles. L’efficacité d’activation des activateurs basés sur dCas9/dCas12a a été visualisée et reflétée par l’intensité de fluorescence du rapporteur (mesurée par des expériences FACS).

Une protéine dCas9 (dSpCas9) et deux protéines dCas12a (denAsCas12a et dLbCas12a) ont été testées. Une activation de 3,36 fois a été obtenue avec dSpCas9 étendu, à son extrémité C, avec le VP64 AD et liant un promoteur synthétique en amont de yEGFP contenant six copies du site cible lexOp. L’ARNg a été placé dans un vecteur navette intégratif et transcrit par le promoteur SNR52 dépendant de l’ARN polymérase III (configuration SNR52i , voir Figure 1B). Dans le cas de dCas12a, denAsCas12a-VPR a renvoyé l’activation la plus élevée (4,45 fois) d’un promoteur synthétique avec trois opérateurs lorsque l’ARNcr était exprimé via la configuration SNR52i (Figure 1C). Dans les mêmes conditions, dLbCas12a-VPR a obtenu sa meilleure amélioration de fluorescence (3,21 fois) (Figure 1D). Il convient de noter que le terme de comparaison, dans chaque expérience, était un circuit dont l’ARNg/ARNcr ne pouvait pas lier les opérateurs de la lex.

Les plasmides multicopies ne sont pas nécessaires
La cassette d’expression de l’ARNg SNR52i a été remplacée par une structure RGR exprimée par un promoteur modérément fort-pADH1. Cependant, dans les cas dCas9 et dCas12a, l’activation en présence d’un sgRNA/ARNcr généré par l’auto-clivage de RGR semblait comparable ou même inférieure à celle obtenue avec un sgRNA/ARNcr produit via SNR52i, malgré le fait que pSNR52 était considéré comme un promoteur faible (voir Figure 1C,D pour les premiers résultats obtenus avec dCas12a).

Pour explorer davantage le lien entre la quantité d’ARNg/ARNcr et l’efficacité d’activation, les deux systèmes d’expression de l’ARNg/ARNcr ont été insérés dans un plasmide épisomal, qui peut être absorbé par la cellule en 10 à 40 copies et générer une plus grande quantité d’ARNg/ARNcr. Comme le montre la figure 2A, l’activation par l’ARNcr situé sur un plasmide intégratif (SNR52i ou RGRi) était de 1,4 à 2,4 fois supérieure à celle obtenue lorsque le même ARNcr était exprimé par un plasmide épisomique (SNR52m ou RGRm). La tendance a été confirmée par le sgRNA. Dans ce cas, le plasmide intégratif garantissait une activation 1,1 à 1,5 fois plus élevée (Figure 2B). Pour exclure que les résultats aient été causés par une perte des plasmides épisomiques, la RT-qPCR a été réalisée pour quantifier l’abondance relative de l’ARNg/ARNcr in vivo. Les résultats, dans la figure 2C,D, ont vérifié que le vecteur épisomique produisait un niveau beaucoup plus élevé d’ARNg/ARNcr que le vecteur intégratif, quel que soit le système d’expression (RGR ou SNR52). Ces résultats ont montré que le système SNR52 pouvait fonctionner encore mieux que le système RGR, et une plus grande quantité d’ARNg/ARNcr dans la cellule ne garantissait pas une activation plus élevée par le système CRISPR-Cas. Par conséquent, les plasmides épisomiques ne devraient pas être utilisés dans la construction de circuits numériques géniques où dCas9/dCas12a-AD sont utilisés.

Ingénierie de l’ARN d’échafaudage
Un scRNA a été conçu en étendant la séquence d’un sgRNA avec des structures en épingle à cheveux MS2 qui ont permis de recruter VP64 AD lorsqu’il est fusionné à la protéine de couche MS2 (MCP, voir Figure 3A). De cette façon, aucune ingénierie ni modification de dCas9 n’a été nécessaire. Deux variantes MS2 ont été essayées : wt et f6. L’ARNc contenant l’épingle à cheveux MS2 unique - 1×MS2 (wt) et 1×MS2 (f6) - a donné une activation de 5,27 fois et 4,34 fois, respectivement. Cependant, le scRNA avec une combinaison des deux épingles à cheveux - 2×MS2 (wt + f6) - a renvoyé l’activation globale la plus élevée dans cette étude (7,54 fois, voir Figure 3B). Ces résultats ont démontré que l’ingénierie d’un scRNA était beaucoup plus efficace que la fusion directe de tout domaine d’activation avec dSpCas9.

Porte booléenne à base de protéines Acr
Pour mieux contrôler et ajuster l’activation transcriptionnelle par les systèmes CRISPR-Cas, le circuit 1 a été modifié avec l’insertion d’un quatrième TU pour l’expression des protéines anti-CRISPR (voir Figure 4A pour les AcrIIA et Figure 5A pour les AcrVA). Après avoir montré que les Acrs étaient efficaces, chez S. cerevisiae, pour contraster l’activation due à dCas9/dCas12a-AD, un nouveau circuit a été construit (voir Figure 5D) pour tester l’action de l’AcrVA sur les répresseurs à base de dCas12a (un travail antérieur33 avait déjà montré que les AcrIIA pouvaient inhiber la régulation négative des gènes à base de dCas9). Les nouveaux petits réseaux contenant de l’Acr fonctionnaient comme de simples portes booléennes (OUI et PAS), ce qui pourrait conduire à un restyling de la couche d’entrée de circuits numériques de gènes synthétiques plus complexes.

AcrIIA4 est un inhibiteur puissant de dSpCas9
Quatre promoteurs différents avec des forces diverses ont été utilisés pour conduire l’expression de trois types d’AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 et AcrIIA5. Les résultats ont montré que les trois AcrII fonctionnaient de manière dose-dépendante chez S. cerevisiae. Lorsqu’ils sont exprimés par un promoteur fort, le pGPD, ils réduisent le niveau de fluorescence atteint par dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 à 0,21, 0,11 et 0,13 de sa valeur, respectivement (Figure 4B). Étant donné que l’AcrIIA4 était le seul à provoquer une forte inhibition de l’expression de la fluorescence, même lorsqu’il était produit par un promoteur synthétique faible, genCYC1t_pCYC1noTATA, nous pouvions en déduire que l’AcrIIA4 était l’inhibiteur le plus puissant parmi les trois AcrII. Ensuite, le HBD(ER) a été fusionné à l’extrémité C d’AcrIIA4 pour construire un dispositif de détection de β-estradiol (voir Figure 4C). En présence de l’œstrogène β-estradiol, AcrIIA4-HBD(ER) pourrait se déplacer dans le noyau puis neutraliser la fonction de l’activateur basé sur dSpCas9. La courbe de titrage de la figure 4D montre que le circuit se comporte comme une porte NOT avec un rapport ON/OFF proche de 2,3.

Les AcrVA sont des répresseurs des protéines dCas12a
Une porte NOT a été conçue et construite en insérant la cassette d’expression AcrVA pilotant pGAL1 dans le circuit 1. De cette façon, la synthèse de l’AcrVA, et la répression conséquente de dCas12a-AD, pourraient être induites par le galactose (Figure 5A). Comme le montre la figure 5B,C, AcrVA1 a entravé à la fois denAsCas12a et dLbCas12a en tant qu’activateurs en réduisant l’expression de fluorescence de 19% à 71%, selon le schéma du circuit. AcrVA4 et AcrVA5 ne peuvent exercer aucune action sur denAsCas12a34. Cependant, ils ont effectué une forte inhibition des activateurs à base de dLbCas12a en réduisant l’expression de fluorescence jusqu’à 84% (AcrVA5) et 82% (AcrVA4). Dans l’ensemble, AcrVA5 s’est avéré être le plus fiable, parmi ces trois AcrVA, pour inhiber les activateurs à base de dLbCas12a car il garantissait, dans différents circuits, une répression supérieure à 70%.

L’action de l’AcrVA1 dépend de la concentration
La relation entre la concentration in vivo des AcrVA et leurs effets inhibiteurs sur les activateurs et les répresseurs à base de denAs/dLbCas12a a également été étudiée. À cette fin, chaque AcrVA a été exprimée sous différents promoteurs: le pGAL1 fort, le pTEF1 de force moyenne et le faible genCYC1t_pCYC1noTATA. Comme l’illustre la figure 5E, AcrVA1 a montré de grandes fluctuations de ses performances en fonction du promoteur qui a conduit sa synthèse. AcrVA1 n’a fonctionné raisonnablement bien que lorsqu’il était produit par pGAL1. Sous pTEF1 et genCYC1t_pCYC1noTATA, AcrVA1 a montré une certaine répression sur le dLbCas12a nu seulement. AcrVA4 et AcrVA5, en revanche, semblaient moins sensibles à leur concentration, en particulier lorsqu’elles interagissaient avec les dLbCas12a nues.

Ces données ont montré que AcrVA4 et AcrVA5 ont généralement donné de meilleurs résultats qu’AcrVA1 dans l’inhibition des facteurs de transcription basés sur dLbCas12a chez S. cerevisiae. Il convient de noter que l’AcrVA5 a un mécanisme de fonctionnement particulier, car il agit comme une enzyme qui modifie LbCas12a de manière permanente. Cependant, comme mentionné ci-dessus, AcrVA5 (avec AcrVA4) ne peut pas interagir avec denAsCas12a.

Lorsque les AcrVA étaient exprimés sous pGAL1, les circuits devenaient soit des portes YES (dCas12a a été fusionné à une AD), soit des portes NOT (dCas12a nues). Les premiers semblaient tous très performants, tandis que les seconds semblaient mieux fonctionner en présence d’AcrVA4 ou d’AcrVA5.

Figure 1
Figure 1 : Activation transcriptionnelle médiée par dCas9/dCas12a-AD. A) Schéma du circuit 1. Les promoteurs synthétiques de yEGFP contenaient six (6x) et trois (3x) copies de sites cibles pour dCas9 ou dCas12a, respectivement. Après cela, dCas9 / dCas12a-AD se combine avec sgRNA / ARNcr; Le promoteur synthétique est ciblé et activé en raison de la présence des domaines d’activation. (B) La meilleure efficacité d’activation de dSpCas9-VP64 a été obtenue lorsqu’il y avait six sites cibles lexOp sur le promoteur synthétique, et que l’ARNg a été transcrit par SNR52i. (C, D) L’efficacité d’activation la plus élevée de dCas12a-VPR a été obtenue lorsque trois copies de lexOp ont été insérées dans le promoteur synthétique, et l’ARNcr a été généré par SNR52i. SNR52i signifie que le sgRNA/ARNcr a été produit par pSNR52, et la cassette d’expression a été placée à l’intérieur d’un vecteur navette intégratif. RGRi signifie qu’un plasmide intégratif hébergeant la cassette RGR pour exprimer l’ARNg/ARNcr a été utilisé. Le témoin négatif, « -« , représente un sgRNA/ARNcr contenant une séquence d’espacement brouillée qui ne correspond pas au site lexOp ni à aucune séquence le long du génome de la levure. « bA » indique que le sgRNA/crRNA se lie au brin antisens de l’ADN cible, tandis que « bS » signifie lier le brin sensoriel. Chaque niveau de fluorescence représente la valeur moyenne d’au moins trois expériences indépendantes (c.-à-d. effectuées à des jours différents). Les barres d’erreur sont l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison de l’ARNg/ARNcr integratif et épisomique producteur de plasmides. (A) Efficacité d’activation de dLbCas12a-VPR:crRNA lors du ciblage d’un seul site sur le promoteur en amont de yEGFP. (B) dSpCas9-VP64:promoteur synthétique n× activé par sgRNA (« n » signifie le nombre de sites cibles lexOp). (C, D) Niveau d’expression normalisé de l’ARNg/ARNcr15,16. « i » signifie que la cassette d’expression de l’ARNg/ARNcr a été placée dans un vecteur navette intégratif, tandis que « m » signifie plasmide multicopie (c.-à-d. épisomique). « bA"/"bS » indique que le sgRNA/crRNA se lie au brin antisens/sens de l’ADN. « ctrl » est un contrôle négatif, où un sgRNA/ARNcr brouillé a été exprimé. Chaque niveau de fluorescence représente la valeur moyenne d’au moins trois expériences indépendantes (c.-à-d. effectuées à des jours différents). Les barres d’erreur sont l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’efficacité d’activation du dSpCas9 nu en complexe avec un scRNA. (A) Le diagramme schématique des interactions entre scRNA, MCP-VP64 et le dSpCas9 nu16. La structure en forme de coiffe en violet représente la protéine de m.c.p. (MS2). Une épingle à cheveux MS2 (la structure violette dans le scRNA) peut recruter et lier deux copies de MCP. Ainsi, un scRNA permet non seulement la liaison à l’ADN par dSpCas9 mais aussi l’activation de l’expression génique par le recrutement de MCP-VP64. (B) L’efficacité d’activation de dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. Trois types d’ARNc ont été testés: l’un portant l’épingle à cheveux MS2 de type sauvage 1×MS2 (wt), un autre conçu avec l’aptamère MCP f6-1×MS2 (f6), et le dernier contenant les deux épingles à cheveux-2×MS2 (wt + f6), qui s’est avéré être le plus performant. Chaque niveau de fluorescence représente la valeur moyenne d’au moins trois expériences indépendantes (c.-à-d. effectuées à des jours différents). Les barres d’erreur sont l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Circuits et résultats liés à AcrIIA. (A) La cassette d’expression AcrIIA a été insérée dans le circuit 1. Cette TU supplémentaire inclut pGPD menant l’expression des AcrIIA pour contrer dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64. (B) L’efficacité d’inhibition des AcrIIA sur le meilleur activateur basé sur dSpCas9 de la figure 3B. La ligne pointillée noire représente la fluorescence en présence de l’activateur basé sur dSpCas9. Les chiffres au-dessus de chaque colonne montrent l’efficacité d’inhibition calculée comme le rapport OFF/ON (c’est-à-dire le niveau de fluorescence en présence de l’AcrIIA divisé par la fluorescence en l’absence de tout AcrIIA). Dans la légende, la force des quatre promoteurs constitutifs augmente progressivement de haut en bas. (C) Schéma du dispositif de détection du β-estradiol (NOT gate) exprimant AcrIIA4-HBD(hER). (D) Courbe de titrage du circuit en (C)16. La courbe verte fait référence au changement de fluorescence dans le circuit fonctionnel. La courbe noire a été dérivée de la déformation sans l’expression d’AcrIIA4-HBD(hER)-le témoin négatif. La ligne pointillée en gris marquait le plateau de fluorescence à l’équilibre. Il a été calculé comme la moyenne des valeurs de fluorescence à des concentrations de β-estradiol non inférieures à 125 nM. Chaque niveau de fluorescence représente la valeur moyenne d’au moins trois expériences indépendantes (c.-à-d. effectuées à des jours différents). Les barres d’erreur sont l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Circuits liés à l’AcrVA et résultats. (A) La cassette d’expression AcrVA a été insérée dans le circuit 1. Le nouveau TU contient le promoteur inductible pGAL1 en amont des gènes AcrVA qui neutralisent le fonctionnement de dCas12a-AD. Le nouveau circuit est une porte NON régulée par le galactose. (B,C) Résultats de la porte NOT sensible au galactose en (A). Ici, pGAL1 pilote la synthèse des AcrVA, qui interagissent ensuite avec dCas12a-AD15. La fluorescence relative correspond au rapport OFF/ON. (D) Porte OUI sensible au galactose. Il utilise des AcrVAs sous le contrôle de pGAL1 et des dCas12as nues qui répriment la synthèse de yEGFP. (E) Comparaison des efficacités d’inhibition des AcrVA exprimées par des promoteurs de force différente15. Les groupes « AcrV effects on repression » et « dLb nu » se réfèrent au circuit en (D). Les groupes « AcrV effects on activation » et « dLb-VPR » sont les résultats de la porte NOT en (A). Chaque niveau de fluorescence représente la valeur moyenne d’au moins trois expériences indépendantes (c.-à-d. effectuées à des jours différents). Les barres d’erreur sont l’écart-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Une liste de toutes les séquences d’ADN utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Liste des amorces utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage supplémentaires : Le script R studio pour analyser les fichiers FCS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le protocole a montré un flux de travail complet possible pour les circuits numériques de gènes synthétiques, suivant le cycle de génie biologique « Design-Build-Test-Learn » (DBTL) et concernant à la fois des expériences de laboratoire sec et de laboratoire humide. Ici, nous nous sommes concentrés sur le système CRISPR-Cas, principalement dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a et les protéines anti-CRISPR correspondantes, en concevant et en construisant dans S. cerevisiae de petits réseaux transcriptionnels. Certains d’entre eux imitaient les portes booléennes, qui sont les composants de base des circuits numériques. Tous les circuits décrits ici nous ont permis de décrire les propriétés et les caractéristiques des protéines associées et anti-CRISPR associées à CRISPR chez S. cerevisiae. Ces résultats sont essentiels pour inclure ces protéines dans le schéma des circuits numériques géniques.

Le concept DBTL fournit un cadre en biologie synthétique, tandis que de nombreuses optimisations et améliorations doivent être apportées après avoir testé un nouvel artefact. Par exemple, dans le circuit 1, il n’y avait initialement qu’un seul site cible (une copie de lexOp) pour dCas9/dCas12a-AD sur le promoteur synthétique en amont de yEGFP. Après avoir testé cette configuration de circuit, nous avons constaté qu’il ne pouvait pas atteindre plus d’une activation double15,16. Ensuite, nous avons supposé qu’en augmentant le nombre de copies de lexOp, comme dans7, nous pourrions atteindre une activation transcriptionnelle plus élevée. En effet, un niveau de fluorescence plus élevé a été obtenu en utilisant trois à six sites lexOp (Figure 1). De plus, nous avons encore amélioré les performances des circuits hébergeant dSpCas9 en concevant un scRNA, ce qui est plus facile que de fusionner un ou plusieurs AD en une grosse protéine comme dSpCas9 (Figure 3). De plus, en utilisant un promoteur de différentes forces pour produire les trois AcrIIA que nous avons choisis, nous avons conclu que AcrIIA4 était l’inhibiteur le plus puissant d’entre eux. Ainsi, nous avons construit une nouvelle porte NOT sensible au β-estradiol en fusionnant le HBD(ER) à AcrIIA4 et en exploitant la forte répression d’AcrIIA4 sur notre meilleur activateur basé sur dSpCas9 (Figure 4).

De même, nous avons profondément caractérisé à la fois le fonctionnement de denAsCas12a et dLbCas12a dans la levure et leurs interactions avec trois AcrVAs (Figure 5). Pour chaque paire dCas12a-AcrVA, nous avons construit une porte NOT (dCas12a a été fusionnée à un AD) et une porte YES (dCas12a nue) répondant au galactose. Dans l’ensemble, dLbCas12a, avec AcrVA5, a abouti au meilleur système pour calculer des fonctions logiques simples.

La méthode décrite ici présentait quelques étapes critiques. Toutes les séquences d’ADN protéique ont été optimisées pour les codons de levure afin d’assurer une expression plus élevée chez S. cerevisiae. Pour éviter des cibles non spécifiques de dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a dans le génome de S. cerevisiae , nous avons sélectionné un opérateur bactérien tel que lexOp. De plus, les souches contenant le promoteur GAL1 ont montré un retard de croissance important qui pourrait limiter l’applicabilité de pGAL1 aux circuits géniques synthétiques15.

Certaines modifications pourraient également être apportées à certaines étapes de la méthode globale. Afin d’améliorer l’efficacité de la procédure de digestion-ligature, il est préférable de digérer 10 μg (pendant la nuit) du plasmide contenant l’insert et des vecteurs accepteurs, plutôt que seulement 5 μg en 1 h. De cette façon, une concentration d’ADN plus élevée est atteinte après l’étape d’élution. Le temps de ligature T4 doit être prolongé de 1 h (protocole du fabricant) à 8 h. Enfin, les souches contenant la protéine de fusion dCas12a-VPR doivent être diluées après une culture de 24 heures et cultivées pendant 12 heures supplémentaires avant d’exécuter une expérience FACS. Dans cette condition, la variabilité entre les niveaux de fluorescence des différentes cellules n’est plus trop élevée, et un écart-type acceptable accompagne la valeur moyenne de l’intensité de fluorescence sur une population cellulaire.

En résumé, ce protocole expliquait comment simplifier la conception des circuits numériques géniques en utilisant des protéines dCas et, éventuellement, des protéines anti-CRISPR. Plus important encore, nous avons montré en détail comment ces familles de protéines fonctionnent chez S. cerevisiae et lesquelles d’entre elles sont les plus prometteuses pour une utilisation future au sein des réseaux numériques. Un problème non résolu est le couplage des systèmes CRISPR-dCas/anti-CRISPR et des produits chimiques, qui représentent les entrées du circuit et ne peuvent pas lier directement les protéines dCas ou les anti-CRISPR. Ici, nous avons contourné le problème en utilisant soit le promoteur GAL1 inductible, soit le HBD(ER) attaché à AcrIIA4. Cependant, un moyen de généraliser l’architecture de la couche d’entrée du circuit est nécessaire pour concevoir des circuits numériques de gènes synthétiques pour différents domaines de la bio-ingénierie tels que l’ingénierie métabolique, la biosynthèse, la biodétection, le biodiagnostic et la bioremédiation.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier tous les étudiants du laboratoire de biologie synthétique SPST, TJU pour leur aide générale, ainsi que Zhi Li et Xiangyang Zhang pour leur aide dans les expériences FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

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References

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Circuits numériques géniques basés sur des systèmes CRISPR-CAS et des protéines anti-CRISPR
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Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

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