Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Gen digitale kredsløb baseret på CRISPR-Cas systemer og anti-CRISPR proteiner

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner blev integreret i ordningen med boolske porte i Saccharomyces cerevisiae. De nye små logiske kredsløb viste god ydeevne og uddybede forståelsen af både dCas9/dCas12a-baserede transkriptionsfaktorer og egenskaberne af anti-CRISPR-proteiner.

Abstract

Syntetiske gen boolske porte og digitale kredsløb har en bred vifte af applikationer, fra medicinsk diagnostik til miljøpleje. Opdagelsen af CRISPR-Cas-systemerne og deres naturlige hæmmere - anti-CRISPR-proteinerne (Acrs) - giver et nyt værktøj til at designe og implementere in vivo genets digitale kredsløb. Her beskriver vi en protokol, der følger ideen om "Design-Build-Test-Learn" biologisk ingeniørcyklus og gør brug af dCas9 / dCas12a sammen med deres tilsvarende Acrs til at etablere små transkriptionelle netværk, hvoraf nogle opfører sig som boolske porte, i Saccharomyces cerevisiae. Disse resultater påpeger egenskaberne af dCas9/dCas12a som transkriptionsfaktorer. Især for at opnå maksimal aktivering af genekspression skal dSpCas9 interagere med et konstrueret stillads-RNA, der indsamler flere kopier af VP64-aktiveringsdomænet (AD). I modsætning hertil skal dCas12a ved C-terminalen smeltes sammen med den stærke VP64-p65-Rta (VPR) AD. Desuden forbedres aktiviteten af begge Cas-proteiner ikke ved at øge mængden af sgRNA/crRNA i cellen. Denne artikel forklarer også, hvordan man bygger boolske porte baseret på CRISPR-dCas-Acr-interaktionen. Det AcrIIA4-smeltede hormonbindende domæne for den humane østrogenreceptor er kernen i en NOT-port, der reagerer på β-østradiol, mens AcrVA'er syntetiseret af den inducerbare GAL1-promotor tillader at efterligne både JA og IKKE porte med galactose som input. I sidstnævnte kredsløb viste AcrVA5 sammen med dLbCas12a den bedste logiske adfærd.

Introduction

I 2011 foreslog forskere en beregningsmetode og udviklede et tilsvarende stykke software til automatisk design af digitale syntetiske genkredsløb1. En bruger skulle angive antallet af indgange (tre eller fire) og udfylde kredsløbets sandhedstabel; Dette gav alle de nødvendige oplysninger til at udlede kredsløbsstrukturen ved hjælp af teknikker fra elektronik. Sandhedstabellen blev oversat til to boolske formler via Karnaugh-kortets metode2. Hver boolsk formel er lavet af klausuler, der beskriver logiske operationer (sum eller multiplikation) blandt (en del af) kredsløbsindgange og deres negationer (de bogstavelige). Klausuler er igen enten opsummeret (OR) eller ganget (AND) for at beregne kredsløbsudgangen. Hvert kredsløb kan realiseres i henhold til en af dets to tilsvarende formler: den ene skrevet i POS (produkt af summer) form og den anden i SOP (sum af produkter) repræsentation. Førstnævnte består af en multiplikation af klausuler (dvs. boolske porte), der indeholder en logisk sum af de bogstavelige. Sidstnævnte er derimod en sum af klausuler, hvor de bogstavelige multipliceres.

Elektriske kredsløb kan realiseres på et brødbræt ved fysisk at forbinde forskellige porte sammen. Den elektriske strøm tillader udveksling af signaler mellem porte, hvilket fører til beregning af udgangen.

I biologi er situationen mere kompleks. En boolsk gate kan realiseres som en transkriptionsenhed (TU; dvs. sekvensen "promotorkodende regionterminator" inde i eukaryote celler), hvor transkription eller oversættelse (eller begge) reguleres. Således etablerer mindst to slags molekyler en biologisk ledning: transkriptionsfaktorproteinerne og de ikke-kodende, antisense RNA'er1.

Et gendigitalt kredsløb er organiseret i to eller tre lag porte, nemlig: 1) inputlaget, der er lavet af JA (buffer) og IKKE porte og omdanner inputkemikalierne til ledningsmolekyler; 2) det indre lag, der består af så mange TU'er, som der er klausuler i den tilsvarende boolske formel. Hvis kredsløbet er designet i henhold til SOP-formlen, vil hver klausul i det indre lag producere kredsløbsudgangen (f.eks. Fluorescens) i en såkaldt distribueret outputarkitektur. Hvis produktet af sum (POS) formel anvendes, kræves der et 3) sidste lag, som vil indeholde en enkelt multiplikativ port, der samler ledningsmolekylerne fra det indre lag.

Samlet set kan der i syntetisk biologi designes mange forskellige ordninger til det samme kredsløb. De adskiller sig i antallet og typen af både TU'er og ledningsmolekyler. For at vælge den nemmeste løsning, der skal implementeres i gærceller, er hvert kredsløbsdesign forbundet med en kompleksitetsscore S, defineret som

Equation 1

hvor A repræsenterer antallet af aktivatorer, R repræsenterer antallet af repressorer, og a er mængden af antisense RNA-molekyler. Hvis enten aktivatorer eller repressorer er fraværende fra kredsløbet, er deres bidrag til S nul. Derfor er det vanskeligere at realisere et kredsløbsskema i laboratoriet (højt S), når det kræver et stort antal ortogonale transkriptionsfaktorer. Dette betyder, at nye aktivatorer og repressorer skal konstrueres de novo for at realisere den komplette ledning inde i de digitale kredsløb. I princippet kan nye DNA-bindende proteiner samles ved hjælp af zinkfingerproteiner3 og TAL-effektorer4 som skabeloner. Denne mulighed virker imidlertid for besværlig og tidskrævende; derfor bør man hovedsagelig stole på små RNA'er og translationsregulering for at færdiggøre komplekse genkredsløb.

Oprindeligt blev denne metode udviklet til at fremstille digitale kredsløb i bakterier. Faktisk er det i eukaryote celler i stedet for antisense-RNA'er mere egnet at tale om mikroRNA'er (miRNA'er) eller små interfererende RNA'er (siRNA'er)5. RNAi-vejen er imidlertid ikke til stede i gæren S. cerevisiae. Derfor bør man vælge fuldt transkriptionsnetværk. Antag, at et kredsløb har brug for fem aktivatorer og fem undertrykkere; dens kompleksitetsscore ville være S = 32. Kredsløbskompleksiteten kan reduceres ved at erstatte de 10 transkriptionsfaktorer med en enkelt dCas96 (nukleasemangel Cas9) smeltet sammen til et aktiveringsdomæne (AD). Som vist i7 fungerer dCas9-AD som en repressor i gær, når der bindes en promotor mellem TATA-boksen og TSS (transkriptionsstartstedet) og som aktivator, når den binder godt opstrøms for TATA-boksen. Således kan man erstatte 10 transkriptionsfaktorer med et enkelt dCas9-AD fusionsprotein og 10 sgRNA'er (single guide RNA'er) for en total kompleksitetsscore på S = 11. Det er hurtigt og nemt at syntetisere ti sgRNA'er, mens samlingen af 10 proteiner som tidligere kommenteret ville kræve meget længere og mere kompliceret arbejde.

Alternativt kan man bruge to ortogonale dCas-proteiner (f.eks. dCas9 og dCas12a): den ene til at smelte sammen til en AD, og den anden bar eller i kombination med et undertrykkelsesdomæne. Kompleksitetsscoren ville kun stige med én enhed (S = 12). Derfor er CRISPR-dCas-systemer nøglen til konstruktionen af meget indviklede gendigitale kredsløb i S. cerevisiae.

Dette papir karakteriserer dybt effektiviteten af både dCas9- og dCas12a-baserede repressorer og aktivatorer i gær. Resultaterne viser, at de ikke kræver en høj mængde sgRNA for at optimere deres aktivitet, så episomale plasmider undgås fortrinsvis. Desuden er dCas9-baserede aktivatorer langt mere effektive, når man bruger et stillads-RNA (scRNA), der rekrutterer kopier af VP64 AD. I modsætning hertil fungerer dCas12a godt, når den smeltes direkte sammen med den stærke VPR AD. Desuden kræver en syntetisk aktiveret promotor et variabelt antal målsteder afhængigt af aktivatorens konfiguration (f.eks. tre ved brug af dCas12a-VPR, seks for dCas9-VP64 og kun en med dCas9 og et scRNA). Som repressor virker dCas12a mere skarp, når man binder kodningsregionen frem for promotoren.

Som en ulempe interagerer CRISPR-dCas9/dCas12a dog ikke direkte med kemikalier. Derfor er de muligvis ikke til nogen nytte i inputlaget. Af denne grund er alternative boolske gate-design, der indeholder anti-CRISPR-proteiner (Acrs), blevet undersøgt. Acrs virker på (d)Cas-proteiner og hæmmer deres arbejde8. Derfor er de et middel til at modulere aktiviteten af CRISPR-(d)Cas-systemer. Dette papir analyserer grundigt interaktionerne mellem type II Acrs og (d) Cas9, såvel som type V Acrs og (d) Cas12a i S. cerevisiae. Da Acrs er meget mindre end Cas-proteiner, blev en NOT-port, der reagerer på østrogen-β-østradiol, bygget ved at fusionere det hormonbindende domæne af den humane østrogenreceptor9-HBD (hER) til AcrIIA4. Desuden blev en håndfuld JA og IKKE porte, der udtrykte dCas12a (-AD) konstitutivt og AcrVA'er ved induktion med galactose, realiseret. På nuværende tidspunkt tjener disse porte kun som et bevis på konceptet. Men de repræsenterer også det første skridt mod en dyb nytænkning af algoritmen til at udføre det beregningsmæssige automatiske design af syntetiske gendigitale kredsløb i gærceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og konstruktion af sgRNA/crRNA-ekspressionskassetten

BEMÆRK: Der er to slags sgRNA / crRNA-ekspressionskassetter: en-betegnet SNR5210-består af RNA-polymerase III-afhængig SNR52-promotor, sgRNA / crRNA-sekvensen og SUP4-terminatoren; en anden-forkortet som RGR 11-består af RNA-polymerase II-afhængig ADH1-promotor, RGR-strukturen (ribozyme-guide RNA-ribozym), der indeholder to ribozymer (en hammerhead-ribozym-HH og en hepatitis delta-virus ribozym-HDV) og sekvensen af sgRNA / crRNA imellem og ADH1-terminatoren. De sgRNA, der styrer Cas9-homologer, er lavet af en afstandssekvens og den karakteristiske direkte gentagelse 12, mens crRNA'et for Cas12a-proteiner omfatter den direkte gentagelse efterfulgt af afstandssekvensen13,14 (se supplerende tabel 1 for alle DNA-sekvenser, der anvendes i denne undersøgelse).

  1. Design afstandssekvensen til Cas9/Cas12a-medieret transkriptionel aktivering.
    1. Udnyt den bakterielle lexoperatørsekvens (kaldet lexOp) til at være målstedet 15,16, og indsæt den i CYC1-promotoren, der driver ekspressionen af det gærforstærkede grønne fluorescerende protein (yEGFP)17. Derfor er afstandssekvensen defineret af og komplementær til den indsatte lexOp.
  2. Kontroller afstandsstykkesekvensens ortogonalitet via CRISPRDIRECT-værktøjet18.
    1. Indsæt lexOp-sekvensen flankeret af PAM-sekvensen i tekstfeltet, definer PAM-sekvensen som NRG for dCas9 og TTTV for dCas12a, og angiv arten fra rullelisten som spirende gær (Saccharomyces cerevisiae) S288C-genom. Klik på Design. Sørg for, at der ikke er noget matchende målsted i 20mer + PAM eller i 12mer + PAM-søgning.
  3. Konstruer sgRNA/crRNA-ekspressionskassetten.
    1. Brug touchdown PCR til at forstærke DNA-sekvenserne af standard biologiske dele, som promotorer, kodende sekvenser og terminatorer.
      1. Forbered en reaktionsblanding indeholdende: 20-40 ng DNA-skabelon, 1 μL 10 μM fremadgående primer (dvs. ot25, sgRNA / crRNA-ekspressionsplasmidkonstruktion), 1 μL 10 μM omvendt primer (dvs. ot26, sgRNA / crRNA-ekspressionsplasmidkonstruktion), 5 μL 2,5 mM dNTP-blanding, 0,5 μL DNA-polymerase, 10 μL 5x DNA-polymerasereaktionsbuffer, og dobbeltdestilleret vand (ddH2O) op til et samlet volumen på 50 μL.
        BEMÆRK: Se supplerende tabel 2 for en liste over primere, der er anvendt i denne undersøgelse.
      2. Kør touchdown PCR-programmet på en termocyklist:
        Trin 1: 98 °C i 30 sekunder.
        Trin 2 med 10 cyklusser: 98 °C i 10 s, 68 °C i 20 sek. og 72 °C i 15 sek.
        Trin 3 med 25 cyklusser: 98 °C i 10 s, 59 °C i 20 s og 72 °C i 15 s.
        Trin 4: 72 °C i 2 min.
        Til sidst holdes ved 4 °C, indtil opfølgningsforsøgene påbegyndes.
        BEMÆRK: 68 °C i trin 2 og 59 °C i trin 3 afhænger af smeltetemperaturen for både fremadgående og omvendte primere, varierende fra forskellige par primere. Tiden ved 72 °C i trin 2 og 3 bestemmes af PCR-produktets længde og DNA-polymerasens hastighed.
    2. Isoler PCR-produkterne via gelelektroforese (100 V, 30 min). Eluer DNA-sekvenserne fra agarosegelen via et DNA-gelekstraktionssæt (se materialetabel).
      BEMÆRK: Der kræves en 0,8% agarosegel til fragmenter længere end 500 nt, en 1,5% agarosegel til fragmenter mellem 100 nt og 500 nt og en 2% agarosegel til fragmenter kortere end 100 nt.
    3. Indsæt TU, der udtrykker sgRNA / crRNA, i en pRSII404/424 shuttle-vektor19, som indeholder ampicillinresistensgenet og det gærvalgbare auxotrofe markørgen-TRP1.
      1. Rumfærgevektoren fordøjes ved 37 °C i 1 time med de to restriktionsenzymer SacI og Acc65I. Reaktionsblandingen fremstilles ved tilsætning af 5 μg af rumfærgevektoren, de anbefalede mængder enzymer, fordøjelsesbuffer (ifølge enzyminstruktionerne) og ddH2O op til et samlet volumen på 30 μL.
      2. Fordøjelsen af shuttlevektoren kontrolleres ved hjælp af gelelektroforese (se undertrin 1.3.2). Inaktiver derefter de to enzymer ved 65 °C i 20 minutter.
      3. Brug Gibson-samlingsmetode 20 til at indsætte de rensede PCR-produkter i den åbne shuttle-vektor ved at lade den ækvimolære DNA-blanding komme ind ved50 °C i 1 time.
      4. Transformér Escherichia coli DH5α kompetente celler med ovennævnte Gibson-reaktionsblanding via varmechoktransformationsmetoden21. Overfør de transformerede E. coli-celler til Luria-Bertani (LB) agarplader indeholdende ampicillin (0,1 g / l). Sæt pladerne i inkubatoren ved 37 °C og lad cellerne vokse natten over.
      5. Pluk fire kolonier fra LB-agarpladen og dyrk dem separat natten over ved 37 °C i LB-opløsning indeholdende ampicillin (0,1 g / L). Brug derefter mini-forberedelsesproceduren til at ekstrahere plasmider fra E . coli-cellerne22.
      6. Brug primerne ot18 og ot19 (se supplerende tabel 2 for oligosekvenser) til at sekvensere og bekræfte den indsatte transkriptionsenhed via Sanger-metoden23.
        BEMÆRK: I senere forsøg vil de konstruerede og bekræftede plasmider blive indsat i gærgenomet via PEG / LiAc-protokollen24.

2. Design og konstruktion af stilladsets RNA-ekspressionskassette

BEMÆRK: Stilladsguide-RNA'et (scRNA) består af sgRNA-sekvensen og MS2-hårnålestrukturerne25. To slags MS2-hårnålestrukturer bruges i dette arbejde: vildtype MS2-hårnåle-vægt og f6 MS2-pelsprotein (MCP) aptamer-f6.

  1. Syntetiser en scRNA-skabelon, der er i stand til at rumme forskellige afstandssekvenser (dvs. pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev scRNA-skabelonen syntetiseret af et gensyntesefirma (se materialetabel).
  2. Design korrekte primere (se supplerende tabel 2) til at køre PCR på de nødvendige afstandssekvenser.
  3. Følg procedurerne i trin 1.3 for at konstruere en scRNA-ekspressionskassette.

3. dSpCas9 teknik og ekspression plasmid konstruktion

  1. Få plasmidet pTPGI_dSpCas9_VP64 (se materialetabel).
  2. Konstruer acceptorvektoren pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, baseret på pRSII406-shuttlevektoren, via touchdown-PCR og Gibson-samlingsmetoden (se trin 1.3). Plasmidet giver en stærk konstitutiv promotor-pGPD og en terminator-CYC1t.
  3. Det pTPGI_dCas9_VP64 plasmid og den nykonstruerede acceptorvektor (5 μg i 1 time eller 10 μg natten over aftappes med XbaI og XhoI ved 37 °C. Skærfragmentet og acceptorvektoren adskilles og renses som beskrevet i trin 1.3.2.
  4. Det rensede skærfragment og acceptorvektoren fyldes med T4-DNA-ligase ved 16 °C i 8 timer. Forbered ligeringsopløsningen ved at tilsætte 50-100 ng af den rensede acceptorvektor, rensede målfragmenter i ækvimolær mængde med acceptorvektoren, 1,5 μL T4-buffer, 0,5 μL T4-ligase ogddH2Oop til et samlet volumen på 15 μL.
  5. Følg trin 1.3.3.3 og 1.3.3.4. Bekræft derefter, at det nykonstruerede plasmid er korrekt ved fordøjelse med XbaI og Xhol (37 °C, 1 time) og gelelektroforese (se trin 1.3.2).

4. dCas12a teknik og plasmidkonstruktion

  1. Konstruer plasmiderne, der udtrykker dCas12a-AD.
    1. Syntetiser to gærkodonoptimerede dCas12a-proteiner (denAsCas12a og dLbCas12a) flankeret af BamHI- og Xhol-restriktionsenzymsteder.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev de to gærkodonoptimerede dCas12a-proteiner syntetiseret af et gensyntesefirma (se materialetabel).
    2. Konstruer acceptorvektoren pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via touchdown PCR og Gibson-samlingsmetoden (se trin 1.3), hvor "promotoren" enten er pGPD eller pGAL1, "sp" repræsenterer en kort tilfældig sekvens, og "AD" er enten VPR eller VP64.
    3. Indsæt hvert dCas12a-protein i de to nykonstruerede acceptorvektorer via fordøjelse med BamHI og XhoI og ligering med T4 DNA-ligase (se trin 3.3 og 3.4).
  2. Konstruer plasmiderne, der udtrykker en bar dCas12a.
    1. Konstruer en acceptorvektor for de galactoseinducerbare ekspressionskassetter af dCas12a som pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t ved hjælp af touchdown-PCR og Gibson-samlingsmetoden (se trin 1.3).
    2. Fordøje plasmiderne, der indeholder dCas12a-proteinerne og ovenstående acceptorvektor med BamHI og Xhol, og juster dem derefter med T4-DNA-ligase for at få plasmidet pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (se trin 3.3 og 3.4).
    3. Plasmidet opnået i trin 4.2.2 fordøjes med Acc65I og BamHI, og erstat derefter pGAL1 med pGPD via touchdown PCR og Gibson-samlingsmetoden til konstruktion af pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Anti-CRISPR-proteinteknik og plasmidkonstruktion

BEMÆRK: Tre slags promotorer er blevet ansat til at drive Acrs-ekspression: en inducerbar promotor-pGAL1, fire gærkonstitutive promotorer-pGPD, pACT1, pTEF1 og pTEF2 og en syntetisk konstitutiv promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. Få plasmiderne indeholdende sekvenserne af type II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA427 og AcrIIA5 28) og type V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 og AcrVA529) fra et gensyntesefirma.
  2. Konstruer plasmiderne baseret på pRSII403 shuttle-vektoren for at udtrykke Acrs.
    1. Konstruere AcrIIA-udtrykskassetter.
      BEMÆRK: Brug touchdown PCR til at forstærke fire forskellige promotorer (dvs. pGPD, pACT1, pTEF2 og genCYC1t_pCYC1noTATA), de tre slags AcrIIA og to terminatorer (ADH1t og CYC1t). Byg en række TU'er, der udtrykker AcrIIA'er, under forskellige promotorer, via Gibson-samlingsmetoden (se trin 1.3).
    2. Konstruere AcrVA-udtrykskassetter.
      1. Syntetiser acceptorsekvensen: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, hvor "sp" er en tilfældig sekvens, der erstattes af AcrVA'er senere.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse blev acceptorsekvenserne syntetiseret af et gensyntesefirma (materialetabel).
      2. Saml acceptorvektorerne pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, hvor "promotoren" er: pGAL1, pTEF1 og genCYC1t_pCYC1noTATA. Brug Gibson-monteringsmetoden (se trin 1.3).
      3. Indsæt hver af de tre AcrVA'er i acceptorvektoren beskrevet i trin 5.2.2.2 (via touchdown PCR og Gibson-samlingsmetoden [se trin 1.3]) for at opbygge et sæt plasmider, der producerer AcrVA'er.
  3. Yderligere konstruere AcrIIA4 ved at udvide sin sekvens med sekvenserne af GS-linkeren og HBD (hER). Dette tillader opbygning af et β-østradiol-responsivt kredsløb.
    1. Brug touchdown PCR til at hente GS-HBD- og AcrIIA4-dele separat (se trin 1.3.1).
    2. Sæt AcrIIA4, GS-HBD og shuttle-vektoren i Gibson-blandingen, og konstruer det komplette plasmid via Gibson-metoden (se trin 1.3.3).

6. crRNA-detektion: RT-qPCR og primers design

BEMÆRK: crRNA-detektion blev opnået via RT-qPCR, som er organiseret i tre trin.

  1. Udfør RNA-ekstraktion og oprensning fra gærceller via et RNA-kit.
    1. Kulturgærceller natten over i 2 ml syntetisk defineret komplet medium (SDC, 1 liter volumen: 20 g glucose, 2 g AA-blanding, 6,7 g YNB, 396 mg leucin, 79,2 mg tryptophan, 79,2 mg histidin og 79,2 mg Uracil) ved anvendelse af en 24-brøndplade (240 o / min, 30 ° C).
    2. Om morgenen fortyndes cellekulturen (1:100) til 2 ml frisk SDC og fortsætter med at dyrke gærcellerne ved 30 °C, 240 o / min, i yderligere 4 timer.
    3. Hele 2 ml celleopløsning høstes og centrifugeres ved 20.238 x g i 2 min. Supernatanten fjernes forsigtigt, da cellepillen er lille.
    4. Uddrag RNA'et fra gærceller ved hjælp af et RNA-kit.
    5. Kontroller RNA-kvaliteten.
      1. Forbered en 1% agarosegel. Bland 5 μL af hver RNA-prøve med 1 μL DNA-belastende farvestof. Læg derefter blandingen på gelen og kør den.
      2. Sørg for, at to klare bånd ved ~4.000 nt og ~2.000 nt, svarende til ribosomalt RNA (25S/18S), er til stede på gelen. Et yderligere sløret bånd kan ses ved ~ 80 nt for tRNA.
    6. Brug RNA-prøverne straks til cDNA-syntese eller opbevar dem ved -80 °C til fremtidig brug.
  2. Omvendt transkription: Brug stam-loop-metoden 30 til at danne den første streng af cDNA svarende til crRNA (40 nt). For omvendt transkription af sgRNA'et (næsten 100 nt) er proceduren den samme som for cDNA-syntesen af referencegenet ACT1.
    BEMÆRK: Metoden til omvendt transkription af crRNA'et er forskellig fra den, der anvendes med sgRNA og ACT1 mRNA. Da crRNA'et er meget kort, blev det behandlet som et mikroRNA og anvendte microRNA-revers transkriptionsmetode (stem-loop-tilgang) for at opnå det tilsvarende cDNA. To cDNA-syntesesæt (et stam-loop-sæt til crRNA'et og et sædvanligt revers transkriptionssæt til ACT1-genet ) blev anvendt til crRNA-kvantificering. Den samme mængde RNA blev brugt i de to sæt (se materialetabel) for at gøre eksperimentresultaterne sammenlignelige. Den primer, der blev anvendt sammen med stam-loop-sættet, blev designet i henhold til stam-loop-sekvensen og de sidste seks nukleotider i 3'-enden af crRNA'et (for stam-loop- og primersekvensen, se supplerende tabel 2).
    1. Stem-loop metode til crRNA revers transkription
      1. Tag RNA-skabelonen, primeren og bufferne ud af fryseren og lad dem smelte på is.
      2. Genomisk DNA-fjernelse: Forbered først 10 μL af reaktionsblandingen i henhold til kitinstruktionerne. Sæt blandingen i en termisk cyklist ved 42 °C i 2 min. Overfør det til sidst til is.
      3. Syntese af den første cDNA-streng: Der fremstilles 20 μL af reaktionsblandingen ved tilsætning af 10 μL af blandingen fra trin 6.2.1.2, 1 μL stængelsløjfeprimer (2 μM koncentration), 2 μL 10x RT-reaktionsbuffer, 2 μL revers transkriptionsenzymblanding (indeholdende revers transkriptase) og 5 μL RNasefriH2O.
      4. Anbring reaktionsblandingen i en termisk cyklist, og kør følgende program: 25 °C i 5 minutter, 50 °C i 15 minutter og 85 °C i 5 minutter. Brug straks produktet til qPCR-reaktionen, eller opbevar det ved -80 °C.
    2. sgRNA og ACT1 mRNA revers transkription
      1. Første reaktion: Forbered en 13 μL blanding bestående af primerblandingen, dNTP-blandingen, RNA-skabelonen (50 pg-5 μg) og RNase-frit vand (bortset fra RNA-skabelonen, alt leveret af sættet) i henhold til kitinstruktionerne. Brug 1 μg RNA-skabelon. Sæt blandingen i en termisk cyklist ved 70 °C i 10 minutter.
      2. Anden reaktion (cDNA-syntese): Reaktionsblandingen fremstilles ved at tilsætte reagenserne (som beskrevet i kitinstruktionerne) til 13 μL af den første reaktionsopløsning op til et slutvolumen på 20 μL. Blandingen anbringes i en termisk cyklist i 15 minutter ved 50 °C og derefter i yderligere 5 minutter ved 85 °C. Brug straks produktet til qPCR-reaktionen, eller opbevar det ved -80 °C.
  3. SYBR-sæt til qPCR: Registrering af Ct-værdi
    BEMÆRK: Den omvendte primer, der anvendes i qPCR af crRNA'et, er fast, fordi den svarer til det omvendte komplement af stam-loop-sekvensen (se supplerende tabel 2). Den fremadrettede primer er derimod variabel og afhænger af sekvensen af crRNA'et. De fremadgående og omvendte primere til sgRNA og ACT1 mRNA qPCR er designet til https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Der vælges to primere, når forskellen mellem deres smeltetemperaturer ikke er større end 2 °C (se supplerende tabel 2). Hver prøve måles i tre replikater.
    1. Forbered qPCR-reaktionsblandingen i henhold til producentens anvisninger til SYBR-sættet.
    2. Indstil følgende qPCR-program i en PCR-maskine i realtid.
      Forinkubation: 10 min ved 95 °C.
      PCR-stadie: 15 s ved 95 °C efterfulgt af 34 s ved 55 °C. Indstil PCR-trinnets cyklus til 45 gange. Smeltestadium: 10 s ved 95 °C, efterfulgt af 60 s ved 65 °C og endelig 1 s ved 97 °C.
    3. Beregn de relative mRNA-ekspressionsværdier via Pfaffl-formlen31.

7. Immunofluorescens til påvisning af Cas-proteiner

BEMÆRK: Cas-proteiner (CasP) smeltes sammen til en His_tag.

  1. Gærcelle forberedelse
    1. Pluk nogle gærceller ved hjælp af en steril sløjfe og dyrk dem i 5 ml YPD-rig medium natten over ved 240 o / min ved 30 ° C. Om morgenen tilsættes 500 μL af celleopløsningen til 20 ml frisk YPD og dyrkes ved 240 o / min ved 30 ° C, indtil OD600 når 0,6.
    2. Tag 5 ml af kulturen og bland den med 500 μL 37% formaldehyd. Lad blandingen forblive ved stuetemperatur (RT) i 10 min. Høst cellerne ved centrifugering ved 1.500 x g i 5 min.
    3. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes med 1 ml bindingsbuffer (0,1 MKH2PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7% formaldehyd, pH = 6,5). Opbevar celleopløsningen ved RT i 20 min.
    4. Centrifuger celleopløsningen ved 1.500 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 1 ml vaskebuffer (0,1 MKH2PO4, 1,2 M sorbitol, pH = 6,5) suppleret med 4 μL beta-mercaptoethanol og 4 μL lysatopløsning (5 mg/ml). Celleopløsningen anbringes i en inkubator ved 37 °C i 20 minutter.
    5. Celleopløsningen centrifugeres ved 1.500 x g i 5 minutter og supernatanten kasseres. Cellepillen vaskes to gange med 1 ml PBS ved centrifugering (1.500 x g i 5 min).
    6. Resuspender cellerne i 100 μL PBS plus 0,05% Tween 20 og tilsæt 4 μL BSA-opløsning (10 mg/ml). Opbevar celleopløsningen ved RT i 20 min.
  2. Inkubation med primært antistof
    1. Der tilsættes Anti-His tag primært antistof til blandingen i trin 7.1.6 ved en 1:400 fortynding. Opbevar opløsningen ved RT i 2 timer.
    2. Centrifuger blandingen i trin 7.2.1 ved 1,500 x g i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Tilsæt 1 ml PBST og centrifuger (1.500 x g) i 5 minutter for at vaske cellepelleten. Gentag denne operation to gange. Til sidst kasseres supernatanten, og cellerne suspenderes i 100 μl 1x PBST.
  3. Detektering af mikroskopiceller
    1. Monter cellerne på et dias; Der udtages 2 μL af celleopløsningen fra trin 7.2.2, og den anbringes på et glasglas. Dæk det med en dæksel.
    2. Overhold cellerne under et fluorescensmikroskop. Tænd lyskilden, mikroskopet og computeren. Skriv nummeret på lysstofrør ned, og åbn mikroskopsoftwaren på computeren.
    3. Sæt diaset på mikroskopstadiet. Vælg 40x objektivobjektivet, og observer cellerne under grønt lys (550 nm). Flyt den grove fokusknap, indtil gærcellernes kontur vises. Flyt finfokusknappen for at fokusere cellerne.
    4. Registrer cellerne med mikroskopsoftwaren. Luk mikroskopets synsfelt og skift til computerskærmen. Klik på Live, vent i 3-5 sekunder, og klik på Capture for at tage et billede. Gem billedet.
    5. Sluk computeren, mikroskopet og lyskilden.

8. Dataindsamling: FACS

BEMÆRK: Grøn fluorescens detekteres via flowcytometri (dvs. fluorescensaktiverede cellesorteringsmålinger [FACS]). Gærceller dyrkes generelt ved 30 ° C og 240 o / min for at køre FACS-eksperimenter. Celler kan dog kræve nogle forholdsregler afhængigt af deres genetiske indhold. Celler, der indeholder dCas12a-VPR-genet (kontrolleret af GPD-konstitutiv promotor), skal dyrkes i 24 timer i SDC-opløsningen. Derefter fortyndes cellerne i et forhold på 1:100 i frisk SDC og dyrkes i yderligere 12 timer, før fluorescensintensiteten måles. Celler modificeret med AcrIIA4-HBD (hER) genet kræver også fortynding. Desuden skal OD600 kontrolleres. For det første får cellerne lov til at vokse i SDC natten over (over 14 timer). Om morgenen måles OD600 . Derefter fortyndes kulturen i SDC, forsynet med en forskellig koncentration af β-østradiol, ned til OD600 = 0,1. Før FACS-eksperimenter dyrkes cellerne i yderligere 7 timer, således at OD600 når 0,8-1,0. Celler, der udtrykker dCas9-VP64 eller dCas12a-VP64, dyrkes i SDC i 20-24 timer uden fortynding og yderligere vækst før målingerne ved FACS-maskinen.

  1. Tænd FACS-maskinen 20 minutter før målingerne for at varme laseren op.
  2. Prøverne fremstilles (fortynding): 20 μL af cellekulturen blandes med 300 μLddH2O.
  3. Kør FACS-softwaren på den computer, der er tilsluttet FACS-maskinen, og opret et nyt eksperiment. Indstil måleparametrene (dvs. FSC(SSC)-A/H/W og histogram).
  4. Vælg filteret i henhold til prøvernes excitations- og emissionsbølgelængder. For eksempel er målproteinet her yEGFP, hvis excitations- og emissionsbølgelængder er henholdsvis 488 nm og 507 nm. Så vælg FITC- eller GFP-filteret (excitationsbølgelængde: 488 nm; emissionsbølgelængde: 527/32 nm). Angiv anskaffelsescellenummeret til 10.000.
  5. Juster FITC-filterspændingen ved at måle intensiteten af fluorescerende perler. Sørg for, at den relative forskel i perlernes intensitet mellem to på hinanden følgende forsøg ikke overstiger 5%.
  6. Vask maskinen med ddH2O i et par sekunder for at fjerne eventuelle overskydende perler.
  7. Prøvens fluorescensintensitet måles. Klik på Preview og vent i 3-5 s for prøveinjektionsstabilitet. Klik til sidst på Erhverv.
  8. Mål perlerne igen i slutningen af eksperimentet. Spændingen er den, der blev brugt under målingen af de indledende perler (se trin 8.4, 438-441 V). Kontroller, om den relative forskel mellem de to perlers mål overstiger 5%.
  9. Eksporter FACS-dataene som FCS-filer.
  10. Analyser FCS-filerne med R Studio-softwaren.

9. Analyse af data

BEMÆRK: Brug Flowcore R Bioconductor-pakke 32 i R-studiet. De FCS filer blev analyseret ved hjælp af et script skrevet i R sprog.

  1. Åbn R-studiet, og indlæs scriptet Bdverse-analyse. R for at analysere FCS-filerne.
  2. Indstil eksperimentnavnet (ename), den mappe (sti), hvor FCS-filerne er
    Gemt (dir_d), og hvor resultatfilerne oprettes (dir_r).
  3. Indstil fluorescenskanalen. For eksempel select_ch = "GPA-A", hvis grøn fluorescens blev målt.
  4. Indstil antallet af prøver, der blev målt (s_num).
  5. Indstil dimensionerne på hvert prikplot (sxlim, sylim). Indstil den maksimale længde af x- og y-aksen for søjlediagrammer og boksplots (xlimit, ylimit). xlimit skal være større end eller lig med s_num.
  6. Vælg gating-metoden ved at fjerne # fra de tilsvarende linjer.
    BEMÆRK: morphGate er en automatisk gating-metode, der udføres af scriptet (dvs. området af prikplottene, hvor cellerne er tættere, genkendes og vælges af programmet). polygonGate og rektangelGate kræver at se på prikplottene og definere enten hjørnerne af en polygon eller siden af et rektangel, der omfatter den zone, hvor de fleste celler ligger.
  7. Vælg flowSet-objektet gated, der svarer til den valgte gating-metode. Vælg punktplotopløsningen (res; skal være mindst lig med 256).
  8. Fjern kommentarer flt_low <- filter_low (sp) for at fjerne målinger, hvor fluorescens er negativ. Fjern kommentarer flt_sp <- filter(flt_lw) for at fjerne afvigende værdier på grund af andre eksperimenter.
  9. Tryk på Kilde , og kør scriptet. Alle filer, der indeholder resultaterne fra analysen, oprettes i dir_r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

sgRNA/crRNA-ekspression af en promotor af RNA-polymerase III-typen
For det første omhandlede dette arbejde konstruktionen af transkriptionelt aktiveringskredsløb (kredsløb 1) vist i figur 1A. Den indeholdt tre grundlæggende komponenter: 1) genet, der koder for yEGFP (indberetteren), som blev efterfulgt af en række forskellige syntetiske promotorer, der leverede målsteder for dCas9/dCas12a-AD; 2) en gærkodonoptimeret version af dCas9 eller dCas12a fusioneret til et aktiveringsdomæne (henholdsvis VP64 og VPR) og indeholdende enten en eller to nukleare lokaliseringssekvenser (NLS'er). Begge dCas-proteiner blev produceret af en stærk konstitutiv promotor-pGPD; og 3) en sgRNA/crRNA-sekvens, der guidede dCas9/dCas12a-AD til målstederne. Aktiveringseffektiviteten af dCas9/dCas12a-baserede aktivatorer blev visualiseret og reflekteret af indberetterens fluorescensintensitet (målt via FACS-eksperimenter).

Et dCas9-protein (dSpCas9) og to dCas12a-proteiner (denAsCas12a og dLbCas12a) blev testet. En 3,36 gange aktivering blev opnået med dSpCas9 forlænget ved sin C-endestation med VP64 AD og binding af en syntetisk promotor opstrøms for yEGFP indeholdende seks kopier af lexOp-målstedet. SegRNA'et blev anbragt i en integrativ shuttle-vektor og transskriberet af den RNA-polymerase III-afhængige SNR52-promotor ( SNR52i-konfiguration , se figur 1B). I tilfælde af dCas12a returnerede denAsCas12a-VPR den højeste aktivering (4,45 gange) fra en syntetisk promotor med tre operatører, når crRNA'et blev udtrykt via SNR52i-konfigurationen (figur 1C). Under de samme betingelser opnåede dLbCas12a-VPR sin bedste fluorescensforbedring (3,21 gange) (figur 1D). Det skal bemærkes, at sammenligningsudtrykket i hvert eksperiment var et kredsløb, hvis sgRNA / crRNA ikke kunne binde lexoperatørerne.

Multicopyplasmider er ikke nødvendige
SNR52i sgRNA-ekspressionskassetten blev erstattet med en RGR-struktur udtrykt af en moderat stærk promotor-pADH1. I både dCas9- og dCas12a-tilfælde syntes aktivering i nærvær af et sgRNA/crRNA genereret ved selvspaltning af RGR imidlertid sammenlignelig med eller endda lavere end den, der blev opnået med et sgRNA/crRNA produceret via SNR52i, på trods af at pSNR52 blev betragtet som en svag promotor (se figur 1C,D for de første resultater opnået med dCas12a).

For yderligere at undersøge sammenhængen mellem sgRNA/crRNA-mængde og aktiveringseffektivitet blev de to sgRNA/crRNA-ekspressionssystemer indsat i et episomalt plasmid, som kan optages af cellen i 10-40 kopier og generere en større mængde sgRNA/crRNA. Som vist i figur 2A var aktiveringen af crRNA placeret på et integrativt plasmid (enten SNR52i eller RGRi) 1,4 til 2,4 gange højere end det, der opnås, når det samme crRNA blev udtrykt af et episomalt plasmid (enten SNR52m eller RGRm). Tendensen blev bekræftet af sgRNA'et. I dette tilfælde garanterede det integrative plasmid en 1,1 til 1,5 gange højere aktivering (figur 2B). For at udelukke, at resultaterne var forårsaget af et tab af de episomale plasmider, blev RT-qPCR udført for at kvantificere den relative forekomst af sgRNA/crRNA in vivo. Resultaterne i figur 2C,D bekræftede, at den episomale vektor producerede et meget højere niveau af sgRNA / crRNA end den integrative vektor, uanset ekspressionssystemet (RGR eller SNR52). Disse resultater viste, at SNR52-systemet kunne fungere endnu bedre end RGR-systemet, og en højere mængde sgRNA/crRNA i cellen garanterede ikke en højere aktivering af CRISPR-Cas-systemet. Derfor bør episomale plasmider ikke anvendes til konstruktion af gendigitale kredsløb, hvor dCas9/dCas12a-AD anvendes.

Stillads RNA teknik
Et scRNA blev konstrueret ved at udvide sekvensen af et sgRNA med MS2-hårnålestrukturer, der gjorde det muligt at rekruttere VP64 AD, når det blev smeltet sammen med MS2-pelsproteinet (MCP, se figur 3A). På denne måde var ingen konstruktion af eller ændringer af dCas9 nødvendig. To MS2-varianter blev forsøgt: wt og f6. ScRNA'et indeholdende den enkelte MS2 hårnål-1×MS2(wt) og 1×MS2(f6)-gav henholdsvis en 5,27 gange og en 4,34 gange aktivering. Imidlertid returnerede scRNA'et med en kombination af de to hårnåle - 2 × MS2 (wt + f6) - den samlede højeste aktivering i denne undersøgelse (7,54 gange, se figur 3B). Disse resultater viste, at konstruktion af et scRNA var langt mere effektivt end at fusionere aktiveringsdomæner direkte til dSpCas9.

Boolsk gate baseret på Acr-proteiner
For yderligere at kontrollere og indstille transkriptionel aktivering af CRISPR-Cas-systemer blev kredsløb 1 modificeret med indsættelsen af en fjerde TU til ekspression af anti-CRISPR-proteiner (se figur 4A for AcrIIA'er og figur 5A for AcrVA'er). Efter at have vist, at Acrs var effektive i S. cerevisiae i modsætning til aktiveringen på grund af dCas9 / dCas12a-AD, blev der bygget et nyt kredsløb (se figur 5D) for at teste AcrVA-virkning på dCas12a-baserede repressorer (et tidligere arbejde33 havde allerede vist, at AcrIIA'er kunne hæmme dCas9-baseret gennedregulering). De nye, Acr-holdige små netværk fungerede som simple boolske porte (JA og IKKE), hvilket kunne føre til en restyling af inputlaget i mere komplekse syntetiske gendigitale kredsløb.

AcrIIA4 er en stærk hæmmer af dSpCas9
Fire forskellige promotorer med forskellige styrker blev brugt til at drive udtrykket af tre slags AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 og AcrIIA5. Resultaterne viste, at de tre AcrII'er virkede på en dosisafhængig måde i S. cerevisiae. Når de blev udtrykt af en stærk promotor-pGPD-reducerede de fluorescensniveauet nået af dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt + f6)-MCP-VP64 til henholdsvis 0,21, 0,11 og 0,13 af dets værdi (figur 4B). Da AcrIIA4 var den eneste, der forårsagede høj hæmning af fluorescensekspression, selv når den blev produceret af en svag, syntetisk promotor genCYC1t_pCYC1noTATA, kunne vi udlede, at AcrIIA4 var den stærkeste hæmmer blandt de tre AcrII'er. Derefter blev HBD (ER) smeltet sammen med C-terminalen på AcrIIA4 for at bygge en β-østradiolsensorenhed (se figur 4C). I nærvær af østrogen β-østradiol kunne AcrIIA4-HBD (ER) translokere ind i kernen og derefter neutralisere funktionen af den dSpCas9-baserede aktivator. Titreringskurven i figur 4D viser, at kredsløbet opfører sig som en NOT-port med et ON/OFF-forhold, der nærmer sig 2,3.

AcrVA'er er undertrykkere af dCas12a-proteiner
En NOT-port blev designet og bygget ved at indsætte den pGAL1-drivende AcrVA-ekspressionskassette i kredsløb 1. På denne måde kunne AcrVA-syntese og den deraf følgende undertrykkelse af dCas12a-AD induceres af galactose (figur 5A). Som vist i figur 5B,C hindrede AcrVA1 både denAsCas12a og dLbCas12a som aktivatorer ved at reducere fluorescensekspression fra 19% til 71%, afhængigt af kredsløbsskemaet. AcrVA4 og AcrVA5 kan ikke foretage sig noget på denAsCas12a34. De udførte imidlertid en stærk hæmning af dLbCas12a-baserede aktivatorer ved at reducere fluorescensekspression op til 84% (AcrVA5) og 82% (AcrVA4). I det store og hele viste AcrVA5 sig at være den mest pålidelige blandt disse tre AcrVA'er til at hæmme dLbCas12a-baserede aktivatorer, fordi den garanterede i forskellige kredsløb højere end 70% undertrykkelse.

AcrVA1-virkningen er koncentrationsafhængig
Forholdet mellem AcrVA'ernes in vivo-koncentration og deres hæmmende virkninger på både aktivatorer og repressorer baseret på denAs/dLbCas12a blev også undersøgt. Til dette formål blev hver AcrVA udtrykt under forskellige promotorer: den stærke pGAL1, den mellemstærke pTEF1 og den svage genCYC1t_pCYC1noTATA. Som illustreret i figur 5E viste AcrVA1 store udsving i sin præstation afhængigt af promotoren, der førte dens syntese. AcrVA1 fungerede kun rimeligt godt, når den blev produceret af pGAL1. Under pTEF1 og genCYC1t_pCYC1noTATA viste AcrVA1 kun en vis undertrykkelse på den blotte dLbCas12a. AcrVA4 og AcrVA5 syntes derimod at være mindre følsomme over for deres koncentration, især når de interagerer med den blotte dLbCas12a.

Disse data viste, at AcrVA4 og AcrVA5 generelt klarede sig bedre end AcrVA1 til at hæmme dLbCas12a-baserede transkriptionsfaktorer i S. cerevisiae. Det skal bemærkes, at AcrVA5 har en ejendommelig arbejdsmekanisme, da den virker som et enzym, der ændrer LbCas12a permanent. Som nævnt ovenfor kan AcrVA5 (sammen med AcrVA4) imidlertid ikke interagere med denAsCas12a.

Når AcrVA'er blev udtrykt under pGAL1, bliver kredsløb enten YES-porte (dCas12a blev smeltet sammen med en AD) eller IKKE porte (bare dCas12a). Førstnævnte så alle meget effektive ud, mens sidstnævnte syntes at fungere bedre i nærværelse af AcrVA4 eller AcrVA5.

Figure 1
Figur 1: Transskriptionel aktivering medieret af dCas9/dCas12a-AD. (A) Diagram over kredsløb 1. De syntetiske promotorer af yEGFP indeholdt seks (6x) og tre (3x) kopier af målsteder for henholdsvis dCas9 eller dCas12a. Derefter kombineres dCas9 / dCas12a-AD med sgRNA / crRNA; Den syntetiske promotor er målrettet og aktiveret på grund af tilstedeværelsen af aktiveringsdomænerne. (B) Den bedste aktiveringseffektivitet af dSpCas9-VP64 blev opnået, da der var seks lexOp-målsteder på den syntetiske promotor, og sgRNA'et blev transskriberet af SNR52i. (C,D) Den højeste aktiveringseffektivitet af dCas12a-VPR blev opnået, når tre kopier af lexOp blev indsat i den syntetiske promotor, og crRNA'et blev genereret af SNR52i. SNR52i betyder, at sgRNA/crRNA blev produceret af pSNR52, og ekspressseksionskastelten blev placeret inde i en integrativ shuttlevektor. RGRi betyder, at der blev anvendt et integrativt plasmid, der var vært for RGR-kassetten til at udtrykke sgRNA / crRNA. Den negative kontrol, "-", repræsenterer et sgRNA/crRNA, der indeholder en krypteret afstandssekvens, der ikke stemmer overens med lexOp-stedet eller med nogen sekvens langs gærgenomet. "bA" indikerer, at sgRNA / crRNA binder antisensestrengen af mål-DNA, mens "bS" står for binding af sansstrengen. Hvert fluorescensniveau repræsenterer middelværdien fra mindst tre uafhængige eksperimenter (dvs. udført på forskellige dage). Fejlbjælker er standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligningen af integrativ og episomale plasmidproducerende sgRNA/crRNA. (A) Aktiveringseffektivitet af dLbCas12a-VPR:crRNA, når der målrettes mod et enkelt sted på promotoren opstrøms for yEGFP. (B) dSpCas9-VP64: sgRNA aktiveret n× syntetisk promotor ("n" står for antallet af lexOp-målsteder). (C,D) Normaliseret sgRNA/crRNA ekspressionsniveau15,16. "i" betyder, at sgRNA/crRNA-ekspressionskassetten blev anbragt i en integrativ shuttle-vektor, mens "m" står for multicopy (dvs. episomal) plasmid. "bA"/"bS" indikerer, at sgRNA/crRNA binder DNA'ets antisense/sense-streng. "ctrl" er en negativ kontrol, hvor et krypteret sgRNA/crRNA blev udtrykt. Hvert fluorescensniveau repræsenterer middelværdien fra mindst tre uafhængige eksperimenter (dvs. udført på forskellige dage). Fejlbjælker er standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Aktiveringseffektiviteten af den blotte dSpCas9 i kompleks med et scRNA. (A) Det skematiske diagram over interaktionerne mellem scRNA, MCP-VP64 og den blotte dSpCas9 16. Den hættelignende struktur i lilla repræsenterer MCP (MS2 coatprotein). En MS2-hårnål (den lilla struktur i scRNA'et) kan rekruttere og binde to kopier af MCP. Således muliggør et scRNA ikke kun DNA-binding ved dSpCas9, men også aktivering af genekspression gennem rekruttering af MCP-VP64. (B) Aktiveringseffektiviteten af dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. Tre slags scRNA blev testet: en med vildtypen MS2 hårnål-1×MS2 (wt), en anden konstrueret med f6 MCP aptamer-1×MS2 (f6) og den sidste indeholdende begge hårnåle-2×MS2 (wt + f6), som viste sig at være den mest effektive. Hvert fluorescensniveau repræsenterer middelværdien fra mindst tre uafhængige eksperimenter (dvs. udført på forskellige dage). Fejlbjælker er standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: AcrIIA-relaterede kredsløb og resultater. (A) AcrIIA-udtrykskassetten blev indsat i kredsløb 1. Denne ekstra TU inkluderer pGPD, der fører udtrykket af AcrIIA'er for at modvirke dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64. (B) Hæmningseffektiviteten af AcrIIA'er på den bedste dSpCas9-baserede aktivator i figur 3B. Den sorte stiplede linje repræsenterer fluorescensen i nærvær af den dSpCas9-baserede aktivator. Tallene over hver kolonne viser hæmningseffektiviteten beregnet som OFF/ON-forholdet (dvs. fluorescensniveauet ved tilstedeværelse af AcrIIA divideret med fluorescensen i fravær af AcrIIA). I legenden øges styrken af de fire konstitutive promotorer gradvist fra op til ned. C) Diagram over β-østradiolsensoranordningen (NOT gate), der udtrykker AcrIIA4-HBD(hER). D) Titreringskurve for kredsløbet i (C)16. Den grønne kurve refererer til ændringen i fluorescens i det funktionelle kredsløb. Den sorte kurve blev afledt af stammen uden ekspression af AcrIIA4-HBD(hER)-den negative kontrol. Den stiplede linje i gråt markerede fluorescensplateauet ved ligevægten. Det blev beregnet som gennemsnittet af fluorescensværdierne ved koncentrationer af β-østradiol, der ikke var lavere end 125 nM. Hvert fluorescensniveau repræsenterer middelværdien fra mindst tre uafhængige eksperimenter (dvs. udført på forskellige dage). Fejlbjælker er standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: AcrVA-relaterede kredsløb og resultater. (A) AcrVA-udtrykskassetten blev indsat i kredsløb 1. Den nye TU indeholder den inducerbare promotor pGAL1 opstrøms for AcrVA-generne, der neutraliserer dCas12a-AD's funktion. Det nye kredsløb er en Du må IKKE port reguleret af galactose. (B,C) Resultater fra den galactose-responsive NOT gate in (A). Her driver pGAL1 syntesen af AcrVA'er, som derefter interagerer med dCas12a-AD15. Den relative fluorescens svarer til OFF/ON-forholdet. (D) Galactose-responsiv JA gate. Det anvender AcrVA'er under kontrol af pGAL1 og den blotte dCas12as, der undertrykker syntesen af yEGFP. E) Sammenligning af AcrVA'ers hæmningseffektivitet udtrykt af initiativtagere med forskellig styrke15. Grupperne "AcrV effekter på undertrykkelse" og "bare dLb" henviser til kredsløbet i (D). Grupperne "AcrV-effekter på aktivering" og "dLb-VPR" er resultaterne af NOT-porten i (A). Hvert fluorescensniveau repræsenterer middelværdien fra mindst tre uafhængige eksperimenter (dvs. udført på forskellige dage). Fejlbjælker er standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: En liste over alle DNA-sekvenser, der er anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: En liste over primere, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfiler: R-studiescriptet til analyse af FCS-filerne. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen viste en mulig komplet arbejdsgang for syntetiske gendigitale kredsløb efter "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologisk ingeniørcyklus og vedrørende både tørlaboratorie- og vådlaboratorieeksperimenter. Her fokuserede vi på CRISPR-Cas-systemet, hovedsageligt dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a og de tilsvarende anti-CRISPR-proteiner, ved at designe og bygge i S. cerevisiae små transkriptionelle netværk. Nogle af dem efterlignede boolske porte, som er de grundlæggende komponenter i digitale kredsløb. Alle kredsløb beskrevet her tillod os at skildre egenskaberne og funktionerne af CRISPR-associerede og anti-CRISPR-proteiner i S. cerevisiae. Disse resultater er afgørende for at inkludere disse proteiner i ordningen med genets digitale kredsløb.

DBTL-konceptet giver en ramme inden for syntetisk biologi, mens mange optimeringer og forbedringer skal foretages efter test af en ny artefakt. For eksempel var der i kredsløb 1 oprindeligt kun ét målsted (en kopi af lexOp) for dCas9/dCas12a-AD på den syntetiske promotor opstrøms yEGFP. Efter at have testet denne kredsløbskonfiguration fandt vi, at den ikke kunne opnå mere end en dobbelt aktivering15,16. Derefter antog vi, at ved at øge antallet af kopier af lexOp, som i7, kunne vi nå en højere transkriptionel aktivering. Faktisk blev et højere fluorescensniveau opnået ved at anvende tre til seks lexOp-steder (figur 1). Desuden forbedrede vi yderligere ydeevnen for kredsløbene, der er vært for dSpCas9, ved at konstruere et scRNA, hvilket er lettere end at fusionere en eller flere AD'er til et stort protein som dSpCas9 (figur 3). Ved at bruge en promotor med forskellige styrker til at producere de tre AcrIIA'er, som vi valgte, konkluderede vi desuden, at AcrIIA4 var den stærkeste hæmmer blandt dem. Således byggede vi en ny NOT-port, der reagerer på β-østradiol ved at fusionere HBD (ER) til AcrIIA4 og udnytte den stærke undertrykkelse af AcrIIA4 på vores bedste dSpCas9-baserede aktivator (figur 4).

På samme måde karakteriserede vi dybt både arbejdet med denAsCas12a og dLbCas12a i gær og deres interaktioner med tre AcrVA'er (figur 5). For hvert dCas12a-AcrVA-par byggede vi en NOT (dCas12a blev smeltet sammen med en AD) og en JA (bare dCas12a) port, der reagerede på galactose. I det hele taget resulterede dLbCas12a sammen med AcrVA5 i det bedste system til beregning af enkle logiske funktioner.

Den metode, der er beskrevet her, præsenterede nogle kritiske trin. Alle protein-DNA-sekvenser blev gærkodonoptimeret for at sikre højere ekspression i S. cerevisiae. For at undgå uspecifikke mål for dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a i S. cerevisiae-genomet valgte vi en bakteriel operatør som lexOp. Desuden viste stammer indeholdende GAL1-promotoren en signifikant vækstforsinkelse, der kunne begrænse anvendeligheden af pGAL1 til syntetiske genkredsløb15.

Nogle ændringer kunne også bringes til nogle trin i den overordnede metode. For at forbedre effektiviteten af fordøjelsesligeringsproceduren foretrækkes det at fordøje 10 μg (natten over) af både det insertholdige plasmid og acceptorvektorerne snarere end kun 5 μg i 1 time. På denne måde opnås en højere DNA-koncentration efter elueringstrinnet. Tiden for T4-ligering bør forlænges fra 1 time (fabrikantens protokol) til 8 timer. Endelig skal stammer, der indeholder dCas12a-VPR-fusionsproteinet, fortyndes efter en 24 timers kultur og dyrkes i yderligere 12 timer, før der køres et FACS-eksperiment. Under denne betingelse er variabiliteten blandt fluorescensniveauerne fra forskellige celler ikke længere for høj, og en acceptabel standardafvigelse ledsager middelværdien af fluorescensintensiteten over en cellepopulation.

Sammenfattende forklarede denne protokol, hvordan man forenkler designet af genets digitale kredsløb ved at gøre brug af dCas-proteiner og muligvis anti-CRISPR-proteiner. Endnu vigtigere viste vi detaljeret, hvordan disse familier af proteiner fungerer i S. cerevisiae , og hvilke af dem der er mest lovende for en fremtidig brug inden for digitale netværk. Et uløst problem er koblingen af CRISPR-dCas/anti-CRISPR-systemer og kemikalier, som repræsenterer kredsløbsindgange og ikke direkte kan binde dCas-proteiner eller anti-CRISPR'er. Her omgik vi problemet ved at bruge enten den inducerbare GAL1-promotor eller HBD (ER), der er knyttet til AcrIIA4. Imidlertid er en måde at generalisere arkitekturen af kredsløbsinputlaget nødvendigt for at designe syntetiske gendigitale kredsløb til forskellige bioengineering-områder såsom metabolisk teknik, biosyntese, biosensing, biodiagnostik og bioremediering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke alle studerende på Synthetic Biology lab-SPST, TJU-for deres generelle hjælp, sammen med Zhi Li og Xiangyang Zhang for deres hjælp i FACS-eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).
  2. Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
  3. Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
  4. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  5. Drinnenberg, I. A., et al. RNAi in budding yeast. Science. 326 (5952), 544-550 (2009).
  6. Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459 (2017).
  7. Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
  8. Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).
  9. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
  10. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  11. Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  15. Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
  16. Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
  17. Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  19. Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
  20. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  21. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  23. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).
  24. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  25. Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
  26. Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).
  27. Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
  28. Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
  29. Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
  30. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  32. Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).
  33. Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).
  34. Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).

Tags

Retraktion udgave 188 CRISPR-Cas-system dSpCas9 denAsCas12a dLbCas12a type II-A anti-CRISPR-proteiner type V-A anti-CRISPR-proteiner gendigitale kredsløb Saccharomyces cerevisiae syntetisk biologi
Gen digitale kredsløb baseret på CRISPR-Cas systemer og anti-CRISPR proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A.… More

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter