Summary
Het protocol beschrijft licht traumatisch hersenletsel in een muismodel. In het bijzonder wordt een stapsgewijs protocol om een milde middellijn gesloten hoofdletsel en de karakterisering van het diermodel te induceren volledig uitgelegd.
Abstract
Zeer reproduceerbare diermodellen van traumatisch hersenletsel (TBI), met goed gedefinieerde pathologieën, zijn nodig voor het testen van therapeutische interventies en het begrijpen van de mechanismen van hoe een TBI de hersenfunctie verandert. De beschikbaarheid van meerdere diermodellen van TBI is noodzakelijk om de verschillende aspecten en ernst van TBI bij mensen te modelleren. Dit manuscript beschrijft het gebruik van een midline closed head injury (CHI) om een muismodel van milde TBI te ontwikkelen. Het model wordt als mild beschouwd omdat het geen structurele hersenletsels produceert op basis van neuroimaging of grof neuronaal verlies. Een enkele impact creëert echter voldoende pathologie dat cognitieve stoornissen ten minste 1 maand na het letsel meetbaar zijn. Een stapsgewijs protocol om een CHI bij muizen te induceren met behulp van een stereotaxisch geleide elektromagnetische impactor is gedefinieerd in het artikel. De voordelen van het milde midline CHI-model omvatten de reproduceerbaarheid van de door letsel veroorzaakte veranderingen met een lage mortaliteit. Het model is tijdelijk gekarakteriseerd tot 1 jaar na het letsel voor neuroimaging, neurochemische, neuropathologische en gedragsveranderingen. Het model is complementair aan open schedelmodellen van gecontroleerde corticale impact met behulp van hetzelfde impactorapparaat. Zo kunnen laboratoria zowel milde diffuse TBI als focale matige tot ernstige TBI modelleren met dezelfde impactor.
Introduction
Traumatisch hersenletsel (TBI) wordt veroorzaakt door een externe kracht op de hersenen, vaak geassocieerd met vallen, sportblessures, fysiek geweld of verkeersongevallen. In 2014 stelden de Centers for Disease Control and Prevention vast dat 2,53 miljoen Amerikanen de afdeling spoedeisende hulp bezochten om medische hulp te zoeken voor TBI-gerelateerde ongevallen1. Aangezien milde TBI (mTBI) de meerderheid van de TBI-gevallen vertegenwoordigt, zijn in de afgelopen decennia meerdere modellen van mTBI aangenomen, waaronder gewichtsval, zuigeraangedreven gesloten hoofdletsel en gecontroleerde corticale impact, rotatieletsel, mild vloeistofpercussieletsel en blastaire letselmodellen 2,3. De heterogeniteit van de mTBI-modellen is nuttig om de verschillende kenmerken aan te pakken die geassocieerd zijn met mTBI die bij mensen worden gezien en om de cellulaire en moleculaire mechanismen geassocieerd met hersenletsel te helpen evalueren.
Van de meest gebruikte modellen van gesloten hoofdletsel is een van de eerste en meest gebruikte modellen de gewichtsvalmethode, waarbij een voorwerp van een bepaalde hoogte op het hoofd van het dier wordt laten vallen (verdoofd of wakker)2,4. Bij de gewichtsvalmethode hangt de ernst van het letsel af van verschillende parameters, waaronder al dan niet uitgevoerde craniotomie, hoofd vast of vrij, en de afstand en het gewicht van het vallende voorwerp 2,4. Een nadeel van dit model is de hoge variabiliteit in de ernst van het letsel en het hoge sterftecijfer geassocieerd met ademhalingsdepressie 5,6. Een veel voorkomend alternatief is om de impact af te leveren met behulp van een pneumatisch of elektromagnetisch apparaat, wat direct op de blootgestelde dura (gecontroleerde corticale impact: CCI) of gesloten schedel (gesloten hoofdletsel: CHI) kan worden gedaan. Een van de sterke punten van de zuigeraangedreven blessure is de hoge reproduceerbaarheid en lage mortaliteit. CCI vereist echter craniotomie 7,8 en een craniotomie zelf induceert ontsteking9. In plaats daarvan is er in het CHI-model geen craniotomie nodig. Zoals gezegd heeft elk model beperkingen. Een van de beperkingen van het CHI-model dat in dit artikel wordt beschreven, is dat de operatie wordt uitgevoerd met behulp van een stereotaxisch frame en dat het hoofd van het dier wordt geïmmobiliseerd. Hoewel de volledige immobilisatie van het hoofd de reproduceerbaarheid garandeert, houdt het geen rekening met beweging na de impact die zou kunnen bijdragen aan het letsel dat gepaard gaat met een mTBI.
Dit protocol beschrijft een basismethode om een CHI-impact uit te voeren met een in de handel verkrijgbaar elektromagnetisch impactorapparaat10 in een muis. Dit protocol beschrijft de exacte parameters die nodig zijn om een zeer reproduceerbare verwonding te bereiken. In het bijzonder heeft de onderzoeker nauwkeurige controle over de parameters (diepte van het letsel, verblijftijd en snelheid van impact) om de ernst van het letsel nauwkeurig te definiëren. Zoals beschreven, produceert dit CHI-model een verwonding die resulteert in bilaterale pathologie, zowel diffuus als microscopisch (d.w.z. chronische activering van glia, axonale en vasculaire schade), en gedragsfenotypen 11,12,13,14,15. Bovendien wordt het beschreven model als mild beschouwd omdat het geen structurele hersenletsels induceert op basis van MRI of grove laesies op pathologie, zelfs niet 1 jaar na het letsel16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De uitgevoerde experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky, en zowel de ARRIVE als de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals richtlijnen werden gevolgd tijdens de studie.
1. Chirurgische opstelling
OPMERKING: Muizen worden gehuisvest in groepen van 4-5 / kooi, de luchtvochtigheid in de huisvestingsruimte wordt gehandhaafd op 43% -47% en de temperatuur wordt gehandhaafd op 22-23 ° C. Muizen krijgen ad libitum toegang tot voedsel en water en worden blootgesteld aan een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur (7.00 uur/19.00 uur).
- Gebruik een aangewezen chirurgisch gebied, zoals een kap of een speciale chirurgische procedurekamer, om de dieroperatie uit te voeren.
- Zorg ervoor dat het operatiegebied een verwarmingskussen, een stereotaxisch frame uitgerust met een elektromagnetische impactor en een anesthesiemasker bevat dat is ontworpen om isofluraangas toe te dienen (zie figuur 1A).
- Zorg ervoor dat de chirurg of het personeel dat betrokken is bij de operatie een schone laboratoriumjas, een gezichtsmasker, handschoenen en een chirurgische pet draagt.
- Gebruik steriele chirurgische hulpmiddelen, steriele applicators met katoenpunt en gaasjes. Gebruik een hete kralensterilisator om de instrumenten tussen muizen te steriliseren tijdens de dag van de operatie.
- Gebruik een anesthesie-inductiekamer om de muis voor te bereiden op een operatie in een preoperatief gebied.
- Gebruik verwarmingspads om de temperatuur van het dier te handhaven, reinig postoperatieve kooien voor muizen en timers om de rechtrichtreflex van de muis na de operatie vast te leggen.
2. Pre-operatieve procedure
- Bereid het hoofdsteunapparaat voor (zie figuur 1B).
- Verwijder de gewalste eindrand van een latexpipetbol van 1 ml (opblaasbaar uiteinde) (zie figuur 1C).
- Bevestig de bol aan de slang met behulp van parafilm (zie figuur 1C).
- Sluit de slang aan op een spuit van 10 ml met behulp van een stopkraan. Vul de spuit met water (zie figuur 1C).
OPMERKING: De latex pipetbol van 1 ml wordt onder de kop van de muis geplaatst om de slagkracht van de oren te verwijderen. Probeer voor gebruik zoveel mogelijk lucht uit de lamp te halen, zodat de lamp met voornamelijk water wordt gevuld en niet met lucht.
- Impactor instellen.
- Selecteer de 5 mm sondepunt, schroef deze op de zuiger in het midden onderaan de actuator (in de grotere cilinder) en draai de sonde voorzichtig vast zonder overmatige kracht uit te oefenen. Draai de punt tussen de botsingen opnieuw vast (zie figuur 1B).
- Voordat u het botslichaam inschakelt, moet u ervoor zorgen dat de schakelaar Uitschuiven/Intrekken zich in de middelste uit-positie bevindt. Sluit vervolgens de kabel op de actuator aan op de aansluiting op het voorpaneel van de botskast, en de sensorkabel op de aansluiting op het voorpaneel. Schakel vervolgens de aan/uit-schakelaar op het achterpaneel in (zie Figuur 1D).
OPMERKING: De schakelaar Extend/Retract moet in de middelste uit-positie blijven wanneer deze niet in gebruik is. - Stel de botssnelheid in door aan de grote knop aan de linkerkant van de bedieningskast te draaien totdat een botssnelheid van 5,0 ± 0,2 m/s op het display verschijnt (zie figuur 1D).
- Stel de woonteller in op 100 ms door aan de wijzerplaten te draaien totdat de bewoner 0,01 aangeeft (zie figuur 1D).
OPMERKING: De verblijfplaats is de tijd van contact voordat automatische terugtrekking optreedt. - Plaats de botslichaamactuator op een ijspak om te voorkomen dat de plastic cilinder uitzet, waardoor de cilinder op zijn plaats wordt vergrendeld, waardoor de beweging van de cilinder en de levering van toekomstige botsingen worden voorkomen (zie figuur 1E).
- Bereid de muis voor op een operatie.
- Inspecteer de muis visueel vóór de operatie en elimineer de muis uit het onderzoek als een van de volgende aandoeningen wordt waargenomen: slechte vachtconditie, lethargie of slecht gewicht (< 20 g) voor een muis van 4 maanden oud.
- Verdoof de muis met 4% -5% isofluraan in 100% zuurstof met behulp van een inductiekamer die gedurende 1-2 minuten op een verwarmingspad wordt geplaatst.
- Scheer de vacht van de operatieplaats met behulp van een elektrische tondeuse.
- Reinig het hoofd met steriele alcoholvoorbereidingspads en breng ten minste 15 minuten voor het begin van de operatie een plaatselijke verdoving aan op de geschoren hoofdhuid.
- Breng de muis terug naar een schone kooi voor de operatie. Start de operatie na ten minste 15 minuten plaatselijke verdovingstoepassing (inductietijd).
OPMERKING: De tijd voor anesthesie kan variëren, afhankelijk van het anestheticum dat in de procedure wordt gebruikt.
- Controleer nog een keer of het stereotaxische frame, het botslichaam en het digitale stereotaxische display (zie figuur 1F) klaar zijn voor gebruik.
- Breng de muis terug naar de isofluraan inductiekamer met 4%-5% isofluraan in 100% zuurstof gedurende ongeveer 3 minuten.
- Bevestig de muis in het hoofdstadium.
3. Chirurgische ingreep
- Bevestig de muis in het stereotaxische frame met behulp van lichtgewicht acetaalhars taps toelopende puntoorbalken, een bijtbalk en een muisanesthesiemasker (zie figuur 1G, H). Het isofluraangas wordt geleverd met 2%-3% in kamerlucht bij 100-200 ml/min. Controleer de ademhaling van de muis zorgvuldig om de diepte van de anesthesie te garanderen en pas het gasniveau indien nodig aan.
- Breng steriel oogglijmiddel aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Steriliseer de hoofdhuid drie keer met povidon-jodiumdoekjes en steriele alcoholpads.
- Zorg ervoor dat de muis diep verdoofd is door het ontbreken van een teenknijpreactie te verifiëren.
- Maak een ongeveer 1 cm middellijn hoofdhuidincisie tussen de ogen en nek met behulp van een scalpel, waarbij de schedel wordt blootgesteld (zie figuur 1I).
- Laat de schedel 1-2 minuten drogen.
- Identificeer bregma (het snijpunt van de coronale en sagittale hechtingen) en lambda (het snijpunt van de sagittale en lambdoïde hechtingen) (zie figuur 1J).
OPMERKING: Een muizenhersenatlas kan ter referentie worden gebruikt. - Plaats het hoofdsteunapparaat onder de kop en blaas de bol op met water totdat deze tegen de onderkant van de kop van de muis drukt, maar de kop niet van de bijtbalk wegtilt.
OPMERKING: Deze stap is essentieel om mogelijke oorproblemen van de CHI te verminderen. Elk dier met schade aan het oor door de oorbalken, resulterend in rollen of bloeden, moet uit het onderzoek worden verwijderd en worden geëuthanaseerd. - Beweeg het botslichaam op zijn plaats boven het hoofd van het dier.
- Verleng het botslichaam door de schakelaar Extend/Retract (op de bedieningskast van het botslichaam) op Extend te plaatsen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u controleert of de punt volledig is uitgeschoven door de punt naar beneden te trekken. - Lijn het botslichaam uit totdat het gecentreerd is over de bregma (zie figuur 1K).
- Stel de digitale stereotaxische x- en y-coördinaten in de stereotaxische lezer opnieuw in op 0 (op het aanraakscherm)
- Lijn de sonde uit over de inslaglocatie door de sonde van de bregma naar de doelcoördinaten te verplaatsen: mediaal-lateraal = 0,0 mm, voorste-achterste = −1,6 mm.
- Klem de contactsensor vast aan het oor van het dier.
- Laat de punt van de sonde langzaam zakken met de verlengde sonde totdat het eerste contact met het oppervlak is gemaakt. Stop bij de pieptoon.
- Stel de digitale stereotaxische z-coördinaten in de stereotaxische lezer opnieuw in op 0.
- Inspecteer zorgvuldig of de punt gelijk is met de schedel (mediaal-laterale en voorste-achterste vlakken).
OPMERKING: Het plaatsen van de sondepunt is de meest cruciale stap van dit proces om schedelbreuken en oorbeschadiging te voorkomen. - Trek het botslichaam in door de tuimelschakelaar op de bedieningskast in de intrekpositie te plaatsen. De punt trekt zich terug en heeft geen contact meer met het hoofd van het dier tot het moment van impact.
- Stel de impactdiepte in door de dorsale-ventrale diepte aan te passen op −1,2 mm.
OPMERKING: De diepte van de impact is van invloed op de ernst van het letsel. De diepte moet worden getiterd voor verschillende leeftijden, gewichten en muizenstammen tot de gewenste ernst van het letsel. De diepte moet mogelijk in de loop van de tijd worden aangepast / opnieuw getitereerd om een consistente ernst van het letsel te behouden. De ernst kan neuropathologisch worden beoordeeld: microglia en astrocyten (IHC), en gedragsmatig: het radiale armwaterdoolhof en de actieve vermijdingstest. - Controleer de ademhaling van de muis zorgvuldig om de anesthesiediepte te garanderen en pas het gasniveau indien nodig aan.
OPMERKING: Vaak moet het percentage isofluraangas worden verlaagd of uitgeschakeld gedurende 10-20 s voorafgaand aan de impact. Let goed op of de ademhaling iets versnelt. Als de ademhaling te langzaam is op het moment van de impact, kan het dier sterven binnen de eerste 60 s na de impact van apneu. Dit kan worden voorkomen door de diepte van de anesthesie in de seconden voor de impact aan te passen. - Induceer de impact door op de rechter tuimelschakelaar te drukken om te raken. De punt van de sonde gaat met de weergegeven snelheid naar beneden en blijft dan naar beneden voor de ingestelde verblijftijd en trekt zich terug.
OPMERKING: Schijnmuizen krijgen dezelfde behandeling als de CHI-muizen, maar de impact wordt niet geleverd. - Start de timer onmiddellijk nadat de CHI-impact is geleverd om de rechtrichttijden vast te leggen (tijd om terug te keren van de zijpositie naar de buikligging) of start de timer wanneer de muis uit het stereotaxische frame voor de schijnmuizen wordt verwijderd. De gemiddelde richtreflextijd is 5-15 min.
OPMERKING: De rechtstandreflextijden kunnen variëren afhankelijk van de stam en leeftijd van de muis. - Evalueer de muizen op zichtbare schedelfracturen, bloedingen en apneu. Sluit de muizen met een depressieve schedelbreuk of zichtbare bloeding uit van het onderzoek.
OPMERKING: Er zijn graduele niveaus van schedelfracturen. Dieren met gedecomprimeerde schedelfracturen, waarbij het bot waarneembaar in het hersenweefsel wordt gedrukt, worden geëuthanaseerd (eerst CO2 en onthoofding als secundaire methode). Als de impactorpunt correct is ingesteld, zijn dit soort schedelfracturen uiterst zeldzaam. Als er een schedelbreuk optreedt, is de meest voorkomende presentatie een kleine druppel bloed op de schedel en een lichte tactiele voorruwing van de schedel, vaak langs de hechting die de achterste punt van het neusbeen verbindt. Deze muizen worden genoteerd als mogelijke schedelbreuk in de records, maar worden normaal gesproken niet uitgesloten van het onderzoek. - Verwijder het dier uit het stereotaxische frame.
- Sluit de hoofdhuid door de huid aan elkaar te nieten.
OPMERKING: Absorbeerbare of niet-absorbeerbare hechtingen kunnen worden gebruikt om de hoofdhuid te sluiten als alternatief voor nietjes. - Breng drievoudige antibiotische zalf met een steriele applicator met katoenpunt aan op de gesloten incisie.
- Breng de muis terug naar een schone kooi voor herstel. De helft van de herstelkooi bevindt zich op een verwarmingskussen (lage stand), waardoor het mogelijk is om weg te bewegen van de warmte wanneer het wakker is en de temperatuur van het dier te handhaven terwijl het bewusteloos is (zie figuur 1L).
OPMERKING: De muis wordt op zijn kant in de herstelkooi geplaatst. Om verstikking te voorkomen, plaatst u het dier in een herstelkooi zonder strooisel of op een tissue als er beddengoed in de kooi ligt. - Zet de schakelaar Uitbreiden/Intrekken terug op de positie Midden/Uit .
OPMERKING: De stroom blijft lopen als de schakelaar in de uitschuif- of intrekpositie wordt gelaten, waardoor de zuiger opzwelt. Het botslichaam zal dan niet functioneel zijn totdat de zuiger afkoelt. - Verwijder het botslichaam uit de houder en plaats het voorzichtig op het ijspak.
OPMERKING: Door het botslichaam op een ijspak te houden, wordt de mogelijke zwelling van het botslichaam verminderd. - Houd het dier in de gaten totdat de richtreflex optreedt en documenteer de tijd tot het rechtzetten (zie figuur 1M).
OPMERKING: De richtreflex wordt gedefinieerd als het moment waarop de muis terugkeert naar een buikligging. De kooi moet ongemoeid worden gelaten; De muis kan recht als de kooi wordt aangeraakt, verplaatst of blootgesteld aan bepaalde geluiden. - Breng de muizen terug naar hun thuiskooi wanneer ze wakker en alert zijn. Meestal zijn dieren binnen 1 uur na verwonding volledig bij bewustzijn en ambulerend. Voeg ook wat vochtig voedsel toe aan de onderkant van de kooi.
4. Postoperatieve zorg
- Controleer de dieren gedurende 5 dagen na de operatie.
- Noteer hun gewicht en eventuele fysieke / gedragsveranderingen zoals ademhalingsfrequentie (kwalitatieve ademhalingsfunctie), gang, lichaams- en haarvachtconditie, eten, drinken, ontlasting en urineren.
- Observeer de muis op elk teken van ongemak en de chirurgische wond voor zwelling, exsudaten of rode randen, ordehiscentie. Neem contact op met een dierenarts als het dier tekenen van pijn en ongemak vertoont (vocalisaties, niet bewegen, onderkoeling, niet drinken of eten).
- Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie onder narcose en op een verwarmingskussen.
OPMERKING: Als niet-absorbeerbare hechtingen worden gebruikt, moeten deze 7-10 dagen na de operatie onder anesthesie worden verwijderd.
5. Reiniging
- Reinig en steriliseer het chirurgische gebied en gereedschap.
- Reinig de sondepunt na elk gebruik en aan het einde van de dag met alcoholvoorbereidingspads.
OPMERKING: Het botslichaam is in de fabriek gekalibreerd en is naar verluidt stabiel in de loop van de tijd en het gebruik. Er is geen routinekalibratie nodig. Het botslichaam en het stereotaxische frame moeten echter routinematig worden geïnspecteerd. Ook moeten de eindpuntranden van het model, zoals de correctiereflextijd, mortaliteit en neuropathologie, worden bewaakt om mogelijke experimentele drift te evalueren.
6. Uitsluitingscriteria
- Sluit dieren uit voorafgaand aan de operatie met een slechte gezondheidstoestand, zoals een slecht gewicht < 20 g voor een 4 maanden oude muis, lethargie en een slechte vachtconditie.
- Sluit dieren uit met complicaties tijdens de operatie, zoals een depressieve schedelbreuk, een zichtbare bloeding gerelateerd aan een operatie of oorbloedingen.
- Sluit dieren uit van het onderzoek met de volgende symptomen na de operatie: niet eten en/of normaal bewegen, ongebruikelijke vocalisaties, gewichtsverlies of falen van de wond om normaal te genezen na de operatie.
OPMERKING: Dit model kan worden gebruikt als een repetitief model van milde TBI. Als de muizen de tweede operatie 24 uur na de eerste ondergaan, kunnen de nietjes of hechtingen worden verwijderd en kan dezelfde incisie worden gebruikt om de schedel bloot te leggen. Er moet een nieuwe incisie worden gemaakt als er langere tijd verstrijkt tussen de operaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit stereotaxische elektromagnetische impactorapparaat is veelzijdig. Het wordt gebruikt voor zowel een open schedel gecontroleerde corticale impact (CCI) of een gesloten hoofdletsel (CHI) operatie. Bovendien kan de ernst van het letsel worden gemoduleerd door de letselparameters te wijzigen, zoals impactsnelheid, verblijftijd, impactdiepte, impactortip en letseldoel. Hierin wordt een CHI-operatie beschreven met behulp van een 5,0 mm stalen tip impactor. Dit letsel wordt als mild beschouwd omdat er geen structurele hersenletsels zijn. Het sterftecijfer bij volwassen muizen is minder dan 0,9%11,14 en neemt licht toe tot ~2,5% bij oudere muizen (>8 maanden oud)11. Sterfte treedt op tijdens de eerste 2 minuten als gevolg van apneu, die grotendeels kan worden voorkomen door de diepte van de anesthesie zorgvuldig te controleren in de seconden voor de impact.
Het voordeel van dit CHI-model is dat de impact bilaterale diffuse pathologie produceert zonder het corticale durale oppervlak bloot te leggen (craniotomie). Een ander kenmerk dat dit een effectief TBI-model maakt, is dat minder dan 1% van de muizen wordt uitgesloten van het onderzoek vanwege schedelfracturen of oorproblemen na de chirurgische procedure. Belangrijk is dat het model neuropathologische en gedragsstoornissen produceert met een enkele impact, wat de experimentele complexiteit vermindert die gepaard gaat met repetitieve milde CHI-modellen15. Zo wordt bijvoorbeeld een reproduceerbaar temporeel patroon van microglia en morfologische veranderingen van astrocyten geïdentificeerd11 (figuur 2A,B). Bij het valideren van het model wordt aanbevolen om de beginbereiken van de voorste-achterste coördinaten te gebruiken als −1,5 mm ± 0,2 mm en de impactdiepte als 1,0 ± 0,2 mm. De coördinaten moeten mogelijk worden aangepast aan de leeftijd en stam van de muizen, evenals het merk en model van de gebruikte apparatuur. Zodra de instellingen zijn gevalideerd, moeten ze constant worden gehouden voor een experiment. Voor validatie wordt de neuropathologische karakterisering van microglia en astrocyten 3 dagen na het letsel aanbevolen. Immunohistochemische (IHC) kleuring werd voltooid volgens de methoden in Bachstetter et al.18. In het bijzonder werden 30 μm coronale vrij zwevende secties gekleurd voor gliale activering met konijn anti-GFAP (1:10.000) en voor astrocyten met behulp van een konijn anti-IBA1 (1:10.000). Een HRP geconjugeerde geit anti-konijn IgG (1:200) werd gebruikt om zowel GFAP als IBA-1 te detecteren. Kwantificeringssoftware werd gebruikt om de kleuring in elke beschouwde regio te kwantificeren. Bovendien werden 1 dag na het letsel axonale letselmarkers gevonden in de neocortex en werden veranderingen in het mitochondriale metabolisme gevonden 28 dagen na CHI16 (gegevens niet getoond).
De secundaire eindpunten voor het valideren van het model zouden gedragstests zijn. Reproduceerbare CHI-geïnduceerde tekorten in het radiale armwaterdoolhof (RAWM)12 en actieve vermijding13 gedragingen werden gevonden (figuur 3). De muizen werden getest in een 8-armige RAWM, een speciale leertest, zoals beschreven in Macheda et al.12. Kortom, de muizen werden getest in een totaal van 28 proeven over een 4-daags protocol en hadden 60 s om het platform in de doelarm te lokaliseren. Het totaal aantal proeven per dag was zeven; Dag 1 en dag 2 werden beschouwd als trainingsdagen en dag 3 en 4 als testdagen. Tijdens de trainingsdagen werden de muizen getraind om het platform te lokaliseren, afwisselend zichtbare en verborgen proeven; Tijdens de testdagen was het platform tijdens alle proeven verborgen. De experimenten werden opgenomen met behulp van een camera en een volgsysteem werd gebruikt voor gedragsanalyse (aantal fouten, totale afstand en latentie). De muizen werden 2 weken na het letsel getest. Hoewel er geen effect van seks was, maakten de CHI-muizen meer fouten om de taak met succes uit te voeren en het platform te bereiken (figuur 3A). Bovendien zijn geheugenstoornissen gedetecteerd in een 6-armige RAWM-test11,14,15,16 ook. Actieve vermijding, een associatieve leergebaseerde test, is gebruikt om de cognitieve tekorten te meten die verband houden met dit milde model van CHI. De muizen werden getest met behulp van een 5-daags protocol en blootgesteld aan 50 proeven / dag13. De muizen werden getraind om een milde voetschok (ongeconditioneerde stimulus, VS) te voorkomen door er een geconditioneerde stimulus (CS, licht) mee te associëren. Na verloop van tijd leerden de muizen de VS te vermijden toen de CS werd gepresenteerd. De CHI-muizen hadden een verminderde cognitieve functie bij actieve vermijding in vergelijking met schijnmuizen (figuur 3B). De schijn-vrouwelijke muizen leerden significant sneller in vergelijking met de mannetjes, maar het geslacht speelde geen rol bij CHI-muizen13. Gedrag werd geregistreerd met behulp van actieve/passieve vermijdingssoftware. Een reproduceerbaar tekort in de motorische functie na de eerste week na het letsel is niet gedetecteerd11.
In dit milde TBI-model werden geen grove structurele laesies aan de hersenen gevonden en een enkele impact veroorzaakte bilaterale gliale activering en veranderingen in de morfologie van microglia. Ook cognitieve tekorten zijn geassocieerd met dit TBI-model.
Figuur 1: Stap 1: Chirurgische gebiedsopstelling. (A) Een voorbeeld van het chirurgische gebied en de hulpmiddelen die nodig zijn om CHI-chirurgie uit te voeren (ijspak voor het botslichaam, stereotaxisch frame uitgerust met het botslichaam, de botslichaambesturingskast en chirurgische hulpmiddelen) wordt getoond. (B) Een close-up van de 5 mm stalen sondepunt, bijtbalk en hoofdsteunapparatuur, die de positionering illustreert die nodig is voor de impact op de middellijn. (C) Het hoofdsteunapparaat is vervaardigd van een latexpipetbol van 1 ml die met parafilm aan de buis is bevestigd. Een spuit van 10 ml wordt gevuld met water om de bol op te blazen, met een stopkraan om de bol eenmaal op zijn plaats te houden. (D) Botslichaambesturingskast: (1) een grote knop om de botssnelheid aan te passen, (2) een verblijfteller, (3) een uitschuif-/intrekschakelaar, (4) een tuimelschakelaar die, wanneer deze wordt ingedrukt, de impact zal leveren. (E) Wanneer het botslichaam niet in gebruik is, wordt het op een ijspak gehouden om oververhitting en mogelijke storingen te voorkomen. (F) Een digitaal stereotaxisch display wordt gebruikt voor het vaststellen van de x-coördinaten (anterieur-posterior), y (mediaal-lateraal) en z (dorsaal-ventraal). Stap 2: Chirurgische ingreep. (G,H) De verdoofde en geschoren muis wordt vastgezet in het stereotaxische frame, (I) er wordt een middellijnincisie gemaakt om de (J) bregma bloot te leggen, (K) die tijdens de operatie wordt gebruikt om de impactor uit te lijnen. Stap 3: Herstel. (L) De muis wordt uit het stereotaxische frame verwijderd. Nadat de hoofdhuid is gesloten door de huid te nieten of aan elkaar te hechten, wordt deze in een schone herstelkooi op zijn kant geplaatst. (M) De muis wordt in de gaten gehouden totdat de muis omrolt en de richtreflex optreedt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De temporele patronen van astrocyten (GFAP) en microglia (IBA1) morfologische veranderingen na een CHI. (A) GFAP-kleuring bij lage vergroting toont de regionale toename van kleuring in de cortex van de CHI-groep. Het morfologische uiterlijk van de astrocyten wordt getoond in de inzetstukken met een hogere vergroting, die werden genomen uit de middelste hersensecties en uit dezelfde gebieden van de cortex. (B) IBA1-positieve kleuring in de cortex op 1 dag, 7 dagen en 2 maanden na het letsel toont veranderingen in de microgliamorfologie in de neocortex na de CHI (n = 7-14, 50/50 man / vrouw). De muizen (CD-1/129 achtergrond) waren 8 maanden oud op het moment van de operatie. Deze figuur is aangepast van 11 en met toestemming gereproduceerd. Schaalbalk = 1 mm, 50 μm en 100 μm zoals aangegeven in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: CHI-geïnduceerde geheugentekorten in RAWM en actieve vermijding. (A) 2 weken na het letsel waren zowel de CHI- als de schijn-geopereerde muizen in staat om de RAWM-taak te leren, maar de CHI-muizen maakten meer fouten in vergelijking met de schijnmuizen (*** p < 0,0005); sham (n = 20/20 man/vrouw); CHI (n = 20/20 man/vrouw). De muizen (C57BL/6J) waren 3-4 maanden oud op het moment van de operatie. (B) 4 weken na het letsel waren de CHI- en sham-geopereerde muizen in staat om de actieve vermijdingstaak te leren, maar de CHI-muizen vermeden minder voetschokken in vergelijking met de schijnmuizen (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); sham (n = 10/10 man/vrouw); CHI (n = 9/10 man/vrouw). De muizen (C57BL/6J) waren 3-5 maanden oud op het moment van de operatie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (A) Dit cijfer is aangepast van 12 en met toestemming gereproduceerd. (B) Dit cijfer is aangepast van 13 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende stappen betrokken bij het opnieuw creëren van een consistent letselmodel met behulp van het beschreven model. Ten eerste is het van cruciaal belang om het dier correct in het stereotaxische frame te bevestigen. Het hoofd van het dier mag niet zijdelings kunnen bewegen en de schedel moet volledig plat zijn met bregma en lambda die dezelfde coördinaten lezen. Het correct plaatsen van de oorbalken is het moeilijkste aspect van deze operatie, en dit kan alleen met oefening worden geleerd. Als de schedel niet waterpas is, moet het hoofd worden aangepast voordat CHI wordt geïnduceerd. Het niet aanpassen van de hoofdpositie zal een schedelbreuk veroorzaken. Om te beoordelen of de schedel plat is, moet men de opening tussen de schedel en de inslagpunt vanuit alle hoeken rond de punt bekijken. Muizen met depressieve schedelfracturen moeten worden uitgesloten van experimenten, omdat ze een veel sterkere ontstekingsreactie en een ernstiger letsel hebben in vergelijking met muizen die geen schedelfracturen hebben opgelopen19. Bovendien vertonen muizen met schedelfracturen ernstigere TBI-uitkomsten, zoals posttraumatische ademhalingsdepressie, secundair reboundletsel en uiteindelijk de dood20.
In deze studie werd het hoofd van het dier vastgezet met oorbalken. In het bijzonder worden alleen muisspecifieke acetaalharsoorstaven met een taps toelopende punt aanbevolen om te worden gebruikt, geen grote rattenoorstaven. Het is mogelijk om niet-punctie rubberen oorbalken te gebruiken, maar deze oorbalken zullen de schedel comprimeren, waardoor de biomechanica van de CHI verandert en minder reproduceerbaar is. Bovendien is er een beperking aan het gebruik van oorbalken, omdat het geen rotatiekrachten toestaat. Niettemin weegt de grotere reproduceerbaarheid van de oorbalken op tegen het beperkte aantal rotatiekrachten dat kan worden gegenereerd als het hoofd niet is gefixeerd.
Het bevestigen van het hoofd met oorbalken kan echter ook letsel aan het oor veroorzaken bij impact als de impactkrachten allemaal op de oren worden geplaatst. Er werd een hoofdondersteuningsapparaat ontwikkeld dat onder het hoofd werd geplaatst om de krachten van de oren weg te houden. Na het testen van meerdere kussenachtige objecten, was degene die het beste werkte de 1 ml latex pipetbol gevuld met water. De pipetlamp onder het hoofd van het dier kan worden uitgebreid nadat het dier zich in het stereotaxische frame bevindt, waardoor het een strakke pasvorm heeft en volledige ondersteuning onder het hoofd biedt. Indien correct geplaatst, mag er geen bloeding uit de oren of gedragsindicaties van oorbeschadiging (rollen / kantelen van het hoofd) zijn na het letsel.
Sommige versies van het CHI-model gebruiken een rubberen tipsonde 21,22 of metalen helm 23,24 om het optreden van schedelbreuken te verminderen. Zolang de 5 mm impactorpunt gelijk is met de schedel, is het niet nodig om een van hen te gebruiken. Het kan verleidelijk zijn voor nieuwe gebruikers die geen uitgebreide ervaring hebben met stereotaxische chirurgie om het letsel op te wekken met de punt die niet gelijk is met de schedel in het mediaal-laterale vlak. Als de schedel niet waterpas in het mediaal-laterale vlak staat, komt dit omdat de oorbalken niet correct zijn geplaatst. De enige oplossing voor dit probleem is om het dier uit het botslichaam te verwijderen en de muis toe te wijzen aan een schijnverwonding. Als de punt niet vlak is op het voorste-achterste vlak, moet de hoogte van de bijtbalk worden aangepast en moet de punt opnieuw worden uitgelijnd met de bregma. Ook vermindert het gebruik van een 5 mm impactor met een platte punt de kans op het veroorzaken van schedelfracturen19 in vergelijking met impactorpunten met kleinere diameters. Andere belangrijke factoren om te overwegen zijn de leeftijd en het gewicht van het onderwerp, evenals de schedeldikte25 en de stammen van de muizen26.
Bij mensen wordt een milde TBI niet geassocieerd met de dood tijdens de eerste minuten na het letsel. Bij dieren kan zelfs een lichte verwonding de dood veroorzaken. In dit model wordt mortaliteit echter bijna altijd geassocieerd met chirurgische complicaties, niet alleen het letsel. De meest voorkomende reden waarom een muis zou sterven na de impact is de diepte van de anesthesie. Dit kan gebeuren als de operatie langer duurde dan verwacht of als het isofluraangas een hogere concentratie had dan nodig was voor dat dier. Als de ademhaling van het dier traag of moeizaam is, kan dit een teken zijn dat de anesthesiediepte moet worden verminderd voordat de impact wordt geleverd. Als de adem van het dier traag of moeizaam is op het moment van impact, zal het dier waarschijnlijk apneu hebben en kan het sterven.
Er zijn veel modellen van milde TBI. Elk heeft sterke en zwakke punten, en dit model is niet anders. Zoals gemeld, hier wordt een single hit-model van TBI beschreven, maar het model is gebruikt om een repetitieve TBI15 te veroorzaken. De stappen die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden herhaald om een repetitieve TBI-blessure op te wekken. Bij het evalueren van de verschillende TBI-modellen is het belangrijk om te overwegen of het model de gewenste pathologie heeft die men probeert te modelleren. Men moet ook overwegen hoe reproduceerbaar het model is. Het wordt sterk aanbevolen dat het uitgangspunt voor het gebruik van dit of een ander TBI-model is om onafhankelijk te valideren en te karakteriseren dat het model werkt zoals eerder gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R01NS120882, RF1NS119165 en R01NS103785 en het Department of Defense awardnummer AZ190017. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health of het ministerie van Defensie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
