Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Populasjons- og enkeltcelleanalyse av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64550
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Bacterial Genetics and Physiology, Département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB)
* These authors contributed equally

Summary

Persistens av antibiotika beskriver evnen til små subpopulasjoner i en sensitiv isogen populasjon til forbigående å tolerere høye doser bakteriedrepende antibiotika. Den nåværende protokollen kombinerer tilnærminger for å karakterisere antibiotikapersistensfenotypen på molekylært og cellulært nivå etter å ha utsatt Escherichia coli for dødelige doser ofloksacin.

Abstract

Antibiotikapersistens refererer til kapasiteten til små bakterielle subpopulasjoner til forbigående å tolerere høye doser bakteriedrepende antibiotika. Ved bakteriedrepende antibiotikabehandling blir hoveddelen av bakteriepopulasjonen raskt drept. Denne første raske fasen av drap etterfølges av en betydelig reduksjon i drapsraten ettersom de vedvarende cellene forblir levedyktige. Klassisk bestemmes persistens på populasjonsnivå ved tid/kill-analyser utført med høye doser antibiotika og for definerte eksponeringstider. Selv om denne metoden gir informasjon om nivået av persisterceller og drapskinetikken, klarer den ikke å reflektere den inneboende celle-til-celle-heterogeniteten som ligger til grunn for persistensfenomenet. Protokollen beskrevet her kombinerer klassiske time/kill-analyser med enkeltcelleanalyse ved bruk av sanntids fluorescensmikroskopi. Ved å bruke passende fluorescerende reportere kan mikroskopiavbildning av levende celler gi informasjon om effekten av antibiotika på cellulære prosesser, for eksempel kromosomreplikasjon og segregering, celleforlengelse og celledeling. Kombinere populasjons- og enkeltcelleanalyse muliggjør molekylær og cellulær karakterisering av persistensfenotypen.

Introduction

Denne protokollen tar sikte på å analysere bakteriell persistensfenotype som respons på spesifikk antibiotikabehandling på enkeltcelle- og populasjonsnivå. Persistens beskriver kapasiteten til små subpopulasjoner i en isogen populasjon til å tåle høye doser bakteriedrepende antibiotika (fluorokinoloner, aminoglykosider, β-laktamer, etc.), med den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) av de såkalte persistercellene som er identisk med hoveddelen av befolkningen. Bifasisk drapsdynamikk, når man måler bakteriell overlevelse over tid i nærvær av et antibiotika, avslører tilstedeværelsen av forbigående medikamenttolerante celler, med en innledende rask utryddelse av de ikke-persisterende cellene, etterfulgt av en mye langsommere drapshastighet av persistercellene. Ved fjerning av antibiotika gir disse cellene opphav til en genetisk identisk populasjon som viser lignende drapsdynamikk når de behandles med samme antibiotika 1,2. I motsetning til persistens er antibiotikaresistens definert på populasjonsnivå og er generelt en konsekvens av enten de novo-mutasjoner eller horisontal genoverføring av et resistensgivende plasmid3. Mens mutasjonene som er ansvarlige for resistens for det meste er lokalisert i målet for stoffet eller i promotorregionene til legemiddelutstrømningspumpene, har gener som endrer persistensfrekvensen identifisert av genombrede og målrettede mutantanalysetilnærminger vist seg å være mange og mangfoldige 2,3,4,5,6,7,8 . Derfor er det sannsynlig at bakterieceller kan komme inn i persistertilstanden gjennom flere veier 9,10,11, og tilnærminger for å undersøke persistensfenomenet på enkeltcellenivå er nødvendig for å karakterisere fysiologien til disse persistercellene.

Den nylige utviklingen av mikrofluidiske verktøy som brukes i kombinasjon med fluorescensmikroskopi har banet vei for karakteriseringen av persistensfenotypen og fremhevet rollen som viktige cellulære prosesser, som kromosomreplikasjon 12, DNA-reparasjon13 og celledeling14, i persistercelledannelse. I dette papiret beskriver vi en integrert tilnærming som kombinerer klassiske mikrobiologiske analyser med enkeltcelle levende bildebehandling for å karakterisere persisterende celler generert i eksponentielt voksende Escherichia coli-kulturer behandlet med en høy dose ofloksacin. Protokollen beskrevet her kan brukes til å studere antibiotikapersistensfenomenet i andre bakteriearter, som Bacillus subtilis15, eller tilstander (f.eks. antibiotikapersistens etter β-laktambehandling 16) og kan enkelt modifiseres for å undersøke de mange fenomenene som involverer fenotypisk heterogenitet17,18,19 . Videre kan oppsettet beskrevet i dette papiret kombineres med andre fluorescerende reportere for å undersøke forskjellige cellulære parametere av interesse, for eksempel intracellulære nivåer av pH20 eller ATP21 på enkeltcellenivå, noe som potensielt kan gi ny innsikt i antibiotisk persistensfenomen.

Protocol

MERK: Bruk sterilt kulturglass, pipettespisser og vekstmedium. Her ble E. coli-celler dyrket i et kjemisk definert medium med lav autofluorescens (se materialtabell). Inokulasjoner ble utført i nærvær av en Bunsen-brenner for å minimere risikoen for forurensning.

1. Cellekultur og vekstkurve

  1. Strek stammen av interesse fra en frossen glyserolbestand på en Luria-Bertaini (LB) agarplate (supplert med et selektivt antibiotika, om nødvendig), og inkuber ved 37 ° C over natten (mellom 15 timer og 19 timer) for å oppnå enkeltkolonier.
    MERK: Eksperimentet som presenteres her bruker to stammer, E. coli K-12 MG1655 som tilsvarer wt-stammen og den isogene MG1655 hupA-mCherry-stammen 22. Sistnevnte stamme uttrykker fluorescensmerket α-underenhet av HU-nukleoidassosiert protein. HupA-mCherry-reporteren er integrert på det opprinnelige stedet for hupA. HU-mCherry fungerer som en proxy for å følge nukleoiddynamikken i levende celler da den binder seg til DNA på en ikke-spesifikk måte.
  2. Inokuler 5 ml medium (her, 3-[N-morfolino] propansulfonsyrebasert medium [MOPS]; Tabell 1, tabell 2 og tabell 3) supplert med glukose 0,4 % og et selektivt antibiotikum (om nødvendig) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 °C og 180 rotasjoner per minutt (rpm) over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Alternativt kan plastrør, glass eller plastflasker (≥ 25 ml) brukes i stedet for glassrør.
    MERK: MOPS-medium supplert med glyserol ved en endelig konsentrasjon på 0,4% ble brukt gjennom eksperimentene beskrevet i denne artikkelen, bortsett fra nattens kulturer som ble utført i MOPS glukose 0,4%. Generasjonstiden for E. coli i MOPS supplert med glukose er kortere enn i MOPS glyserol. Bruk av MOPS-glukose 0,4 % i stedet for MOPS-glyserol 0,4 % på dette trinnet sikrer at cellene når den stasjonære fasen innen 19 timer. Andre vekstmedier, som M9 eller rikt definert medium (RDM) supplert med forskjellige karbonkilder, kan også brukes. Det skal imidlertid bemerkes at veksthastigheten og persistensfrekvensen er forskjellige avhengig av mediet og / eller karbonet som brukes23.
  3. Neste morgen, sentrifuge 1 ml kultur ved 2,300 x g i 3 minutter, kast supernatanten og resuspender pelleten forsiktig i samme volum fosfatbufret saltvann (PBS). Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600 nm), og beregne volumet som trengs for en innledende OD600 nm på 0,01 i et endelig volum på 2 ml.
  4. Plasser 2 ml MOPS glyserol 0,4% medium i en brønn med en klar bunnplate på 24 brønner, og inokuler med det beregnede dyrkningsvolumet over natten. Plasser 24-brønnsplaten i en automatisert mikroplateleser (se materialfortegnelse) for å overvåke OD600 nm i 24 timer. Still inn mikroplateleseren til å måle OD600 nm hvert 15. minutt ved en temperatur på 37 °C og med høy banerotasjon (140 o / min).
    MERK: Hvis stammen som brukes i forsøket koder for en fluorescerende reporter, må du sørge for at veksthastigheten er sammenlignbar med vekten for å unngå artefakt i de påfølgende forsøkene, da veksthastigheten påvirker antibiotikapersistensfrekvensen23. På grunn av deteksjonsbegrensninger ved svært lave celletettheter og potensielle belastningsspesifikke effekter på OD600 nm / kolonidannende enheter (CFU) -forholdet, anbefales det å evaluere vekstkinetikken ved å overvåke CFU·mL-1 ved arbeid med ukarakteriserte stammer.

2. Bestemmelse av den minimale hemmende konsentrasjonen av antibiotika

MERK: Minste hemmende konsentrasjon (MIC) er definert som den laveste dosen antibiotika der ingen bakterievekst observeres. Bestemmelsen av MIC må utføres for hvert antibiotika og stamme. I forsøkene beskrevet her ble fluorokinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX) brukt. Bestemmelsen av MIC tillater bekreftelse på at antibiotikaoppløsningen er riktig forberedt, antibiotika er aktivt, og stammene er like følsomme for antibiotika. Her ble den publiserte agarfortynningsmetoden utført for å bestemme MIC til OFX av de forskjellige stammene som ble brukt24. MIC av et gitt antibiotikum til en gitt bakteriestamme kan også bestemmes via buljongfortynningsmetoden24.

  1. Klargjøring av platene for MIC-bestemmelse
    1. Forbered en master-stamløsning for antibiotika som brukes i forsøkene ved å oppløse 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vann. Tilsett 20 μL 37% HCl for å øke løseligheten av OFX.
    2. Smelt 100 ml steril LB-agar, og hold den ved 55 °C for å unngå størkning. Klargjør seks små glassflasker (25 ml) og pipett 5 ml flytende LB-agarmedium inn i hver kolbe ved hjelp av en steril pipette.
    3. Fortynn 10 mikrol av 5 mg·ml-1 OFX hovedstamoppløsningen i 90 mikroliter ultrarent vann (1:10 fortynning av hovedstamfisken). Tilsett 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL eller 10 μL av 500 μg·mL-1 OFX-oppløsningen til hver av de seks glassflaskene inneholdende 5 ml LB-agarmedium for å generere LB-agarmedium med endelige konsentrasjoner på 0 μg·mL−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·ml−1 og 0,1 μg·mL-1 OFX, henholdsvis. Bland løsningen ved å rotere kolbene flere ganger.
      MERK: Hvis MIC av antibiotikumet av interesse er kjent, bør konsentrasjonsområdet nå nedenfra til over den faktiske MIC. Hvis MIC er ukjent, anbefales et stort konsentrasjonsområde med en log2 fortynningsserie. Forsikre deg om at LB-agarmediet er avkjølt før du tilsetter antibiotika, da høye temperaturer kan inaktivere det. Likevel er det viktig å ikke la LB-agarmediet størkne før tilsetning av antibiotika, da dette kan føre til ikke-homogen fordeling av antibiotika i LB-agarmediet.
    4. Hell 5 ml av hvert av de seks LB-agarmediene tilberedt i trinn 2.1.3 på en doseøkende måte i en 6-brønns kulturplate ved hjelp av en steril pipette. La agaren avkjøles til den stivner, og tørk platen før bruk.
      MERK: Forbered antibiotikaoppløsningen og kulturplaten dagen analysen utføres.
  2. MIC-bestemmelsesanalyse
    1. Inokuler 5 ml LB-medium med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser glassrøret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 o / min over natten (mellom 15 timer og 19 timer).
    2. Neste morgen måles OD600 nm, og fortynner kulturen i et reagensrør til en endelig celletetthet på 1 x 107 CFU · ml-1 i PBS. For stammene som er testet her, tilsvarer 1 x 107 CFU·mL−1 en OD600 nm på 0,0125.
      MERK: Hvis korrelasjonen mellom CFU·mL-1 og OD 600 nm ikke er kjent, bør vekstkurven bestemt av CFU- og OD 600 nm-målinger etableres for å beregne korrelasjonsfaktoren mellom CFU·mL-1 og OD600 nm.
    3. Spot 2 μL av den tidligere fortynnede kulturen på hver brønn i den tørkede 6-brønnsplaten. La flekkene tørke før du legger platen i en inkubator ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer).
    4. Neste dag, telle koloniene dannet i hver brønn. MIC tilsvarer brønnen med minimumskonsentrasjonen av antibiotika der det ikke oppdages bakterievekst.

3. Spot analyse

MERK: Spotanalysemetoden er en kvalitativ tilnærming som gjør det mulig å estimere antall levedyktige celler (celler som kan generere kolonier etter antibiotikastress). Spotanalysen utføres før time-kill-analysen for å gi innsikt i levedyktigheten til stammen som brukes under de testede forholdene og for å informere om fortynningene som trengs under time-kill-analysen (se avsnitt 4).

  1. For å forberede LB-agarplatene for spotanalyser, hell 50 ml LB-agar i en firkantet petriskål (144 cm2). Forbered en firkantet petriskål per tidspunkt. La LB-agaren stivne, og tørk platene før bruk.
  2. Inokuler 5 ml medium (MOPS glukose 0,4%) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer).
  3. Neste dag måles OD 600 nm, og fortynn kulturen til friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør (≥25 ml) til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten i en inkubator ved 37 °C ved 180 o/min (mellom 15 timer og 19 timer).
  4. Dagen etter måler du OD 600 nm, og ruger kulturen til en endelig OD600 nm på 0,3.
  5. Mens du inkuberer, klargjør 96-brønnplater ved å plassere 90 μL 0,01 M MgSO4-løsning i hver brønn unntatt brønnene i første rad (rad A). Platene med 96 brønner vil bli brukt til 10 ganger seriefortynning i trinn 3.7.
    MERK: I dette eksperimentet ble to stammer (wt og hupA-mCherry-stamme ) testet i triplikat på syv forskjellige tidspunkter. Siden en plate består av 12 søyler, kan en plate brukes til to tidspunkter, og dermed ble totalt fire plater preparert.
  6. Ved en OD600 nm på 0,3, trekk ut 200 μL av hver bakteriekultur. Disse prøvene tilsvarer t0 (ubehandlet) tidspunkt før antibiotikabehandlingen og tillater bestemmelse av CFU·mL-1 før antibiotikabehandlingen.
  7. Sentrifuger prøvene ved 2 300 x g i 3 minutter. I løpet av sentrifugeringstiden, tilsett ønsket konsentrasjon av OFX til væskekulturen, og fortsett å inkubere ved 37 °C mens du rister.
    MERK: Her ble OFX brukt i en konsentrasjon på 5 μg·mL-1 (tilsvarende MIC multiplisert 83 ganger). I en tidligere studie ble denne konsentrasjonen brukt til å karakterisere persistensfenomenet under OFX-eksponering25. Antibiotikakonsentrasjonen som brukes til tid / kill-analysene kan variere avhengig av antibiotika, kulturmediet og tilstanden til bakterievekst.
  8. Etter sentrifugering resuspenderes cellepelleten i 200 μL 0,01 MMgSO4-løsning . Plasser 100 μL i den tomme brønnen på 96-brønnplaten som ble klargjort i trinn 3.5. Utfør en fortynning ved å overføre 10 μL av brønnen i rad A til brønnen i rad B inneholdende 90 μL på 0,01 M MgSO4. Fortsett seriefortynningene ved å overføre 10 μL av brønnen i rad B til brønnen i rad C. Gjenta til du når en fortynning på 10-7 (hver overføring er en 10 ganger fortynning).
    MERK: I dette eksperimentet ble seks kulturer (tre for wt-stammen og tre for hupA-mCherry-stammen ) testet for hvert tidspunkt. I henhold til protokollen brukes en muti-kanal pipette til å utføre serielle fortynninger for de seks stammene samtidig. For å minimere den tekniske feilen endres pipettespissene mellom hver overføring.
  9. Spot 10 μL av hver fortynning på LB-agarplatene tilberedt i trinn 3.1.
    MERK: En flerkanals pipette brukes til samtidig å oppdage den samme fortynningen (f.eks. en 10-4 fortynning) for de seks kulturene. Under spottingen bør det første stoppet på flerkanalspipetten brukes uten å skyve det andre stoppet, da dette kan føre til at mikrodråper blir dispensert på platen.
  10. Ved relevante tidspunkter etter antibiotikatilsetningen trekkes 200 μL av dyrkningen ut og seriefortynninger som beskrevet i trinn 3.8. Spot 10 mikrol av hver fortynning som beskrevet i trinn 3.9.
    MERK: For eksperimentet beskrevet her ble syv tidspunkter samlet inn (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer som viser økt antibiotikafølsomhet sammenlignet med vekten, kan flere vasker i MgSO4 0,01 M utføres for å fjerne gjenværende antibiotika.
  11. Inkuber platene ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste dag teller du antall kolonier ved de to høyeste fortynningene som kolonier kan oppdages for. Ideelt sett inneholder flekkene på agarplatene for disse fortynningene mellom 3 og 30 kolonier som muliggjør nøyaktig bestemmelse av CFU·mL-1 for hver prøve.
  12. Beregn overlevelsesforholdet ved å dele den beregnede CFU·mL-1 for hvert tidspunkt med CFU·mL-1 i den opprinnelige populasjonen på t0.

4. Time-kill analyser

MERK: Mens spotanalyser er en brukervennlig metode for å estimere overlevelsesraten for en gitt stamme for et gitt antibiotika, gir tidsdrepende analyser en overlevelsesrate med høyere oppløsning og utføres for å kvantifisere bakteriell levedyktighet nøyaktig. Profilen til drapskurven kan brukes til å avgjøre om en gitt bakteriestamme er følsom, tolerant eller resistent mot antibiotika i en gitt tilstand. Videre tillater tidsdrepende analyser bestemmelse av tidspunktet for antibiotikaeksponering som er nødvendig for å oppdage persistensfenomenet (begynnelsen av den andre skråningen av den bifasiske drapskurven) samt persistensfrekvensen.

  1. Forbered LB-agarplater for tidsdrepende platinganalysen. Hell 25 ml LB-agar i en petriskål (±57 cm2). Forbered minst to petriskåler per tidspunkt (to fortynninger per tidspunkt per stamme er belagt).
  2. La LB-agaren stivne, og tørk platene før du tilsetter fem til åtte sterile glassperler på hver plate. Inverter og merk platene i henhold til belastningen/tilstanden/tidspunktet.
    MERK: Glassperler tillater spredning av bakterier på agarplatene i trinn 4.7 og trinn 4.9. Alternativt kan cellene dispergeres på agarplaten ved hjelp av en spreder.
  3. For hver prøve, lag 10 ganger serielle fortynningsglassrør inneholdende 900 μL 0,01 MMgSO4-løsning . Antall fortynnede glassrør per prøve som må fremstilles, tilsvarer fortynningene som trengs for å oppdage kolonier i punktanalysen.
  4. Inokuler 5 ml medium (MOPS glukose 0,4%) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer).
  5. Etter 16 timers vekst måles OD 600 nm, og fortynn kulturen til friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten i en inkubator ved 37 °C ved 180 o/min (mellom 15 timer og 19 timer).
  6. Dagen etter måler du OD 600 nm, og ruger kulturen til en endelig OD600 nm på 0,3.
  7. Ved en OD 600 nm på 0,3, trekk ut 100 μL av kulturen, fortynn i henhold til dataene oppnådd i spotanalysen (ved en OD600 nm på 0,3 og uten antibiotika gir en 10-5 fortynning vanligvis 200-300 kolonier), og plate100 μL på LB-agarplatene fremstilt i trinn 4.1-4.2. Rist platene forsiktig for å unngå at perlene kommer i kontakt med parabolkantene, da dette kan føre til en ikke-homogen spredning av bakteriecellene på LB-agarmediet. Denne første prøven før antibiotikabehandlingen tilsvarer t0-tidspunktet (CFU·mL-1 før antibiotikabehandling).
  8. Tilsett ønsket konsentrasjon av OFX, og fortsett å inkubere ved 37 °C mens du rister.
    MERK: Her ble OFX brukt i en konsentrasjon på 5 μg·mL-1 (tilsvarende MIC multiplisert 83 ganger).
  9. På relevante tidspunkter etter antibiotikatilsetningen, trekk ut 100 μL av kulturen, fortynn i henhold til dataene oppnådd i spotanalysen og plate 100 μL på LB-agarplatene fremstilt i trinn 4.1-4.2. Plat cellene som beskrevet i trinn 4.7.
    MERK: For eksperimentet beskrevet her ble syv tidspunkter samlet inn (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer som viser økt antibiotikafølsomhet sammenlignet med vekt, kan flere vasker i MgSO4 0,01 M utføres for å fjerne gjenværende antibiotika.
  10. Inkuber platene ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste dag teller du antall kolonier ved de to høyeste fortynningene som kolonier kan oppdages for. Ideelt sett bør platene inneholde 30-300 kolonier for å muliggjøre en nøyaktig bestemmelse av CFU·mL-1 i hver prøve.
  11. Beregn overlevelsesforholdet ved å normalisere CFU·mL-1 ved hvert tidspunkt av CFU·mL-1 ved t0. Plott loggen10 normalisert CFU·mL-1 som en funksjon av tid.

5. Mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiavbildning

MERK: Følgende avsnitt beskriver klargjøringen av den mikrofluidiske platen samt prosedyren for time-lapse-bildeopptak og bildeanalyse. Målet med dette eksperimentet er å observere og analysere persistensfenotypen ved antibiotikabehandling på encellenivå. Dataene som samles inn under dette eksperimentet, kan brukes til å generere et bredt spekter av resultater, avhengig av spørsmålet som er adressert og / eller fluorescerende reportere som ble brukt under forsøket. I forsøket beskrevet her ble det utført kvantitativ analyse av cellelengden og HU-mCherry-fluorescens22, som reflekterer nukleoidorganisasjonen i persister- og ikke-persisterceller.

  1. Bakteriell cellekultur for mikrofluidisk timelapsemikroskopi
    1. Inokuler 5 ml medium (MOPS glyserol 0,4%, supplert med et selektivt antibiotika om nødvendig) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og legg røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer).
    2. Neste dag måles OD 600 nm, og fortynn kulturen i friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten (mellom 15 timer og 19 timer) i en ristende inkubator ved 37 ° C og 180 o / min for å oppnå en tidlig eksponentiell fasekultur neste dag.
  2. Fremstilling av mikrofluidplaten og time-lapse-mikroskopiavbildning
    MERK: Mikrofluidiske eksperimenter kan utføres i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter (som beskrevet her) eller i egenproduserte mikrofluidiske systemer.
    1. Fjern konserveringsløsningen (hvis den finnes) fra hver brønn i den mikrofluidiske platen, og erstatt den med et friskt kulturmedium.
      MERK: Hvis mikrofluidplaten inneholder en avløpsbrønn, bør konserveringsløsningen i utløpsbrønnen fjernes, men ikke erstattes av mediet.
    2. Forsegl den mikrofluidiske platen med manifoldsystemet ved å klikke på Seal-knappen eller gjennom den mikrofluidiske programvaren (velg først Verktøy, etterfulgt av Seal Plate).
      MERK: For å forsegle platen, bør et jevnt trykk påføres platen og manifolden ved å klemme platen manuelt mot manifolden. Hvis det utføres riktig, skal notatet "forseglet" vises på ONIX2-grensesnittet. Det er viktig å ikke legge noe trykk på glassglasset for å unngå potensiell risiko for å bryte manifolden.
    3. Når den er forseglet, utfør en første grunningssekvens (klikk på Kjør flytende primingssekvens på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet).
      MERK: Run Liquid Priming Sequence tilsvarer 5 min perfusjon ved 6,9 kPa for brønn 1-5, etterfulgt av 5 min perfusjon ved 6,9 kPa for brønn 8, og en siste perfusjonsrunde for brønn 6 i 5 min ved 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gjør det mulig å fjerne konserveringsløsningen som fortsatt kan være tilstede i kanalene som forbinder de forskjellige brønnene.
    4. Inkuber platen i et termostatstyrt kabinett i mikroskopet ved ønsket temperatur (her 37 °C) i minimum 2 timer før mikroskopiavbildningen starter.
    5. Start en ny Run Liquid Priming Sequence før du begynner eksperimentet.
    6. Forsegle den mikrofluidiske platen ved å klikke på Seal off på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet. Erstatt mediet i brønn 1 og brønn 2 med 200 μL ferskt medium, i brønn 3 med 200 μL ferskt medium som inneholder antibiotikumet (her OFX ved 5 μg·ml−1), i brønn 4 og brønn 5 med 200 μL ferskt medium, i brønn 6 med 200 μL ferskt medium, og i brønn 8 med 200 μL av dyrkningsprøven (fra trinn 5.1.2) fortynnet til en OD600 nm på 0,01 i friskt medium.
    7. Forsegl den mikrofluidiske platen som beskrevet i trinn 5.2.2, og plasser platen på mikroskopmålet inne i mikroskopskapet.
      MERK: Sørg for å plassere en dråpe nedsenkningsolje på mikroskopmålet før du plasserer mikrofluidplaten.
    8. I den mikrofluidiske programvaren klikker du på Cell Loading for å la cellen lastes inn i den mikrofluidiske platen.
      MERK: Cell Loading-trinnet består av 15 s perfusjon ved 13,8 kPa for brønn 8, etterfulgt av 15 s perfusjon ved 27,6 kPa for brønn 6 og brønn 8, og en siste perfusjonsrunde for brønn 6 for 30 s ved 6,9 kPa. Tettheten av cellene i den mikrofluidiske platen er kritisk for forsøket. Den første delen av denne mikrofluidiske protokollen består av voksende bakterier i 6 timer i et friskt medium før antibiotikabehandlingen. Etter 6 timers vekst må celletettheten være tilstrekkelig til å oppdage de sjeldne persistercellene (under forholdene som brukes i denne studien, genererer persistercellene med en frekvens på 10-4). Hvis celletettheten er for høy, er det vanskelig å skille de enkelte cellene, noe som forhindrer presis enkeltcelleanalyse. Siden veksthastigheten er direkte avhengig av mediet, bør tettheten av celler i mikroskopifeltene vurderes før forsøket starter.
    9. Angi et optimalt fokus ved hjelp av overført lysmodus, og velg flere interesseområder (ROI) der et passende cellenummer observeres (opptil 300 celler per felt).
      MERK: Velg minst 40 avkastning for å sikre at de sjeldne persistercellene er avbildet.
    10. På mikrofluidisk programvare klikker du på Opprett en protokoll. Programmer injeksjon av ferskt medium ved 6,9 kPa i 6 timer (brønn 1-2), etterfulgt av injeksjon av mediet som inneholder antibiotika ved 6,9 kPa i 6 timer (brønn 3), og til slutt injeksjon av ferskt medium ved 6,9 kPa i 20 timer (brønn 4-5).
      MERK: En bakteriekultur fortynnet til en OD600 nm på 0,01 tillater bakterier å vokse i mikrofluidisk kammer i 6 timer, slik at cellene er i eksponentiell vekstfase. Avhengig av antall celler som føres inn i den mikrofluidiske enheten under lastetrinnet (se trinn 5.2.8), kan varigheten av vekstfasen tilpasses for å oppnå opptil 300 celler per avkastning. Siden utholdenhet er et sjeldent fenomen, øker antall celler per avkastning muligheten for å observere persisterceller. Celletallet bør imidlertid ikke overstige 300 celler per avkastning, da dette gjør enkeltcelleanalyse kjedelig.
    11. Utfør mikroskopiavbildning i time-lapse-modus med en ramme hvert 15. minutt ved hjelp av overført lys og eksitasjonslyskilden for den fluorescerende reporteren. Her ble det brukt en 560 nm eksitasjonslyskilde for mCherry-signalet (580 nm LED ved 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] og 100 ms eksponering for mCherry). Den Zeiss-kompatible Zen3.2-programvaren ble brukt til celleavbildning.
  3. Bildeanalyse
    MERK: Åpning og visualisering av mikroskopibildene utføres med åpen kildekode-programvaren ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)26. Den kvantitative bildeanalysen utføres ved hjelp av åpen kildekode ImageJ / Fiji-programvaren og den gratis MicrobeJ-plugin (https://microbej.com) 27. I denne protokollen ble MicrobeJ 5.13I(14)-versjonen brukt.
    1. Åpne ImageJ/Fiji-programvaren på datamaskinen, og dra tidsforkortelsesmikroskopibildene med hyperstack til Fiji-lastestangen. Bruk Bilde > farge > Lag kompositt for å smelte sammen de forskjellige kanalene i hyperstakken. Hvis kanalene i intervalleksperimentet ikke samsvarer med ønsket farge (f.eks. hvis fasekontrasten vises i rødt i stedet for grått), bruker du Bilde > farge > Ordne kanaler for å bruke riktig farge på kanalene.
    2. Åpne MicrobeJ-pluginet, og oppdag bakteriecellene ved hjelp av det manuelle redigeringsgrensesnittet. Slett de automatisk oppdagede cellene, og skisser manuelt de vedvarende cellene av interesse ramme for ramme.
      MERK: Ulike innstillinger kan brukes til å oppdage individuelle celler automatisk. Manuell deteksjon ble brukt her da de analyserte persistercellene danner lange filamenter, som sjelden oppdages riktig ved hjelp av automatisk deteksjon.
    3. Etter gjenkjenning bruker du resultatikonet i det manuelle redigeringsgrensesnittet for MicrobeJ til å generere en ResultJ-tabell. Lagre ResultJ-filen, og bruk ResultJ-tabellen til å få innsikt i ulike parametere av interesse for enkeltcelleanalysen. I tilfelle av denne protokollen ble den gjennomsnittlige fluorescensen av HU-mCherry-intensiteten, cellelengden og celleområdet til individuelle celler eksportert.

Representative Results

Som beskrevet ovenfor ble stammene som ble brukt til encellet fenotypisk analyse av persisterceller karakterisert i MOPS glyserol 0,4% medium. Overvåkingen av OD600 nm over tid viste ingen forskjell mellom vekt - og hupA-mCherry-stammene (figur 1). Dette indikerer at ekspresjonen av HU-mCherry-fusjonsproteinet ikke påvirket veksten under disse forholdene. Bakteriecellene i begge stammene som opprinnelig ble inokulert ved en OD600 nm på 0,01, nådde eksponentiell fase ±8 timer etter inokulering.

MIC av OFX ble bestemt ved standardiserte metoder (her seriell agarfortynning)24. MIC er definert som den minimale konsentrasjonen der ingen synlig vekst oppdages. MIC for OFX for begge stammene ble bestemt til å være 0,06 μg·ml−1, noe som indikerer at hupA-mCherry-fusjonen ikke hadde noen effekt på sensitiviteten til OFX sammenlignet med den isogene vektstammen (figur 2).

Vi bestemte videre effekten av en dødelig OFX-behandling (83 ganger MIC) på levedyktigheten til begge stammene som ble brukt i denne studien. Ettersom det levedyktige celletallet reduseres over tid med OFX-eksponering, må fortynningene av bakteriekulturer justeres på riktig måte for å nå 30 til 300 kolonier per plate. For å bestemme passende fortynninger over tid ble det utført en spotanalyse, hvor 10 μL fra 0 til 10-7 serielle 10 ganger fortynninger ble plassert på firkantede petriskåler ved bruk av en flerkanalspipette. De riktige fortynningene var de der isolerte kloner var synlige (f.eks. ved t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (figur 3).

Mens spotanalysen er en enkel metode for å få innsikt i kinetikken til OFX-mediert drap, klarer den ikke å bestemme drapsdynamikken nøyaktig. Når levedyktigheten til eksponentielt voksende celler behandlet med OFX ble overvåket med time-kill-analysen, ble det observert en typisk bifasisk kurve (figur 4). Den første helningen på kurven gjenspeiler den raske drapet av den ikke-persisterende populasjonen (rød stiplet linje). Under forholdene som ble testet her, var opptil 99,9% av cellene ikke i stand til å danne kolonier etter 3 timer i nærvær av OFX. Denne første fasen av drap etterfølges av en andre fase, som viser en langsommere drapsrate (blå stiplet linje), som avslører tilstedeværelsen av narkotikatolerante persisterceller. Under de testede forholdene startet den vedvarende fasen rundt 3 timer etter OFX-tillegget, noe som understreker nødvendigheten av å eksponere cellene for OFX i mer enn 3 timer for å undersøke de persisterende fenotypene. Det er viktig at time-kill-kurven viser at hupA-mCherry-fusjonsproteinet ikke hadde noen effekt på tidsdrepende kinetikk. Stammen som koder for translasjonell fluorescerende fusjon kan derfor brukes til å overvåke persistercellene ved hjelp av fluorescensmikroskopi.

Vi fortsatte videre med å undersøke persistensfenomenet på encellenivå. For å gjøre dette ble hupA-mCherry-stammen introdusert i en mikrofluidisk plate, som tillot endring av middels forhold (her vekst, behandling og gjenoppretting) mens du utførte time-lapse-mikroskopi på en gitt avkastning. Under det første trinnet i det mikrofluidiske eksperimentet ble cellene introdusert i den mikrofluidiske enheten perfusert med vekstmedium (MOPS-glyserol 0,4%) og delt med en generasjonstid på ~ 2 timer (figur 5 og figur 6). Denne første vekstfasen indikerer at cellene var levedyktige og aktivt delte seg før OFX-behandlingen.

Etter denne første vekstfasen ble cellene perfundert med vekstmedium supplert med 5 μg·ml−1 OFX i 6 timer. Så snart antibiotika nådde cellene, ble celledeling blokkert (figur 5 og figur 6). Etter 6 timers OFX-behandling ble cellene perfundert med ferskt medium. Mens det store flertallet av cellene ikke var i stand til å gjenoppta veksten (figur 5 og figur 6), var en liten underpopulasjon av bakterier i stand til å forlenge og generere filamentøse celler25. Disse cellene, som var i stand til å dele seg og generere levedyktige datterceller etter OFX-behandlingen, kan defineres som persistercellene.

Siden dette oppsettet tillater visualisering av persistercellene før, under og etter behandling, gir det ikke bare informasjon om persisterfenotypen i gjenopprettingsfasen, men også om den fysiologiske tilstanden til persistercellene før behandlingen (figur 6). Under de testede forholdene delte de persisterende cellene seg på samme måte som ikke-persisterende celler før OFX-behandlingen, noe som indikerer at de observerte persistercellene ikke stammer fra en sovende subpopulasjon (figur 6) 25.

Cellelengdeanalysen av persisterceller i gjenopprettingsfasen viste at hvert filament hadde en bestemt forlengelseshastighet. Cellelengden som ble nådd av hver persister før den første delingen, varierte fra en persister til en annen. Tilsvarende var tidspunktet for førstedivisjonshendelsen svært heterogent (figur 6). Det delende persisterfilamentet genererte flere datterceller, som begynte å vokse og dele seg, for det meste, på samme måte som ubehandlede celler (figur 7). Den suksessive delingen av filamentet resulterte da i en progressiv reduksjon i cellelengden, noe som til slutt ga opphav til datterceller med lignende cellelengde som før OFX-behandlingen (figur 6 og figur 7B). De aller fleste cellene var ikke i stand til å indusere filamentering etter fjerning av OFX. Denne store cellepopulasjonen tilsvarer de døde cellene (figur 5 og figur 6).

Den fluorescerende fusjonen av det nukleoidassosierte proteinet HU muliggjør visualisering av dynamikken til nukleoid22. Analysen av den totale fluorescensintensiteten av HU-mCherry i cellen kan brukes som en proxy for DNA-innholdet22,25. Under vekstfasen (før OFX-behandling) varierte den totale mCherry-fluorescensintensiteten, noe som gjenspeiler dynamikken i kromosomreplikasjon og segregering under cellesyklusen (figur 8). Etter OFX-tillegg økte mCherry-fluorescensen ved midtcellen, noe som indikerer nukleoidkomprimering, som har vist seg å være indusert ved dannelse av dobbeltstrenget DNA-brudd28 (figur 5). Dobbeltstrengede DNA-brudd er en konsekvens av virkningsmekanismen til OFX, som ødelegger type II-topoisomerasene DNA-gyrase og topoisomerase IV29,30. I E. coli er DNA-gyrase det primære målet for OFX29,30. Ved å binde målet på et kritisk trinn i dobbeltstrengspassasjemekanismen, hemmer OFX nedrykket til de spaltede DNA-strengene, noe som til slutt fører til frigjøring av dobbeltstrenget DNA-brudd30. Som beskrevet ovenfor begynte persistercellene til OFX-behandling å filament under gjenoppretting25 (figur 6). Økningen i cellelengde korrelerte med en økning i den totale mCherry-fluorescensintensiteten, noe som gjenspeiler replikasjonsstart og en økning i nukleoidmengden i filamentet25 (figur 7a og figur 8). For døde celler var den totale mCherry-fluorescensintensiteten stabil under behandlingen og under restitusjonsfasen, noe som indikerer at disse cellene ikke var i stand til å replikere kromosomene sine etter fjerning av OFX (figur 8). Mikrofluidisk video (Video 1) av E. coli HU-mCherry-celler før, under og etter ofloksacinbehandling er også vist.

Figure 1
Figur 1: Vekstovervåking av vekt - og hupA-mCherry E. coli-stammer. Optisk tetthetsovervåking (OD600 nm) av vekten (svart) og hupA-mCherry (rød). Nyanser og stiplede linjer indikerer standardavvikene til de biologiske triplikatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bestemmelse av MIC av OFX for vekt - og hupA-mCherry E. coli-stammene. Vekten () og hupA-mCherry (●) ble dyrket i LB-medium, og 2 μL ble flekket på seriefortynninger av OFX-inneholdende LB-agar (♦ konsentrasjon angitt i hvert panel i μg·ml−1). Veksthemming er synlig ved minimum 0,06 μg·mL−1. Figuren er et representativt eksperiment av biologiske triplikater. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Spotanalyse av vekt - og hupA-mCherry E. coli-stammer ved eksponering for OFX. (A) vekt - og (B) hupA-mCherry-stammene ble dyrket i MOPS-glyserol 0,4 % som beskrevet i protokollen (avsnitt 3), og de eksponentielt voksende cellene (OD600 nm = 0,3) ble behandlet med 5 μg·ml−1 OFX. T0 tilsvarer tidspunktet før tilføyelsen av OFX. T1, T2, T3, T4, T5 og T6 tilsvarer 1-6 timer etter OFX-tillegget. Figuren er et representativt eksperiment av biologiske triplikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Time-kill analyse av wt og hupA-mCherry E. coli-stammer ved eksponering for OFX. Vekt - (♦) og hupA-mCherry-stammene (●) ble dyrket i MOPS-glyserol 0,4 % som beskrevet i protokollen (avsnitt 4), og de eksponentielt voksende cellene (OD600 nm = 0,3) ble behandlet med 5 μg·mL−1 OFX. De stiplede linjene indikerer den første "raske" (røde) drapsfasen og den andre "langsomme" (blå) drapsfasen, tilsvarende de følsomme og vedvarende subpopulasjonene (oppnådd ved lineær regresjon mellom T0 og T2, samt mellom henholdsvis T3 og T6). Feilfeltene angir standardavvikene til de biologiske triplikatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av OFX-persisteren og døde celler ved hjelp av mikrofluidiske verktøy. Representative mikroskopibilder som viser relevante tidspunkter for det mikrofluidiske eksperimentet utført med hupA-mCherry-stammen (fasekontrast i grått, HU-mCherry-signal i rødt). Cellene som uttrykker det merkede hupA-mCherry ble dyrket i en mikrofluidisk plate (her 4 timer), etterfulgt av en OFX-utfordring (5 μg·mL−1). Etter 6 timer i nærvær av OFX ble cellene perfusert med friskt medium, slik at de persisterende cellene kunne gjenopprette. Persistercellen og dens avkomceller under OFX-behandlingen og etter OFX-fjerning er uthevet i henholdsvis grønt og blått. De tilsvarende tidspunktene er angitt på hvert panel. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Mikroskopi timelapse-analyse av lengden på persister og døde celler. Cellelengdeanalyse av døde celler (i rødt, n = 109) og persisterceller (i grått, n = 13). Starten av OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) indikeres av den rødstiplede linjen (5 timer), og OFX-fjerningen indikeres av den blå stiplede linjen. Innsatsen tilsvarer vekstfasen før OFX-tillegg. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer. Skyggene og de stiplede linjene angir standardavvikene for dødcellepopulasjonen (n = 109). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7 Mikroskopi timelapse-analyse av en representant persistent til OFX. (A) Kymograph av en representativ OFX-persister og dens datterceller generert av filamentdelinger i løpet av 8,5 timer etter fjerning av OFX (18,5 timer etter begynnelsen av det mikrofluidiske eksperimentet, bestående av 4 timers vekst, 6 timer med 5 μg·ml-1 OFX-behandling og 8,5 timers restitusjon etter fjerning av OFX). En ramme tilsvarer 15 min. Skala bar = 5 μm. (B) Maske generert fra persister kymograph i A. Den overvåkede persistercellen er indikert med et blått omriss, og dattercellene er uthevet i forskjellige farger. (C) Skjematisk fremstilling av persistercellelinjen generert fra B. Fargekodingen er identisk med B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Cellelengde og mCherry fluorescensanalyse av representative persister- og døde celler. Analyse av cellelengden (venstre akse) og den totale HU-mCherry-fluorescensintensiteten (høyre akse, vist i vilkårlige enheter) av en representativ persister (solide svarte og røde linjer) og en representativ død celle (stiplet svart og rød linje) under det mikrofluidiske time-lapse-eksperimentet. Starten av OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) indikeres av den rødstiplede linjen og OFX-fjerningen med den blå stiplede linjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Mikrofluidisk video av E. coli HU-mCherry-celler før, under og etter ofloksacinbehandling. Mikrofluidisk timelapse-avbildning som viser HU-mCherry-celler. Cellene ble dyrket i 4 timer i MOPS glyserol 0,4%. Etter 6 timers OFX-behandling (5 μg·ml−1) ble det antibiotikafrie mediet perfundert i den mikrofluidiske platen slik at de persistente cellene kunne komme seg. Skala bar = 5 μm. Tid (i min) er angitt. Vekst- og gjenopprettingsfasene er indikert med "MOPS- Gly. 0,4 %" og OFX-behandlingen med "OFX 5 μg/ml". Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

10x MOPPER
Lagerløsning Volum av lagerløsning for 1 l 10x MOPS Endelig konsentrasjon i 10x MOPS base
MOPS-syre 1 M (justert til pH 7,4 ved bruk av KOH) 400 ml 0,4 m
Tricine 1 M (justert til pH 7,4 ved bruk av KOH) 40 ml 0,04 M
FeSO4.7H2O 0,01 M 10 ml 0,0001 M
NH4Cl 1,9 M 50 ml 0,095 moh
K2SO4  0,276 moh 10 ml 0,00276 moh
CaCl2,2H 2O 0,0005 M 10 ml 0,000005 M
MgCl 2.6H2O 0,528 moh 10 ml 0,00528 moh
NaCl legg direkte 29,2 g 0,5 m
Destillert vann 460 ml
Mikronæringsstoffer 1000x (se tabell 2) 10 ml

Tabell 1: Sammensetning av 10x MOPS.

Mikronæringsstoffer 1000x
Konsentrasjon i mikronæringsstoffer 1000x stamløsning Endelig konsentrasjon i 10x MOPS base
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,000003 M 0,00000003 M
H 3BO3 0,0004 moh 0,000004 moh
CoCl2.6H 2O 0,00003 M 0,0000003 M
CuSO4.5H 2O 0,00001 M 0,0000001 M
MnCl2.4H 2O 0,00008 M 0,0000008 M
ZnSO.7H2O 0,00001 M 0,0000001M

Tabell 2: Sammensetning av 1000x mikronæringsstoffer.

MOPS glukose 0,4% eller MOPS glyserol 0,4%
Lagerløsning Volum for 1 l MOPS glukose 0,4 % eller MOPS glyserol 0,4 % Endelig konsentrasjon i MOPS glukose 0,4% eller MOPS glyserol 0,4%
10x MOPPER se tabell 1 100 ml
K2HPO4 0,132 moh 10 ml 0,00132 moh
Glukose (for MOPS glukose 0,4%) 20% (20 g i 100 ml destillert vann) 20 ml 0.40%
Glyserol (for MOPS glyserol 0,4%) ≤99% 4 ml 0.40%
Destillert vann 870 ml for MOPS glukose 0,4% eller 886 ml for MOPS glyserol 0,4%

Tabell 3: Sammensetning av MOPS glukose 0,4% og MOPS glyserol 0,4%.

Discussion

Protokollen presentert i denne artikkelen tillater analyse av persistensfenotypen observert som respons på antibiotikabehandling på populasjons- og enkeltcellenivå. Forsøkene ble utført med E. coli MG1655-stammen, som ble dyrket i et kjemisk definert medium (MOPS-glyserol 0,4%). Time-kill-analyser og mikroskopiforsøk ble utført på eksponentielle fasekulturer. Vi brukte OFX, et fluorokinolon, i en konsentrasjon på 5 μg·ml-1 for å avdekke persistercellene. Tilnærmingene beskrevet her kan brukes på andre bakteriedrepende antibiotika, som β-laktamer, aminoglykosider eller antimikrobielle forbindelser31. Følgelig kan andre bakteriestammer, medier eller vekstbetingelser brukes. Overvåking av forskjellige fluorescerende fusjoner i et lignende oppsett som det som er beskrevet her, kan være nyttig for å følge cellulære prosesser som DNA-replikasjon32, DNA-reparasjon25,33 og celledeling34 før, under og etter antibiotikabehandlingen. På samme måte kan fluorescerende reportere utnyttes til å undersøke forskjellige aspekter av cellefysiologi, for eksempel intracellulær pH35, ATP 36 eller ROS37 nivåer. Alternativt til fluorescerende fusjoner kan kjemiske fargestoffer også påføres. For eksempel kan hupA-mCherry-fusjonen erstattes av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), et fluorescerende fargestoff som flekker DNA38. Utførelse av time-lapse-mikroskopi kombinert med slike fluorescerende fargestoffer bør imidlertid unngås, da disse fargeteknikkene kan forstyrre dynamikken i cellesyklusen under time-lapse-eksperimenter. Alternativt kan slike eksperimenter erstattes av tidskursanalyser av øyeblikksbildeavbildning på relevante tidspunkter.

Selv om slike fluorescerende reportere er nyttige, bør mengden informasjon som kan trekkes ut gjennom analyse av fasekontrastbilder, ikke overses. Her overvåket vi cellelengdeutviklingen gjennom vekst-, OFX-behandlings- og gjenopprettingsstadiene. Andre parametere basert på fasekontrastbilder, som cellebredde, fasekontrastintensitet og krumninger i bakteriecellene, kan også ekstraheres med letthet ved å bruke tilstrekkelig programvare, for eksempel MicrobeJ27.

Oppsummert kan prosedyren beskrevet her brukes på andre forhold og bakteriearter for å overvåke cellulære responser på skiftende miljøer eller stressorer18,19. Ved å bruke andre fluorescerende reportere (transkripsjons- og translasjonsreportere, kjemisk fargestoff) i kombinasjon med en populasjonsanalyse, som flowcytometri/FACS, kan interessante spørsmål besvares i et multiskala rammeverk.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Arbeidet i Van Melderen-laboratoriet støttes av ARC-aksjonene 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. støttes av et ULB-stipend. TS støttes av et FRIA-fellesskap (FNRS). J.C. støttes av et postdoktorstipend "chargé de recherches" (FNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer Zeiss Inverted fluorescence microscope
CaCl2.2H2O  Merck 1.02382.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CellASIC ONIX Microfluidic System  Merck CAX2-S0000  Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG Merck ONIX2 1.0.1  Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic  Merck CAX2-MBC20 Manifold system
CoCl2.6H2O Merck 1.02539.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CuSO4.5H2O Merck 1.02790.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
D-(+)-glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) BE10 wt reference strain, lab strain
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT BE16 HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain
FeSO4.7H2O  VWR Chemicals 24244.232 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Fiji ImageJ https://fiji.sc/  Image software; Schindelin et al. if used in publication
Glycerol Merck 56815 Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate Merck M8812-100EA 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader
H3BO3  Sigma-Aldrich B6768-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera Hamamatsu C13440-20CU Digital Image Acqusition
K2HPO4 Merck 1.05099.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
KOH Merck 1.05029.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
K2SO4  Merck 1.05153.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Luria-Broth agar medium Invitrogen 22700041 Growth medium for plating assay
Luria-Broth medium Invitrogen 12780029 Growth medium for MIC determination
MgCl2.6H2O  Merck 1.05832.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MgSO4 Merck 7487-88-9 Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM
MicrobeJ  Imagej/Fiji plugin https://www.microbej.com/ Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. 
Microfluidic Plates CellASIC ONIX Merck B04A-03-5PK  Plate for microfluidic system
MnCl2.4H2O Merck 1.05927.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade Merck 475898-500GM For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NaCl SIgma-Aldrich S5886-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
(NH4)6Mo7O24.4H2O Merck 1.01180.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NH4Cl  Merck 1.01145.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Ofloxacin Merck 82419-36-1 Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x Merck P3813 Dilution buffer
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer Thermofisher Scientific  840-208200 UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm
SoftMax Pro Molecular Devices Microplate reader software
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine Merck 1.08602.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Zeiss® immersion Oil 518F Zeiss Immersion oil to increase resolution of microscope
Zen3.2 Pro Zeiss Microscopic image acquisition and processing software
ZnSO4.7H2O  Merck 1.08883.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
  2. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  3. Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074 (2022).
  4. Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
  5. Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
  6. Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).
  7. Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).
  8. Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
  9. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).
  10. Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).
  11. Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
  12. Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
  13. Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).
  14. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  15. Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
  16. Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).
  17. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  18. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
  19. Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).
  20. Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
  21. Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).
  22. Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
  23. Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).
  24. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
  25. Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
  28. Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
  29. Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. Quinolone antibiotics. MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).
  30. Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
  31. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  32. Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
  33. Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
  34. Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
  35. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  36. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
  37. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  38. Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).

Tags

Biologi utgave 193 Antibiotikapersistens populasjonsanalyse encelleanalyse Escherichia coli ofloksacin fluorescensmikroskopi mikrofluidikk
Populasjons- og enkeltcelleanalyse av antibiotikapersistens i <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron,… More

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron, J., Van Melderen, L. Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (193), e64550, doi:10.3791/64550 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter