Summary
Antibiotisk persistens beskriver små subpopulationers evne inden for en følsom isogen population til forbigående at tolerere høje doser bakteriedræbende antibiotika. Denne protokol kombinerer tilgange til at karakterisere antibiotisk persistensfænotype på molekylært og cellulært niveau efter udsættelse af Escherichia coli for dødelige doser ofloxacin.
Abstract
Antibiotisk persistens refererer til kapaciteten hos små bakterielle subpopulationer til forbigående at tolerere høje doser bakteriedræbende antibiotika. Ved bakteriedræbende antibiotikabehandling dræbes størstedelen af bakteriepopulationen hurtigt. Denne første hurtige fase af drab efterfølges af et betydeligt fald i drabshastigheden, da de vedvarende celler forbliver levedygtige. Klassisk bestemmes persistens på populationsniveau ved tids-/drabsassays udført med høje doser antibiotika og for definerede eksponeringstider. Mens denne metode giver information om niveauet af persisterende celler og den dræbende kinetik, afspejler den ikke den iboende celle-til-celle-heterogenitet, der ligger til grund for persistensfænomenet. Den her beskrevne protokol kombinerer klassiske tids-/drabsanalyser med enkeltcelleanalyse ved hjælp af fluorescensmikroskopi i realtid. Ved at bruge passende fluorescerende reportere kan mikroskopibilleddannelse af levende celler give information om virkningerne af antibiotika på cellulære processer, såsom kromosomreplikation og adskillelse, celleforlængelse og celledeling. Kombination af populations- og enkeltcelleanalyse muliggør molekylær og cellulær karakterisering af persistensfænotypen.
Introduction
Denne protokol har til formål at analysere den bakterielle persistensfænotype som reaktion på specifik antibiotikabehandling på enkeltcelle- og populationsniveau. Persistens beskriver kapaciteten hos små subpopulationer inden for en isogen population til at udholde høje doser bakteriedræbende antibiotika (fluorquinoloner, aminoglycosider, β-lactamer osv.), Hvor den minimale hæmmende koncentration (MIC) af de såkaldte persisterceller er identisk med størstedelen af befolkningen. Bifasisk drabsdynamik, når man måler bakteriel overlevelse over tid i nærvær af et antibiotikum, afslører tilstedeværelsen af forbigående lægemiddeltolerante celler med en indledende hurtig udryddelse af de ikke-persisterende celler efterfulgt af en meget langsommere drabshastighed for de persisterende celler. Ved fjernelse af antibiotika giver disse celler anledning til en genetisk identisk population, der udviser lignende dræbende dynamik, når de behandles med det samme antibiotikum 1,2. I modsætning til persistens defineres antibiotikaresistens på populationsniveau og er generelt en konsekvens af enten de novo-mutationer eller horisontal genoverførsel af et resistensgivende plasmid3. Mens de mutationer, der er ansvarlige for resistens, for det meste er placeret i lægemidlets mål eller i de promotoriske regioner af lægemiddeludstrømningspumperne, har gener, der ændrer persistensfrekvensen identificeret ved genomdækkende og målrettede mutantanalysemetoder, vist sig at være talrige og forskelligartede 2,3,4,5,6,7,8 . Derfor er det sandsynligt, at bakterieceller kan komme ind i persistertilstanden gennem flere veje 9,10,11, og tilgange til at undersøge persistensfænomenet på enkeltcelleniveau er nødvendige for at karakterisere fysiologien af disse persisterende celler.
Den nylige udvikling af mikrofluidiske værktøjer, der anvendes i kombination med fluorescensmikroskopi, har banet vejen for karakteriseringen af persistensfænotypen og fremhævet rollen som centrale cellulære processer, såsom kromosomreplikation12, DNA-reparation 13 og celledeling14, i persisterende celledannelse. I dette papir beskriver vi en integreret tilgang, der kombinerer klassiske mikrobiologiske assays med enkeltcelle levende billeddannelse for at karakterisere persisterende celler genereret i eksponentielt voksende Escherichia coli-kulturer behandlet med en høj dosis ofloxacin. Protokollen beskrevet her kan anvendes til at studere fænomenet antibiotikapersistens hos andre bakteriearter, såsom Bacillus subtilis15, eller tilstande (f.eks. antibiotikapersistens efter β-lactambehandling 16) og kan let ændres til at undersøge de mange fænomener, der involverer fænotypisk heterogenitet17,18,19 . Desuden kan opsætningen beskrevet i dette papir kombineres med andre fluorescerende reportere for at undersøge forskellige cellulære parametre af interesse, såsom intracellulære niveauer af pH20 eller ATP21 på enkeltcelleniveau, hvilket potentielt kan producere ny indsigt i antibiotikapersistensfænomenet.
Protocol
BEMÆRK: Brug sterilt kulturglas, pipettespidser og vækstmedium. Her blev E. coli-celler dyrket i et kemisk defineret medium med lav autofluorescens (se materialetabel). Inokulationer blev udført i nærværelse af en bunsenbrænder for at minimere risikoen for forurening.
1. Cellekultur og vækstkurve
- Stribe interessestammen fra en frossen glycerolbestand på en Luria-Bertaini (LB) agarplade (suppleret med et selektivt antibiotikum, hvis det kræves), og inkuber ved 37 ° C natten over (mellem 15 timer og 19 timer) for at opnå enkeltkolonier.
BEMÆRK: Eksperimentet, der præsenteres her, bruger to stammer, E. coli K-12 MG1655 svarende til wt-stammen og den isogene MG1655 hupA-mCherry-stamme 22. Sidstnævnte stamme udtrykker den fluorescensmærkede α-underenhed af det HU-nukleoidassocierede protein. hupA-mCherry-reporteren er integreret på hupA's oprindelige sted. HU-mCherry fungerer som en proxy til at følge nukleoiddynamikken i levende celler, da den binder til DNA på en ikke-specifik måde. - Der podes 5 ml medium (her 3-[N-morpholino] propansulfonsyrebaseret medium [MOPS]; Tabel 1, tabel 2 og tabel 3) suppleret med glucose 0,4% og et selektivt antibiotikum (hvis nødvendigt) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og anbring røret i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 rotationer pr. minut (o / min) natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Alternativt kan plastrør, glas eller plastkolber (≥ 25 ml) bruges i stedet for glasrør.
BEMÆRK: MOPS-medium suppleret med glycerol i en slutkoncentration på 0,4% blev anvendt i hele eksperimenterne beskrevet i denne artikel, bortset fra de natkulturer, der blev udført i MOPS-glucose 0,4%. Generationstiden for E. coli i MOPS suppleret med glukose er kortere end i MOPS glycerol. Brug af MOPS-glukose 0,4% i stedet for MOPS-glycerol 0,4% på dette trin sikrer, at cellerne når den stationære fase inden for 19 timer. Andre vækstmedier, såsom M9 eller rige definerede medium (RDM) suppleret med forskellige kulstofkilder, kan også anvendes. Det skal dog bemærkes, at væksthastigheden og persistensfrekvensen er forskellig afhængigt af det anvendte medium og/eller kulstof23. - Den følgende morgen centrifugeres 1 ml kultur ved 2.300 x g i 3 minutter, supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes forsigtigt i samme mængde fosfatbufferet saltvand (PBS). Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD 600 nm), og beregn det nødvendige volumen for en indledende OD600 nm på 0,01 i et slutvolumen på 2 ml.
- Anbring 2 ml MOPS-glycerol 0,4% medium i en brønd med en klar bundplade med 24 brønde, og pod med det beregnede kulturvolumen natten over. Pladen med 24 brønde anbringes i en automatisk mikropladelæser (se materialetabellen) for at overvåge OD600 nm i 24 timer. Indstil mikropladelæseren til at måle OD600 nm hvert 15. minut ved en temperatur på 37 °C og med høj orbitalrotation (140 omdr./min.).
BEMÆRK: Hvis den stamme, der anvendes i eksperimentet, koder for en fluorescerende reporter, skal du sørge for, at dens væksthastighed er sammenlignelig med wt for at undgå artefakt i de efterfølgende eksperimenter, da væksthastigheden påvirker antibiotikapersistensfrekvensen23. På grund af detektionsbegrænsninger ved meget lave celletætheder og de potentielle stammespecifikke virkninger på OD600 nm/kolonidannende enheder (CFU) anbefales det at evaluere vækstkinetikken ved at overvåge CFU·mL-1 , når der arbejdes med ukarakteriserede stammer.
2. Bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration af antibiotika
BEMÆRK: Den mindste hæmmende koncentration (MIC) defineres som den laveste dosis antibiotika, hvor der ikke observeres bakterievækst. Bestemmelsen af MIC skal udføres for hvert antibiotikum og stamme. I de her beskrevne eksperimenter blev fluorquinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX) anvendt. Bestemmelsen af MIC gør det muligt at bekræfte, at antibiotikaopløsningen er korrekt fremstillet, antibiotika er aktivt, og stammerne er lige så følsomme over for antibiotika. Her blev den offentliggjorte agarfortyndingsmetode udført for at bestemme MIC til OFX af de forskellige anvendte stammer24. MIC for et givet antibiotikum til en given bakteriestamme kan også bestemmes via bouillonfortyndingsmetode24.
- Klargøring af pladerne til bestemmelse af den nationale mikrofon
- Forbered en stamopløsning til det antibiotikum, der anvendes i forsøgene, ved at opløse 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vand. Tilsæt 20 μL 37% HCI for at øge opløseligheden af OFX.
- Smelt 100 ml steril LB-agar, og opbevar den ved 55 °C for at undgå størkning. Der fremstilles seks små glaskolber (25 ml), og der pipetteres 5 ml flydende LB-agarmedium i hver kolbe med en steril pipette.
- 10 μL af 5 mg·ml-1 OFX-stamopløsningen fortyndes i 90 μL ultrarent vand (1:10 fortynding af stamstammen). Der tilsættes 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL eller 10 μL af 500 μg·mL-1 OFX-opløsningen til hver af de seks glaskolber, der indeholder 5 ml LB agarsubstrat, for at generere LB-agarmedium med endelige koncentrationer på 0 μg·ml−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·ml−1, 0,08 μg·ml−1 og 0,1 μg·ml-1 OFX. Bland opløsningen ved at dreje kolberne flere gange.
BEMÆRK: Hvis MIC for det pågældende antibiotikum er kendt, bør koncentrationsområdet nå fra neden til over den faktiske MIC. Hvis mikrofonen er ukendt, anbefales et stort koncentrationsinterval med en log 2-fortyndingsserie. Sørg for, at LB-agarmediet er afkølet, før du tilsætter antibiotika, da høje temperaturer kan inaktivere det. Ikke desto mindre er det vigtigt ikke at lade LB-agarmediet størkne, før antibiotika tilsættes, da dette kan føre til en ikke-homogen fordeling af antibiotika i LB-agarmediet. - 5 ml af hvert af de seks LB agarsubstrater, der er fremstillet i trin 2.1.3, hældes dosisforøgende i en 6-hullers dyrkningsplade med en steril pipette. Lad agaren køle af, indtil den størkner, og tør pladen inden brug.
BEMÆRK: Forbered antibiotikaopløsningen og kulturpladen den dag, analysen udføres.
- MIC-bestemmelsesanalyse
- Der podes 5 ml LB-substrat med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og glasrøret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 o/min natten over (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den følgende morgen måles OD600 nm, og kulturen fortyndes til et reagensglas til en endelig celletæthed på 1 x 107 CFU·ml-1 i PBS. For de stammer, der testes her, svarer 1 x 107 CFU·mL−1 til en OD600 nm på 0,0125.
BEMÆRK: Hvis korrelationen mellem CFU·mL-1 og OD 600 nm ikke er kendt, skal vækstkurven bestemt ved CFU- og OD 600 nm-målinger etableres for at beregne korrelationsfaktoren mellem CFU·ml-1 og OD 600 nm. - Spot 2 μL af den tidligere fortyndede kultur på hvert hul i den tørrede 6-brønds plade. Lad pletterne tørre, inden pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den næste dag tæller kolonierne dannet i hver brønd. MIC svarer til brønden med den mindste koncentration af antibiotika, hvor der ikke påvises bakterievækst.
3. Spot-analyse
BEMÆRK: Spotanalysemetoden er en kvalitativ tilgang, der gør det muligt at estimere antallet af levedygtige celler (celler, der er i stand til at generere kolonier efter antibiotikastress). Spotanalysen udføres før time-kill-analysen for at give indsigt i levedygtigheden af den stamme, der anvendes under de testede betingelser, og for at informere om de fortyndinger, der er nødvendige under time-kill-analysen (se afsnit 4).
- For at forberede LB-agarpladerne til spotanalyser hældes 50 ml LB-agar i et firkantet petrifad (144 cm2). Forbered en firkantet petriskål pr. Tidspunkt. Lad LB-agaren størkne, og tør pladerne inden brug.
- Der podes 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den næste dag måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes til frisk temperaturjusteret medium (37 ° C, MOPS glycerol 0,4%) i et glasrør (≥25 ml) til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over i en inkubator ved 37 °C ved 180 o / min (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den følgende dag måles OD 600 nm, og kulturen inkuberes til en endelig OD600 nm på 0,3.
- Under inkubationen fremstilles plader med 96 brønde ved at anbringe 90 μL 0,01 MMgSO4-opløsning i alle brønde undtagen hullerne i første række (række A). 96-brøndspladerne vil blive brugt til 10 gange seriel fortynding i trin 3.7.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev to stammer (wt og hupA-mCherry-stamme ) testet i tre eksemplarer på syv forskellige tidspunkter. Da en plade består af 12 søjler, kan en plade bruges til to tidspunkter, og således blev der forberedt i alt fire plader. - Ved en OD 600 nm på 0,3 udtages200 μL af hver bakteriekultur. Disse prøver svarer til t0 (ubehandlet) tidspunkt før antibiotikabehandlingen og tillader bestemmelse af CFU·ml-1 før antibiotikabehandling.
- Prøverne centrifugeres ved 2.300 x g i 3 min. Under centrifugeringstiden tilsættes den ønskede koncentration af OFX til den flydende kultur, og inkubationen fortsætter ved 37 °C under omrystning.
BEMÆRK: Her blev OFX anvendt i en koncentration på 5 μg·ml-1 (svarende til MIC ganget 83 gange). I en tidligere undersøgelse blev denne koncentration anvendt til at karakterisere persistensfænomenet under OFX-eksponering25. Den antibiotikakoncentration, der anvendes til tids-/drabsanalyserne, kan variere afhængigt af antibiotika, kulturmediet og tilstanden af bakterievækst. - Efter centrifugering resuspenderes cellepelleten i 200 μL 0,01 MMgSO4-opløsning . 100 μL anbringes i det tomme hul på 96-brøndspladen, der er forberedt i trin 3.5. Der udføres en fortynding ved at overføre 10 μL af hullet i række A til brønden i række B indeholdende 90 μL 0,01 MMgSO4. De serielle fortyndinger fortsættes ved at overføre 10 μL af hullet i række B til brønden i række C. Gentag det, indtil der opnås en fortynding på 10-7 (hvor hver overførsel er en 10 gange fortynding).
BEMÆRK: I dette eksperiment blev seks kulturer (tre for wt-stammen og tre for hupA-mCherry-stammen ) testet for hvert tidspunkt. Ifølge protokollen anvendes en muti-kanalpipette til at udføre de serielle fortyndinger for de seks stammer på samme tid. For at minimere den tekniske fejl ændres pipettespidserne mellem hver overførsel. - Der anbringes 10 μL af hver fortynding på LB-agarpladerne fremstillet i trin 3.1.
BEMÆRK: En flerkanalpipette bruges til samtidig at spotte den samme fortynding (f.eks. en 10-4 fortynding) for de seks kulturer. Under spottingen skal det første stop på multikanalpipetten bruges uden at skubbe det andet stop, da dette kan resultere i, at mikrodråber dispenseres på pladen. - På relevante tidspunkter efter tilsætning af antibiotika udtages 200 μL af kulturen, og der udføres serielle fortyndinger som beskrevet i trin 3.8. Spot 10 μL af hver fortynding som beskrevet i trin 3.9.
BEMÆRK: Til eksperimentet beskrevet her blev syv tidspunkter indsamlet (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer, der udviser øget antibiotikafølsomhed sammenlignet med vægt, kan der udføres flere vaske i MgSO4 0,01 M for at fjerne resterende antibiotika. - Pladerne inkuberes ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag tælles antallet af kolonier ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres. Ideelt set indeholder pletterne på agarpladerne for disse fortyndinger mellem 3 og 30 kolonier, hvilket muliggør nøjagtig bestemmelse af CFU·ml-1 for hver prøve.
- Beregn overlevelsesraten ved at dividere den beregnede CFU·mL-1 for hvert tidspunkt med CFU·mL-1 for den oprindelige population ved t0.
4. Tidsdræbende assays
BEMÆRK: Mens spotanalyser er en brugervenlig metode til at estimere overlevelsesraten for en given stamme for et givet antibiotikum, giver tidsdræbende assays en overlevelsesrate med højere opløsning og udføres for nøjagtigt at kvantificere bakteriens levedygtighed. Profilen af drabskurven kan bruges til at bestemme, om en given bakteriestamme er følsom, tolerant eller resistent over for antibiotika i en given tilstand. Desuden tillader time-kill-assays bestemmelse af den tid for antibiotikaeksponering, der er nødvendig for at detektere persistensfænomenet (begyndelsen af den anden hældning af den bifasiske drabskurve) såvel som persistensfrekvensen.
- Forbered LB-agarplader til time-kill plating-analysen. Hæld 25 ml LB agar i en petriskål (±57 cm2). Tilbered mindst to petriskåle pr. tidspunkt (to fortyndinger pr. time pr. stamme er belagt).
- Lad LB-agaren størkne, og tør pladerne, inden du tilføjer fem til otte sterile glasperler til hver plade. Vend og mærk pladerne i henhold til stammen/tilstanden/tidspunktet.
BEMÆRK: Glasperler tillader spredning af bakterier på agarpladerne under trin 4.7 og trin 4.9. Alternativt kan cellerne dispergeres på agarpladen ved hjælp af en spreder. - For hver prøve fremstilles 10 gange serielle fortyndingsglasrør indeholdende 900 μL 0,01 MMgSO4-opløsning . Antallet af fortyndingsglasrør pr. prøve, der skal forberedes, svarer til de fortyndinger, der er nødvendige for at påvise kolonier i spotassayet.
- Der podes 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer).
- Efter 16 timers vækst måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes til frisk temperaturjusteret medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) i et glasrør til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over i en inkubator ved 37 °C ved 180 o / min (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den følgende dag måles OD 600 nm, og kulturen inkuberes til en endelig OD600 nm på 0,3.
- Ved en OD 600 nm på 0,3 udtages 100 μL af kulturen, fortyndes i henhold til de data, der er opnået i spotanalysen (ved en OD600 nm på 0,3 og uden antibiotikum giver en 10-5 fortynding normalt 200-300 kolonier) og plade100 μL på LB-agarpladerne fremstillet i trin 4.1-4.2. Ryst forsigtigt pladerne for at undgå, at perlerne kommer i kontakt med skålens kanter, da dette kan føre til en ikke-homogen spredning af bakteriecellerne på LB-agarmediet. Denne første prøve før antibiotikabehandlingen svarer til t0-tidspunktet (CFU·ml-1 før antibiotikabehandling).
- Den ønskede koncentration af OFX tilsættes og inkuberes fortsat ved 37 °C under omrystning.
BEMÆRK: Her blev OFX anvendt i en koncentration på 5 μg·ml-1 (svarende til MIC ganget 83 gange). - På relevante tidspunkter efter tilsætning af antibiotika udtages 100 μL af kulturen, fortyndes i overensstemmelse med de data, der er opnået i spotanalysen, og plade 100 μL på LB-agarpladerne fremstillet i trin 4.1-4.2. Pladerne på cellerne som beskrevet i trin 4.7.
BEMÆRK: Til eksperimentet beskrevet her blev syv tidspunkter indsamlet (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer, der udviser en øget antibiotikafølsomhed sammenlignet med vægten, kan der udføres flere vaske i MgSO4 0,01 M for at fjerne resterende antibiotika. - Pladerne inkuberes ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag tælles antallet af kolonier ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres. Ideelt set bør pladerne indeholde 30-300 kolonier for at muliggøre en nøjagtig bestemmelse af CFU·mL-1 i hver prøve.
- Beregn overlevelsesforholdet ved at normalisere CFU·mL-1 på hvert tidspunkt med CFU·mL-1 ved t0. Plot log10 normaliseret CFU·mL-1 som funktion af tiden.
5. Mikrofluidisk time-lapse mikroskopi billeddannelse
BEMÆRK: Følgende afsnit beskriver forberedelsen af den mikrofluidiske plade samt time-lapse-billedoptagelses- og billedanalyseproceduren. Formålet med dette eksperiment er at observere og analysere persistensfænotypen ved antibiotikabehandling på enkeltcelleniveau. De data, der indsamles under dette eksperiment, kan bruges til at generere en lang række resultater afhængigt af det behandlede spørgsmål og / eller de fluorescerende reportere, der blev brugt under eksperimentet. I eksperimentet beskrevet her blev kvantitativ analyse af cellelængden og HU-mCherry-fluorescens22, der afspejler nukleoidorganisationen i persisterende og ikke-persisterende celler, udført.
- Bakteriel cellekultur til mikrofluidisk time-lapse mikroskopi
- Der podes 5 ml medium (MOPS-glycerol 0,4 %, om nødvendigt suppleret med et selektivt antibiotikum) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer).
- Den næste dag måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes i frisk temperaturjusteret medium (37 ° C, MOPS glycerol 0,4%) i et glasrør til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over (mellem 15 timer og 19 timer) i en rystekuvøse ved 37 °C og 180 o / min for at opnå en tidlig eksponentiel fasekultur den næste dag.
- Fremstilling af mikrofluidisk plade og time-lapse mikroskopi billeddannelse
BEMÆRK: Mikrofluidiske eksperimenter kan udføres i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder (som beskrevet her) eller i internt producerede mikrofluidiske systemer.- Fjern konserveringsopløsningen (hvis den er til stede) fra hvert hul i den mikrofluidiske plade, og erstat den med et frisk dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Hvis den mikrofluidiske plade indeholder en affaldsudløbsbrønd, skal opløsningsopløsningen af udløbsbrønden fjernes, men ikke erstattes af mediet. - Forsegl den mikrofluidiske plade med manifoldsystemet ved at klikke på knappen Seal eller gennem den mikrofluidiske software (vælg først Tool, efterfulgt af Seal Plate).
BEMÆRK: For at forsegle pladen skal der påføres et ensartet tryk på pladen og manifolden ved manuelt at klemme pladen mod manifolden. Hvis det udføres korrekt, skal noten "forseglet" vises på ONIX2-grænsefladen. Det er vigtigt ikke at lægge pres på glasglasset for at undgå enhver potentiel risiko for at bryde manifolden. - Når den er forseglet, skal du udføre en første primingsekvens (klik på Kør flydende primingsekvens på den mikrofluidiske softwaregrænseflade).
BEMÆRK: Kør flydende primingsekvens svarer til 5 minutters perfusion ved 6,9 kPa for brønd 1-5, efterfulgt af 5 minutters perfusion ved 6,9 kPa for brønd 8 og en sidste perfusionsrunde for brønd 6 for 5 minutter ved 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gør det muligt at fjerne den konserveringsopløsning, der stadig kan være til stede i kanalerne, der forbinder de forskellige brønde. - Pladen inkuberes i et termostatstyret mikroskopkabinet ved den ønskede temperatur (her 37 °C) i mindst 2 timer, før mikroskopibilleddannelsen påbegyndes.
- Start en anden Run Liquid Priming Sequence , før eksperimentet påbegyndes.
- Forsegl den mikrofluidiske plade ved at klikke på Seal off på den mikrofluidiske softwaregrænseflade. Substratet erstattes i hul 1 og hul 2 med 200 μL frisk substrat, i hul 3 med 200 μL frisk substrat indeholdende antibiotikummet (her OFX ved 5 μg·ml-1), i hul 4 og hul 5 med 200 μL frisk substrat, i hul 6 med 200 μL frisk substrat og i hul 8 med 200 μL af kulturprøven (fra trin 5.1.2) fortyndet til en OD600 nm på 0,01 i frisk substrat.
- Den mikrofluidiske plade forsegles som beskrevet i trin 5.2.2, og pladen anbringes på mikroskopmålet inde i mikroskopkabinettet.
BEMÆRK: Sørg for at placere en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopmålet, før du placerer den mikrofluidiske plade. - I den mikrofluidiske software skal du klikke på Celleindlæsning for at tillade, at cellen indlæses i den mikrofluidiske plade.
BEMÆRK: Celleindlæsningstrinnet består af 15 s perfusion ved 13,8 kPa for brønd 8, efterfulgt af 15 s perfusion ved 27,6 kPa for brønd 6 og brønd 8 og en sidste perfusionsrunde for brønd 6 for 30 s ved 6,9 kPa. Tætheden af cellerne i den mikrofluidiske plade er kritisk for eksperimentet. Den første del af denne mikrofluidiske protokol består af voksende bakterier i 6 timer i et frisk medium før antibiotikabehandlingen. Efter 6 timers vækst skal celletætheden være tilstrækkelig til at detektere de sjældne persisterende celler (under de betingelser, der anvendes i denne undersøgelse, genererer de persisterende celler med en frekvens på 10-4). Hvis celletætheden er for høj, er det svært at skelne mellem de enkelte celler, hvilket forhindrer præcis enkeltcelleanalyse. Da væksthastigheden er direkte afhængig af mediet, bør tætheden af celler i mikroskopifelterne vurderes, inden forsøget påbegyndes. - Indstil et optimalt fokus ved hjælp af transmitteret lystilstand, og vælg flere interesseområder (ROI'er), hvor der observeres et passende cellenummer (op til 300 celler pr. Felt).
BEMÆRK: Vælg mindst 40 ROI'er for at sikre, at de sjældne persisterceller er afbildet. - På den mikrofluidiske software skal du klikke på Opret en protokol. Frisk substrat programmeres ved 6,9 kPa i 6 timer (hul 1-2), efterfulgt af injektion af mediet indeholdende antibiotika ved 6,9 kPa i 6 timer (hul 3) og endelig injektion af frisk substrat ved 6,9 kPa i 20 timer (hul 4-5).
BEMÆRK: En bakteriekultur fortyndet til en OD600 nm på 0,01 tillader bakterier at vokse i det mikrofluidiske kammer i 6 timer, hvilket sikrer, at cellerne er i den eksponentielle vækstfase. Afhængigt af antallet af celler, der indføres i den mikrofluidiske anordning under indlæsningstrinnet (se trin 5.2.8), kan varigheden af vækstfasen tilpasses til at opnå op til 300 celler pr. ROI. Da persistens er et sjældent fænomen, forbedrer øget antal celler pr. ROI muligheden for at observere persisterende celler. Cellenummeret bør dog ikke overstige 300 celler pr. ROI, da dette gør enkeltcelleanalyse kedelig. - Udfør mikroskopibilleddannelse i timelapse-tilstand med et billede hvert 15. minut ved hjælp af transmitteret lys og excitationslyskilden til den fluorescerende reporter. Her blev der brugt en 560 nm excitationslyskilde til mCherry-signalet (580 nm LED ved 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] og 100 ms eksponering for mCherry). Den Zeiss-kompatible Zen3.2-software blev brugt til cellebilleddannelse.
- Fjern konserveringsopløsningen (hvis den er til stede) fra hvert hul i den mikrofluidiske plade, og erstat den med et frisk dyrkningsmedium.
- Billedanalyse
BEMÆRK: Åbningen og visualiseringen af mikroskopibillederne udføres med open source ImageJ/Fiji-softwaren (https://fiji.sc/)26. Den kvantitative billedanalyse udføres ved hjælp af open source ImageJ/Fiji-softwaren og det gratis MicrobeJ-plugin (https://microbej.com)27. I denne protokol blev MicrobeJ 5.13I(14)-versionen anvendt.- Åbn ImageJ/Fiji-softwaren på computeren, og træk hyperstack time-lapse-mikroskopibillederne til Fiji-indlæsningsbjælken. Brug Image > Color > Make Composite til at smelte de forskellige kanaler i hyperstacken. Hvis kanalerne i timelapse-eksperimentet ikke svarer til den ønskede farve (f.eks. vises fasekontrasten med rødt i stedet for gråt), skal du bruge Image > Color > Arranger kanaler til at anvende den relevante farve på kanalerne.
- Åbn MicrobeJ-pluginet, og registrer bakteriecellerne ved hjælp af den manuelle redigeringsgrænseflade. Slet de automatisk registrerede celler, og opret manuelt en disposition for de vedvarende celler af interesse billede for billede.
BEMÆRK: Forskellige indstillinger kan bruges til automatisk at registrere individuelle celler. Manuel detektion blev brugt her, da de analyserede persisterceller danner lange filamenter, som sjældent detekteres korrekt ved hjælp af automatisk detektion. - Efter registrering skal du bruge ikonet Resultat i MicrobeJ's manuelle redigeringsgrænseflade til at generere en ResultJ-tabel. Gem filen ResultJ, og brug tabellen ResultJ til at få indsigt i forskellige parametre af interesse for enkeltcelleanalysen. I tilfælde af denne protokol blev den gennemsnitlige fluorescens af HU-mCherry-intensiteten, cellelængden og cellearealet af individuelle celler eksporteret.
Representative Results
Som beskrevet ovenfor blev de stammer, der blev anvendt til enkeltcellefænotypisk analyse af persisterende celler, karakteriseret i MOPS-glycerol 0,4% medium. Overvågningen af OD600nm over tid viste ingen forskel mellem wt - og hupA-mCherry-stammerne (figur 1). Dette indikerer, at ekspressionen af HU-mCherry-fusionsproteinet ikke påvirkede væksten under disse forhold. Bakteriecellerne i begge stammer, der oprindeligt blev podet ved en OD600 nm på 0,01, nåede eksponentialfasen ±8 timer efter podning.
MIC for OFX blev bestemt ved standardiserede metoder (her seriel agarfortynding)24. MIC defineres som den minimale koncentration, hvor der ikke registreres nogen synlig vækst. MIC for OFX for begge stammer blev bestemt til at være 0,06 μg·ml−1, hvilket indikerer, at hupA-mCherry-fusionen ikke havde nogen effekt på følsomheden over for OFX sammenlignet med den isogene wt-stamme (figur 2).
Vi bestemte yderligere effekten af en dødelig OFX-behandling (83 gange MIC) på levedygtigheden af begge stammer, der blev anvendt i denne undersøgelse. Da det levedygtige celletal falder over tid med OFX-eksponering, skal fortyndingerne af bakteriekulturer justeres passende for at nå 30 til 300 kolonier pr. Plade. For at bestemme de passende fortyndinger over tid blev der udført et spotassay, hvor 10 μL fra 0 til 10-7 serielle 10-foldige fortyndinger blev anbragt på firkantede petriskåle ved hjælp af en flerkanalpipette. De passende fortyndinger var dem, hvor isolerede kloner var synlige (fx ved t0 = 10-5, t1h = 10-4/10-3, t4h = 10-2/10-1) (figur 3).
Mens spotanalysen er en nem metode til at få indsigt i kinetikken ved OFX-medieret drab, bestemmer den ikke nøjagtigt drabsdynamikken. Når levedygtigheden af eksponentielt voksende celler behandlet med OFX blev overvåget ved time-kill-assayet, blev der observeret en typisk bifasisk kurve (figur 4). Den første hældning af kurven afspejler den hurtige drab af den ikke-vedvarende befolkning (rød stiplet linje). Under de forhold, der blev testet her, var op til 99,9% af cellerne ikke i stand til at danne kolonier efter 3 timer i nærvær af OFX. Denne første fase af drabet efterfølges af en anden fase, der viser en langsommere drabsrate (blå stiplet linje), som afslører tilstedeværelsen af lægemiddeltolerante persisterende celler. Under de testede betingelser startede persisterfasen omkring 3 timer efter OFX-tilføjelsen, hvilket fremhævede nødvendigheden af at udsætte cellerne for OFX i mere end 3 timer for at undersøge de persisterende fænotyper. Det er vigtigt, at time-kill-kurven viser, at hupA-mCherry-fusionsproteinet ikke havde nogen effekt på tidsdræberkinetikken. Stammen, der koder for den translationelle fluorescerende fusion, kan derfor bruges til at overvåge de persisterende celler ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Vi fortsatte med at undersøge persistensfænomenet på enkeltcelleniveau. For at gøre dette blev hupA-mCherry-stammen introduceret i en mikrofluidisk plade, hvilket muliggjorde ændring af medieforhold (her, vækst, behandling og genopretning), mens der udføres time-lapse-mikroskopi på en given ROI. Under det første trin i det mikrofluidiske eksperiment blev cellerne, der blev indført i den mikrofluidiske enhed, perfuseret med vækstmedium (MOPS-glycerol 0,4%) og divideret med en generationstid på ~ 2 timer (figur 5 og figur 6). Denne første vækstfase indikerer, at cellerne var levedygtige og aktivt delte sig før OFX-behandlingen.
Efter denne første vækstfase blev cellerne perfuseret med vækstmedium suppleret med 5 μg·ml-1 OFX i 6 timer. Så snart antibiotika nåede cellerne, blev celledeling blokeret (figur 5 og figur 6). Efter 6 timers OFX-behandling blev cellerne perfuseret med frisk medium. Mens langt størstedelen af cellerne ikke var i stand til at genoptage væksten (figur 5 og figur 6), var en lille delpopulation af bakterier i stand til at forlænge og generere filamentøse celler25. Disse celler, som var i stand til at dele sig og generere levedygtige datterceller efter OFX-behandlingen, kan defineres som de vedvarende celler.
Da denne opsætning giver mulighed for visualisering af persistercellerne før, under og efter behandlingen, giver den ikke kun information om persisterfænotypen under restitutionsfasen, men også om persistercellernes fysiologiske tilstand før behandlingen (figur 6). Under de testede betingelser delte de persisterende celler sig på samme måde som ikke-persisterende celler før OFX-behandlingen, hvilket indikerer, at de observerede persisterceller ikke stammede fra en sovende subpopulation (figur 6)25.
Cellelængdeanalysen af persisterende celler under gendannelsesfasen afslørede, at hvert filament havde en specifik forlængelseshastighed. Den cellelængde, som hver persister nåede før den første deling, varierede fra en persister til en anden. På samme måde var tidspunktet for første divisionsturnering meget heterogent (figur 6). Det delende persisterende filament genererede flere datterceller, som begyndte at vokse og dele sig for det meste på samme måde som ubehandlede celler (figur 7). Den successive deling af filamentet resulterede derefter i et progressivt fald i cellelængden, hvilket i sidste ende gav anledning til datterceller med samme cellelængde som før OFX-behandlingen (figur 6 og figur 7B). Langt størstedelen af cellerne var ude af stand til at inducere filamentering efter OFX-fjernelse. Denne store cellepopulation svarer til de døde celler (figur 5 og figur 6).
Den fluorescerende fusion af det nukleoidassocierede protein HU muliggør visualisering af nukleoidets dynamik22. Analysen af den totale fluorescensintensitet af HU-mCherry i cellen kan bruges som proxy for DNA-indholdet22,25. I vækstfasen (før OFX-behandling) varierede den samlede mCherry-fluorescensintensitet, hvilket afspejler dynamikken i kromosomreplikation og adskillelse under cellecyklussen (figur 8). Efter OFX-tilsætning steg mCherry-fluorescensen ved midtcellen, hvilket indikerer nukleoidkomprimering, hvilket har vist sig at være induceret ved dannelsen af dobbeltstrengede DNA-brud28 (figur 5). Dobbeltstrengede DNA-brud er en konsekvens af virkningsmekanismen for OFX, som ødelægger type II topoisomeraserne DNA-gyrase og topoisomerase IV29,30. I E. coli er DNA-gyrase det primære mål for OFX29,30. Ved at binde sit mål på et kritisk trin i dobbeltstrengspassagemekanismen hæmmer OFX nedrykningen af de spaltede DNA-strenge, hvilket i sidste ende fører til frigivelse af dobbeltstrengede DNA-brud30. Som beskrevet ovenfor begyndte persistercellerne til OFX-behandling at filamentere under genopretning25 (figur 6). Stigningen i cellelængde korrelerede med en stigning i den totale mCherry-fluorescensintensitet, hvilket afspejler replikationsgenstart og en stigning i nukleoidmængden i filamentet25 (figur 7a og figur 8). For døde celler forblev den samlede mCherry-fluorescensintensitet stabil under behandlingen og under genopretningsfasen, hvilket indikerer, at disse celler ikke var i stand til at replikere deres kromosomer efter OFX-fjernelse (figur 8). Mikrofluidisk video (video 1) af E. coli HU-mCherry-celler før, under og efter ofloxacinbehandling vises også.
Figur 1: Vækstovervågning af wt og hupA-mCherry E. coli-stammer. Optisk densitetsovervågning (OD600 nm) af wt (sort) og hupA-mCherry (rød). Nuancerne og stiplede linjer angiver standardafvigelserne for de biologiske triplicater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bestemmelse af MIC for OFX for wt - og hupA-mCherry E. coli-stammerne. Wt () og hupA-mCherry (●) blev dyrket i LB-medium, og 2 μL blev spottet på serielle fortyndinger af OFX-indeholdende LB-agar (♦ koncentration angivet i hvert panel i μg·mL−1). Væksthæmning er synlig ved mindst 0,06 μg·ml−1. Figuren er et repræsentativt eksperiment af biologiske triplicater. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spotanalyse af wt - og hupA-mCherry E. coli-stammer ved eksponering for OFX. (A) wt og (B) hupA-mCherry stammerne blev dyrket i MOPS glycerol 0,4% som beskrevet i protokollen (afsnit 3), og de eksponentielt voksende celler (OD600 nm = 0,3) blev behandlet med 5 μg·ml-1 OFX. T0 svarer til tidspunktet før tilføjelsen af OFX. T1, T2, T3, T4, T5 og T6 svarer til 1-6 timer efter OFX-tilsætningen. Figuren er et repræsentativt eksperiment af biologiske triplicater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Time-kill assay af wt og hupA-mCherry E. coli stammer ved eksponering for OFX. Stammerne wt () og hupA-mCherry (●) blev dyrket i MOPS-glycerol 0,4% som beskrevet i protokollen (afsnit 4), og de eksponentielt voksende celler (♦ OD600 nm = 0,3) blev behandlet med 5 μg·ml-1 OFX. De stiplede linjer angiver den første "hurtige" (røde) drabsfase og den anden "langsomme" (blå) drabsfase, svarende til de følsomme og vedvarende delpopulationer (opnået ved lineær regression mellem T0 og T2 samt mellem henholdsvis T3 og T6). Fejlbjælkerne angiver standardafvigelserne for de biologiske triplicater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative billeder af OFX persister og døde celler ved hjælp af mikrofluidiske værktøjer. Repræsentative mikroskopibilleder, der viser de relevante tidspunkter for det mikrofluidiske eksperiment udført med hupA-mCherry-stammen (fasekontrast i grå, HU-mCherry-signal i rødt). Cellerne, der udtrykte den mærkede hupA-mCherry , blev dyrket i en mikrofluidisk plade (her 4 timer) efterfulgt af en OFX-udfordring (5 μg·ml-1). Efter 6 timer i nærvær af OFX blev cellerne perfuseret med frisk medium, hvilket gjorde det muligt for persistercellerne at komme sig. Den persisterende celle og dens afkomceller under OFX-behandlingen og efter OFX-fjernelse fremhæves med henholdsvis grønt og blåt. De tilsvarende tidspunkter er angivet på hvert panel. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Mikroskopi time-lapse analyse af længden af persisteren og døde celler. Cellelængdeanalyse af døde celler (i rødt, n = 109) og persisterende celler (i gråt, n = 13). Start af OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) er angivet med den røde stiplede linje (5 timer), og OFX-fjernelsen er angivet med den blå stiplede linje. Indsatsen svarer til vækstfasen før OFX-tilføjelse. Eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer. Nuancerne og de stiplede linjer angiver standardafvigelserne for populationen af døde celler (n = 109). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Mikroskopi time-lapse analyse af en repræsentativ persistent til OFX. (A) Kymografi af en repræsentativ OFX-persistent og dens datterceller genereret af filamentdelinger i løbet af 8,5 timer efter OFX-fjernelse (18,5 timer efter begyndelsen af det mikrofluidiske eksperiment, omfattende 4 timers vækst, 6 timer med 5 μg·ml-1 OFX-behandling og 8,5 timers restitution efter OFX-fjernelse). Et billede svarer til 15 min. Skalabjælke = 5 μm. (B) Maske genereret fra persisterkymografen i A. Den overvågede persistercelle er angivet med en blå kontur, og dattercellerne fremhæves i forskellige farver. (C) Skematisk gengivelse af den persistente celleafstamning genereret fra B. Farvekodningen er identisk med B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Cellelængde og mCherry-fluorescensanalyse af repræsentative persistente og døde celler. Analyse af cellelængden (venstre akse) og den totale HU-mCherry-fluorescensintensitet (højre akse, vist i vilkårlige enheder) for en repræsentativ persister (faste sorte og røde linjer) og en repræsentativ død celle (stiplet sort og rød linje) under det mikrofluidiske time-lapse-eksperiment. Start af OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) angives med den røde stiplede linje, og OFX-fjernelsen med den blå stiplede linje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Mikrofluidisk video af E. coli HU-mCherry-celler før, under og efter ofloxacinbehandling. Mikrofluidisk time-lapse-billeddannelse, der viser HU-mCherry-celler. Cellerne blev dyrket i 4 timer i MOPS glycerol 0,4%. Efter 6 timers OFX-behandling (5 μg·ml-1) blev det antibiotikafrie medium perfuseret i den mikrofluidiske plade for at give persistercellerne mulighed for at komme sig. Skalabjælke = 5 μm. Tid (i min) er angivet. Vækst- og genopretningsfaserne er angivet med "MOPS- Gly. 0,4%" og OFX-behandlingen med "OFX 5 μg/ml". Klik her for at downloade denne video.
| 10x MOPS | |||
| Lager opløsning | Volumen stamopløsning til 1 liter 10x MOPS | Endelig koncentration i 10x MOPS-base | |
| MOPS-syre | 1 M (justeret til pH 7,4 ved hjælp af KOH) | 400 ml | 0,4 m |
| Tricine | 1 M (justeret til pH 7,4 ved hjælp af KOH) | 40 ml | 0,04 m |
| FeSO4.7H2O | 0,01 m | 10 ml | 0,0001 m |
| NH:4Cl | 1,9 m | 50 ml | 0,095 m |
| K2SÅ4 | 0,276 m | 10 ml | 0,00276 m |
| CaCl2.2H 2O | 0,0005 m | 10 ml | 0,000005 m |
| MgCl 2.6H2O | 0,528 m | 10 ml | 0,00528 m |
| NaCl | Tilføj direkte 29,2 g | 0,5 m | |
| Destilleret vand | 460 ml | ||
| Mikronæringsstoffer 1000x (se tabel 2) | 10 ml | ||
Tabel 1: Sammensætning af 10x MOPS.
| Mikronæringsstoffer 1000x | ||
| Koncentration i mikronæringsstoffer 1000x stamopløsning | Endelig koncentration i 10x MOPS-base | |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | 0,000003 m | 0,00000003 m |
| H 3BO3 | 0,0004 m | 0,000004 m |
| CoCl2.6H 2O | 0,00003 m | 0,0000003 m |
| CuSO4.5H 2O | 0,00001 m | 0,0000001 m |
| MnCl 2.4H2 O | 0,00008 m | 0,0000008 m |
| ZnSO.7H2O | 0,00001 m | 0.0000001M |
Tabel 2: Sammensætning af 1.000x mikronæringsstoffer.
| MOPS-glucose 0,4% eller MOPS-glycerol 0,4% | |||
| Lager opløsning | Volumen for 1 L MOPS glucose 0,4 % eller MOPS glycerol 0,4 % | Endelig koncentration i MOPS-glucose 0,4% eller MOPS-glycerl 0,4% | |
| 10x MOPS | se tabel 1 | 100 ml | |
| K2HPO4 | 0,132 m | 10 ml | 0,00132 m |
| Glucose (for MOPS-glucose 0,4%) | 20% (20 g i 100 ml destilleret vand) | 20 ml | 0.40% |
| Glycerol (til MOPS glycerol 0,4%) | ≤99% | 4 ml | 0.40% |
| Destilleret vand | 870 ml for MOPS-glucose 0,4% eller 886 ml for MOPS-glycerol 0,4% | ||
Tabel 3: Sammensætning af MOPS-glucose 0,4% og MOPS-glycerol 0,4%.
Discussion
Protokollen præsenteret i dette papir tillader analyse af persistensfænotypen observeret som reaktion på antibiotikabehandling på populations- og enkeltcelleniveau. Forsøgene blev udført med E. coli MG1655-stammen, som blev dyrket i et kemisk defineret medium (MOPS-glycerol 0,4%). Time-kill assays og mikroskopi eksperimenter blev udført på eksponentielle fase kulturer. Vi brugte OFX, en fluorquinolon, i en koncentration på 5 μg·ml-1 til at afsløre de persisterende celler. De her beskrevne fremgangsmåder kan anvendes på andre bakteriedræbende antibiotika, såsom β-lactamer, aminoglycosider eller antimikrobielle forbindelser31. Følgelig kan andre bakteriestammer, medier eller vækstbetingelser anvendes. Overvågning af forskellige fluorescerende fusioner i en lignende opsætning som den, der er beskrevet her, kan være nyttig til at følge cellulære processer såsom DNA-replikation 32, DNA-reparation25,33 og celledeling34 før, under og efter antibiotikabehandlingen. På samme måde kan fluorescerende reportere udnyttes til at undersøge forskellige aspekter af cellefysiologi, såsom intracellulære pH 35-, ATP36- eller ROS37-niveauer. Alternativt til fluorescerende fusioner kan kemiske farvestoffer også anvendes. For eksempel kunne hupA-mCherry-fusionen erstattes af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), et fluorescerende farvestof, der pletter DNA38. Udførelse af time-lapse-mikroskopi kombineret med sådanne fluorescerende farvestoffer bør dog undgås, da disse farvningsteknikker kan forstyrre cellecyklusdynamikken under time-lapse-eksperimenter. Alternativt kan sådanne eksperimenter erstattes af tidsforløbsanalyser af snap-shot-billeddannelse på relevante tidspunkter.
Mens sådanne fluorescerende journalister er nyttige, bør mængden af information, der kan ekstraheres gennem analyse af fasekontrastbilleder, ikke overses. Her overvågede vi cellelængdeudviklingen gennem vækst-, OFX-behandlings- og genopretningsstadierne. Andre parametre baseret på fasekontrastbilleder, såsom cellebredde, fasekontrastintensitet og krumninger af bakteriecellerne, kan også ekstraheres med lethed ved hjælp af passende software, såsom MicrobeJ27.
Sammenfattende kan proceduren beskrevet her anvendes på andre tilstande og bakteriearter til overvågning af cellulære reaktioner på skiftende miljøer eller stressorer18,19. Ved at bruge andre fluorescerende reportere (transkriptionelle og translationelle reportere, kemisk farvestof) i kombination med en populationsanalyse, såsom flowcytometri / FACS, kan interessante spørgsmål behandles i en multiskala ramme.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Arbejdet i Van Melderen-laboratoriet støttes af ARC-aktionerne 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. støttes af et ULB-stipendium. T.S. støttes af et FRIA-stipendium (FNRS). J.C. støttes af et postdoktoralt stipendium "chargé de recherches" (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer | Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| CaCl2.2H2O | Merck | 1.02382.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CoCl2.6H2O | Merck | 1.02539.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CuSO4.5H2O | Merck | 1.02790.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| D-(+)-glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) | BE10 | wt reference strain, lab strain | |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT | BE16 | HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain | |
| FeSO4.7H2O | VWR Chemicals | 24244.232 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software; Schindelin et al. if used in publication |
| Glycerol | Merck | 56815 | Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate | Merck | M8812-100EA | 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader |
| H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Digital Image Acqusition |
| K2HPO4 | Merck | 1.05099.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| KOH | Merck | 1.05029.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| K2SO4 | Merck | 1.05153.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Luria-Broth agar medium | Invitrogen | 22700041 | Growth medium for plating assay |
| Luria-Broth medium | Invitrogen | 12780029 | Growth medium for MIC determination |
| MgCl2.6H2O | Merck | 1.05832.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MgSO4 | Merck | 7487-88-9 | Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck | B04A-03-5PK | Plate for microfluidic system |
| MnCl2.4H2O | Merck | 1.05927.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MOPS, Free Acid ULTROL® Grade | Merck | 475898-500GM | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NaCl | SIgma-Aldrich | S5886-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | Merck | 1.01180.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Ofloxacin | Merck | 82419-36-1 | Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x | Merck | P3813 | Dilution buffer |
| GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | 840-208200 | UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | Microplate reader software | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine | Merck | 1.08602.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Zeiss® immersion Oil 518F | Zeiss | Immersion oil to increase resolution of microscope | |
| Zen3.2 Pro | Zeiss | Microscopic image acquisition and processing software | |
| ZnSO4.7H2O | Merck | 1.08883.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
References
- Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
- Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
- Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074 (2022).
- Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
- Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
- Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).
- Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).
- Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).
- Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).
- Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
- Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
- Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
- Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).
- Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
- Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
- Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).
- Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
- Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
- Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
- Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T.
- Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
- Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
- Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
- Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
- Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
