Summary
Protokollen beskriver mild traumatisk hjerneskade i en musemodell. Spesielt er en trinnvis protokoll for å indusere en mild midtlinje lukket hodeskade og karakteriseringen av dyremodellen fullt forklart.
Abstract
Sterkt reproduserbare dyremodeller av traumatisk hjerneskade (TBI), med veldefinerte patologier, er nødvendige for å teste terapeutiske inngrep og forstå mekanismene for hvordan en TBI endrer hjernens funksjon. Tilgjengeligheten av flere dyremodeller av TBI er nødvendig for å modellere de forskjellige aspektene og alvorlighetsgradene av TBI sett hos mennesker. Dette manuskriptet beskriver bruken av en midtlinje lukket hodeskade (CHI) for å utvikle en musemodell av mild TBI. Modellen regnes som mild fordi den ikke produserer strukturelle hjernelesjoner basert på neuroimaging eller grovt nevrontap. Imidlertid skaper en enkelt innvirkning nok patologi til at kognitiv svekkelse er målbar minst 1 måned etter skade. En trinnvis protokoll for å indusere en CHI hos mus ved hjelp av en stereotaktisk styrt elektromagnetisk påvirkning er definert i papiret. Fordelene med den milde midtlinjen CHI-modellen inkluderer reproduserbarheten av de skadeinduserte endringene med lav dødelighet. Modellen har blitt tidsmessig karakterisert opptil 1 år etter skaden for neuroimaging, nevrokjemiske, nevropatologiske og atferdsendringer. Modellen er komplementær til åpne skallemodeller av kontrollert kortikal påvirkning ved bruk av samme slagorenhet. Dermed kan laboratorier modellere både mild diffus TBI og fokal moderat til alvorlig TBI med samme innvirkning.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er forårsaket av en ekstern kraft på hjernen, ofte forbundet med fall, sportsskader, fysisk vold eller trafikkulykker. I 2014 fastslo Centers for Disease Control and Prevention at 2,53 millioner amerikanere besøkte beredskapsavdelingen for å søke medisinsk hjelp for TBI-relaterte ulykker1. Siden mild TBI (mTBI) representerer flertallet av TBI-tilfeller, har det i løpet av de siste tiårene blitt tatt i bruk flere modeller av mTBI, som inkluderer vektfall, stempeldrevet lukket hodeskade og kontrollert kortikal påvirkning, rotasjonsskade, mild væskeperkusjonsskade og eksplosjonsskademodeller 2,3. Heterogeniteten til mTBI-modellene er nyttig for å adressere de forskjellige funksjonene knyttet til mTBI sett hos mennesker og for å evaluere de cellulære og molekylære mekanismene forbundet med hjerneskade.
Av de mest brukte modellene for lukket hodeskade er en av de første og mest brukte modellene vekttapsmetoden, der en gjenstand slippes fra en bestemt høyde på dyrets hode (bedøvet eller våken)2,4. I vekttapsmetoden avhenger skadens alvorlighetsgrad av flere parametere, inkludert kraniotomi utført eller ikke, hodet fast eller fritt, og avstanden og vekten til det fallende objektet 2,4. En ulempe med denne modellen er den høye variasjonen i alvorlighetsgraden av skaden og den høye dødeligheten forbundet med respirasjonsdepresjon 5,6. Et vanlig alternativ er å levere støtet ved hjelp av en pneumatisk eller elektromagnetisk enhet, som kan gjøres direkte på den eksponerte dura (kontrollert kortikal påvirkning: CCI) eller lukket skalle (lukket hodeskade: CHI). En av styrkene til den stempeldrevne skaden er dens høye reproduserbarhet og lave dødelighet. Imidlertid krever CCI kraniotomi7,8, og en kraniotomi i seg selv induserer betennelse9. I stedet, i CHI-modellen, er det ikke behov for kraniotomi. Som allerede nevnt har hver modell begrensninger. En av begrensningene i CHI-modellen beskrevet i dette papiret er at operasjonen utføres ved hjelp av en stereotaksisk ramme, og dyrets hode er immobilisert. Mens full hodeimmobilisering sikrer reproduserbarhet, tar den ikke hensyn til bevegelse etter støtet som kan bidra til skaden forbundet med en mTBI.
Denne protokollen beskriver en grunnleggende metode for å utføre en CHI-påvirkning med en kommersielt tilgjengelig elektromagnetisk påvirkningsanordning10 i en mus. Denne protokollen beskriver de nøyaktige parametrene som er involvert for å oppnå en svært reproduserbar skade. Spesielt har etterforskeren presis kontroll over parametrene (skadedybde, oppholdstid og slaghastighet) for å nøyaktig definere skadens alvorlighetsgrad. Som beskrevet produserer denne CHI-modellen en skade som resulterer i bilateral patologi, både diffus og mikroskopisk (dvs. kronisk aktivering av glia, aksonal og vaskulær skade) og atferdsfenotyper 11,12,13,14,15. I tillegg anses den beskrevne modellen som mild, da den ikke induserer strukturelle hjerneskader basert på MR eller brutto lesjoner på patologi selv 1 år etter skaden16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De utførte forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky, og både ARRIVE og Guide for Care and Use of Laboratory Animals retningslinjer ble fulgt under studien.
1. Kirurgisk oppsett
MERK: Mus er plassert i grupper på 4-5 / bur, fuktigheten i boligrommet holdes på 43% -47%, og temperaturen holdes på 22-23 ° C. Mus får ad libitum tilgang til mat og vann og utsettes for en 12 t / 12 h lys / mørk syklus (7 am / 7 pm).
- Bruk et utpekt kirurgisk område, for eksempel en hette eller et dedikert kirurgisk prosedyrerom, for å utføre dyreoperasjonen.
- Sørg for at operasjonsområdet inkluderer en varmepute, en stereotaktisk ramme utstyrt med en elektromagnetisk kollisjonor og en anestesimaske designet for å administrere isofluran gass (se figur 1A).
- Sørg for at kirurgen eller personell som er involvert i operasjonen bærer en ren laboratoriefrakk, ansiktsmaske, hansker og en kirurgisk hette.
- Bruk sterile kirurgiske verktøy, sterile bomullstippede applikatorer og gasbind. Bruk en varm perle sterilisator for å sterilisere instrumentene mellom mus i løpet av operasjonsdagen.
- Bruk et anestesiinduksjonskammer for å forberede musen til kirurgi i et pre-op-område.
- Bruk varmeputer for å opprettholde dyrets temperatur, rengjør post-op musholdebur og tidtakere for å registrere musens høyre refleks etter operasjonen.
2. Pre-kirurgi prosedyre
- Klargjør hodestøtteapparatet (se figur 1B).
- Fjern den valsede enderyggen fra en 1 ml latekspipettepære (oppblåsbar ende) (se figur 1C).
- Fest pæren til slangen ved hjelp av parafilm (se figur 1C).
- Koble slangen til en 10 ml sprøyte ved hjelp av en stoppekran. Fyll sprøyten med vann (se figur 1C).
MERK: 1 ml latekspipettepæren vil bli plassert under musens hode for å forskyve slagkraften bort fra ørene. Prøv å fjerne så mye luft som mulig fra pæren før bruk, slik at pæren er fylt med mest vann og ikke luft.
- Oppsett av påvirker.
- Velg sondespissen på 5 mm, skru den fast på stempelet nederst i midten av aktuatoren (inne i den større sylinderen), og stram sonden forsiktig uten å bruke for stor kraft. Stram spissen mellom støtene igjen (se figur 1B).
- Før du slår på kollisjonsbryteren, må du forsikre deg om at forleng/tilbaketrekking-bryteren er plassert i senter av-stilling. Deretter kobler du kabelen på aktuatoren til kontakten på frontpanelet på slagorkontrollboksen og sensorkabelen til kontakten på frontpanelet. Slå deretter på strømbryteren på bakpanelet (se figur 1D).
MERK: Vippebryteren Forleng/trekk tilbake må forbli i midten Av-posisjon når den ikke er i bruk. - Sett opp kollisjonshastigheten ved å dreie den store knappen på venstre side av kontrollboksen til en kollisjonshastighet på 5,0 ± 0,2 m/s vises på displayet (se figur 1D).
- Sett brønntelleren til 100 ms ved å vri skivene til boligen leser 0,01 (se figur 1D).
MERK: Oppholdet er kontakttidspunktet før automatisk tilbaketrekking skjer. - Plasser slagaktuatoren på en ispakke for å forhindre at plastsylinderen ekspanderer, noe som låser sylinderen på plass, forhindrer sylinderens bevegelse og levering av fremtidige støt (se figur 1E).
- Forbered musen for kirurgi.
- Inspiser musen visuelt før operasjonen og fjern musen fra studien hvis en av følgende forhold blir observert: dårlig pelstilstand, sløvhet eller dårlig vekt (<20 g) for en 4 måneder gammel mus.
- Bedøv musen med 4% -5% isofluran i 100% oksygen ved hjelp av et induksjonskammer plassert på en varmepute i 1-2 minutter.
- Barber pelsen fra operasjonsstedet ved hjelp av en elektrisk hårklipper.
- Rengjør hodet med sterile alkoholforberedende pads og påfør en aktuell bedøvelse til den barberte hodebunnen minst 15 minutter før operasjonen starter.
- Sett musen tilbake i et rent holdebur før operasjonen. Start operasjonen etter minst 15 min med lokal bedøvelse (induksjonstid).
MERK: Tiden for anestesi kan variere avhengig av bedøvelsen som brukes i prosedyren.
- Sjekk en gang til at den stereotaktiske rammen, innvirkningen og den digitale stereotaksiske skjermen (se figur 1F) er klar til bruk.
- Sett musen tilbake i isofluran induksjonskammer med 4%-5% isofluran i 100% oksygen i ca. 3 minutter.
- Fest musen i hodestadiet.
3. Kirurgisk prosedyre
- Fest musen inn i den stereotaktiske rammen ved hjelp av lette acetalharpiks koniske punkt ørestenger, en bite bar, og en mus anestesi maske (se figur 1G,H). Isofluran gass leveres til 2%-3% i romluft ved 100-200 ml/min. Overvåk musens respirasjon nøye for å sikre dybden av anestesi og juster gassnivået etter behov.
- Påfør sterilt øye smøremiddel til øynene for å forhindre hornhinnetørking.
- Steriliser hodebunnen med povidon-jod swabs og sterile alkoholputer tre ganger.
- Forsikre deg om at musen er dypt bedøvet ved å verifisere mangelen på en tåklemmerespons.
- Gjør et ca. 1 cm midtlinjesnitt i hodebunnen mellom øynene og nakken ved hjelp av en skalpell, og blottlegg hodeskallen (se figur 1I).
- La skallen tørke i 1-2 min.
- Identifiser bregma (skjæringspunktet mellom koronale og sagittale suturer) og lambda (skjæringspunktet mellom sagittal og lambdoid sutur) (se figur 1J).
MERK: Et musehjerneatlas kan brukes som referanse. - Plasser hodestøtteapparatet under hodet og blås opp pæren med vann til den presser mot bunnen av musens hode, men ikke løfter hodet bort fra bittstangen.
MERK: Dette trinnet er viktig for å redusere mulige øreproblemer fra CHI. Ethvert dyr med skade på øret fra ørestengene, noe som resulterer i rulling eller blødning, bør elimineres fra studien og avlives. - Flytt støten på plass over dyrets hode.
- Utvid innvirkningen ved å plassere vippebryteren Forleng/trekk tilbake (på kollisjonskontrollboksen) på Extend.
MERK: Husk å sjekke at spissen er helt utstrakt ved å trekke ned på spissen. - Still kollisjonen på linje til den er sentrert over bregmaen (se figur 1K).
- Tilbakestill de digitale stereotaktiske x- og y-koordinatene i den stereotaksiske leseren til 0 (på berøringsskjermkontrollen)
- Juster sonden over nedslagsstedet ved å flytte sonden fra bregma over til målkoordinatene: medial-lateral = 0,0 mm, anterior-posterior = −1,6 mm.
- Fest kontaktsensoren til dyrets øre.
- Senk sondespissen sakte ned med den forlengede sonden til første kontakt med overflaten er opprettet. Stopp ved pipetonen.
- Tilbakestill de digitale stereotaktiske z-koordinatene i den stereotaksiske leseren til 0.
- Inspiser nøye om spissen er i flukt med skallen (medial-laterale og fremre-bakre plan).
MERK: Plassering av sondespissen er det mest avgjørende trinnet i denne prosessen for å forhindre kraniebrudd og øreskader. - Trekk inn kollisjonen ved å plassere vippebryteren på kontrollboksen i inntrekkingsposisjon. Spissen trekker seg tilbake og har ikke mer kontakt med dyrets hode til tidspunktet for påvirkning.
- Still inn slagdybden ved å justere den dorsale-ventrale dybden til -1,2 mm.
MERK: Dybden av virkningen påvirker alvorlighetsgraden av skaden. Dybden bør titeres for ulike aldre, vekter og stammer av mus til ønsket skadealvorlighetsgrad. Dybden må kanskje justeres/endres over tid for å opprettholde en konsekvent skadealvorlighetsgrad. Alvorlighetsgraden kan vurderes nevropatologisk: mikroglia og astrocytter (IHC), og atferdsmessig: den radiale armvannlabyrinten og den aktive unngåelsestesten. - Overvåk musens respirasjon nøye for å sikre anestesidybden og juster gassnivået etter behov.
MERK: Ofte bør prosentandelen av isofluran gass senkes eller stenges av i 10-20 s før støt. Se nøye etter at åndedrettsvernet akselererer litt. Hvis respirasjonen er for langsom på støttidspunktet, kan dyret dø innen de første 60 årene etter påvirkning fra apné. Dette kan forebygges ved å justere anestesidybden i sekundene før sammenstøtet. - Indusere støtet ved å trykke på høyre vippebryter for å støte. Sondespissen går ned med den viste hastigheten, og holder seg deretter nede i den angitte oppholdstiden og trekker seg tilbake.
MERK: Sham mus får identisk håndtering til CHI-musene, men virkningen blir ikke levert. - Start timeren umiddelbart etter at CHI-påvirkningen er levert for å registrere rettingstidene (tid for å gå tilbake fra sideposisjon til utsatt stilling) eller start timeren når musen fjernes fra den stereotaksiske rammen for skammusene. Den gjennomsnittlige høyrereflekstiden er 5-15 min.
MERK: Høyrereflekstidene kan variere basert på musebelastning og alder. - Evaluer musene for synlige kraniefrakturer, blødninger og apné. Ekskluder musene med et deprimert kraniebrudd eller synlig blødning fra studien.
MERK: Det er graderte nivåer av kraniebrudd. Dyr med dekomprimerte kraniebrudd, hvor beinet observerbart presser inn i hjernevevet, avlives (CO2 først, og halshugging brukes som sekundær metode). Hvis slagspissen er riktig innstilt, er disse typer kraniebrudd svært sjeldne. Hvis et kraniebrudd oppstår, er den vanligste presentasjonen en liten dråpe blod på skallen og en liten taktil ruing av skallen, ofte langs suturen som forbinder den bakre spissen av nesebenet. Disse musene er notert som mulig kraniebrudd i journalen, men er normalt ikke ekskludert fra studien. - Fjern dyret fra den stereotaksiske rammen.
- Lukk hodebunnen ved å stifte huden sammen.
MERK: Absorberbare eller ikke-absorberbare suturer kan brukes til å lukke hodebunnen som et alternativ til stifter. - Påfør trippel antibiotikasalve med en steril bomullstippet applikator til det lukkede snittet.
- Sett musen tilbake i et rent holdebur for gjenoppretting. Halvparten av merden er på en varmepute (lav innstilling), noe som gir muligheten til å bevege seg bort fra varmen når den er våken og opprettholde dyrets temperatur mens det er bevisstløs (se figur 1L).
MERK: Musen er plassert på siden i oppvåkningsburet. For å forhindre kvelning, plasser dyret i et utvinningsbur uten sengetøy eller på et vev hvis sengetøy er i buret. - Sett vekslebryteren Forleng /trekk tilbake til sentrum/av-posisjon .
MERK: Strømmen vil fortsette å kjøre hvis bryteren er igjen i enten forlenge- eller tilbaketrekkingsposisjon, noe som får stempelet til å hovne opp. Kollisjonen vil da ikke være funksjonell før stempelet er avkjølt. - Fjern støtet fra holderen og legg det forsiktig på ispakken.
MERK: Å holde støtet på en ispakke bidrar til å redusere potensiell hevelse av støtet. - Overvåk dyret til høyrerefleksen inntreffer og dokumenter tiden frem til retting (se figur 1M).
MERK: Høyrerefleksen er definert som øyeblikket musen vender tilbake til mageleie. Buret må stå uforstyrret; Musen kan rett hvis buret berøres, flyttes eller utsettes for noen lyder. - Sett musene tilbake i buret når de er våkne og våkne. Vanligvis, innen 1 time etter skade, er dyrene fullt bevisste og ambulerende. Tilsett også litt fuktig mat i bunnen av buret.
4. Behandling etter operasjonen
- Overvåk dyrene i 5 dager etter operasjonen.
- Registrer vekten og eventuelle fysiske / atferdsendringer som pustefrekvens (kvalitativ respiratorisk funksjon), gange, kropps- og hårfrakktilstand, spising, drikking, avføring og vannlating.
- Vær oppmerksom på musen for tegn på ubehag og det kirurgiske såret for hevelse, ekssudater eller røde kanter, ordehiscence. Kontakt en veterinær hvis dyret viser tegn på smerte og ubehag (vokaliseringer, ikke beveger seg, hypotermi, drikker ikke eller spiser).
- Fjern stiftene 7-10 dager etter operasjonen under anestesi og på en varmepute.
MERK: Hvis ikke-absorberbare suturer brukes, må de fjernes 7-10 dager etter operasjonen under anestesi.
5. Rengjøring
- Rengjør og steriliser operasjonsområdet og verktøyene.
- Rengjør sondespissen etter hver bruk og på slutten av dagen med spritputer.
MERK: Kollisjonen er kalibrert på fabrikken og rapporteres å være stabil over tid og bruk. Ingen rutinemessig kalibrering er nødvendig. Påvirkningsrammen og den stereotaktiske rammen bør imidlertid inspiseres rutinemessig. Også modellendepunktperimeterne som rettingsreflekstid, dødelighet og nevropatologi bør overvåkes for å evaluere mulig eksperimentell drift.
6. Kriterier for utelukkelse
- Ekskluder dyr før operasjon med dårlig helsetilstand, som dårlig vekt <20 g for en 4 måneder gammel mus, sløvhet og dårlig pelstilstand.
- Ekskluder dyr med komplikasjoner under operasjonen som en deprimert kraniebrudd, en synlig blødning relatert til kirurgi eller øreblødning.
- Ekskluder dyr fra studien med følgende symptomer etter operasjonen: manglende evne til å spise og/eller bevege seg normalt, uvanlige vokaliseringer, vekttap eller svikt i såret til å gro normalt etter operasjonen.
MERK: Denne modellen kan brukes som en repeterende modell av mild TBI. Hvis musene får den andre operasjonen 24 timer bortsett fra den første, kan stiftene eller suturen fjernes, og det samme snittet kan brukes til å avsløre skallen. Et nytt snitt må gjøres hvis det går lengre tid mellom operasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne stereotaksiske elektromagnetiske slagorenheten er allsidig. Den brukes til både en åpen hodeskalle kontrollert kortikal påvirkning (CCI) eller en lukket hodeskade (CHI) kirurgi. Videre kan skadens alvorlighetsgrad moduleres ved å endre skadeparametrene som slaghastighet, oppholdstid, slagdybde, slagspiss og skademål. Her beskrives en CHI-operasjon ved hjelp av en 5,0 mm stålspisskollisjon. Denne skaden regnes som mild fordi det ikke er noen strukturelle hjerneskader. Dødeligheten hos voksne mus er mindre enn 0,9%11,14 og øker litt for å nå ~2,5% hos eldre mus (>8 måneder gammel)11. Dødelighet oppstår i løpet av de første 2 minuttene på grunn av apné, som i stor grad kan forebygges ved nøye overvåking av anestesidybden i sekundene før sammenstøtet.
Fordelen med denne CHI-modellen er at virkningen gir bilateral diffus patologi uten å måtte eksponere den kortikale durale overflaten (kraniotomi). En annen funksjon som gjør dette til en effektiv TBI-modell er at mindre enn 1% av musene er ekskludert fra studien på grunn av kraniebrudd eller øreproblemer etter den kirurgiske prosedyren. Det er viktig at modellen produserer nevropatologiske og atferdsmessige funksjonsnedsettelser med en enkelt innvirkning, noe som reduserer den eksperimentelle kompleksiteten forbundet med repeterende milde CHI-modeller15. For eksempel identifiseres et reproduserbart temporalt mønster av mikroglia og astrocyttenes morfologiske forandringer11 (figur 2A,B). Ved validering av modellen anbefales det å bruke startområdene til de fremre-bakre koordinatene som -1,5 mm ± 0,2 mm og slagdybden som 1,0 ± 0,2 mm. Koordinatene må kanskje justeres for musenes alder og belastning, samt merke og modell av utstyret som brukes. Når innstillingene er validert, bør de holdes konstant for et eksperiment. For validering anbefales nevropatologisk karakterisering av mikroglia og astrocytter 3 dager etter skade. Immunhistokjemisk (IHC) farging ble fullført etter metodene i Bachstetter et al.18. Nærmere bestemt ble 30 μm koronale frittflytende seksjoner farget for gliaaktivering med kaninanti-GFAP (1:10 000) og for astrocytter ved bruk av kaninanti-IBA1 (1:10 000). En HRP-konjugert geiteantikanin IgG (1:200) ble brukt til å påvise både GFAP og IBA-1. Kvantifiseringsprogramvare ble brukt til å kvantifisere fargingen i hver region som ble vurdert. I tillegg ble det ved 1 dag etter skade funnet aksonale skademarkører i neocortex, og endringer i mitokondriell metabolisme ble funnet innen 28 dager etter CHI16 (data ikke vist).
De sekundære endepunktene for validering av modellen vil være atferdsanalyser. Det ble funnet reproduserbare CHI-induserte underskudd i radialarmvannlabyrinten (RAWM)12 og aktiv unngåelse13-atferd (figur 3). Musene ble testet i en 8-armet RAWM, en spesiell læringstest, som beskrevet i Macheda et al.12. Kort fortalt ble musene testet i totalt 28 forsøk over en 4-dagers protokoll og hadde 60 s for å finne plattformen plassert i målarmen. Totalt antall forsøk per dag var syv; Dag 1 og dag 2 ble regnet som treningsdager og dag 3 og 4 som testdager. I løpet av treningsdagene ble musene trent til å lokalisere plattformen, vekslende mellom synlige og skjulte forsøk; Under testdagene var plattformen skjult under alle forsøkene. Eksperimentene ble registrert ved hjelp av et kamera, og et sporingssystem ble brukt til atferdsanalyse (antall feil, total avstand og ventetid). Musene ble testet 2 uker etter skaden. Selv om det ikke var noen effekt av sex, gjorde CHI-musene flere feil for å kunne utføre oppgaven og nå plattformen (figur 3A). Videre har hukommelsessvikt blitt oppdaget i en 6-armet RAWM-test11,14,15,16 også. Aktiv unngåelse, en assosiativ læringsbasert test, har blitt brukt til å måle de kognitive underskuddene forbundet med denne milde modellen av CHI. Musene ble testet ved hjelp av en 5-dagers protokoll og utsatt for 50 forsøk / dag13. Musene ble trent til å unngå et mildt fotstøt (ubetinget stimulus, USA) ved å knytte en betinget stimulus (CS, lys) med den. Over tid lærte musene å unngå USA da CS ble presentert. CHI-musene hadde nedsatt kognitiv funksjon i aktiv unngåelse sammenlignet med skammus (figur 3B). De falske kvinnelige musene lærte betydelig raskere sammenlignet med hannene, men kjønnet spilte ingen rolle i CHI-mus13. Atferd ble registrert ved hjelp av aktiv/passiv programvare for unngåelse. Reproduserbart utfall i motorisk funksjon utover den første uken etter skaden er ikke påvist11.
I denne milde TBI-modellen ble det ikke funnet noen grove strukturelle lesjoner i hjernen, og en enkelt påvirkning induserte bilateral gliaaktivering og endringer i mikrogliamorfologi. Kognitive underskudd er også knyttet til denne TBI-modellen.
Figur 1: Trinn 1: Oppsett av kirurgisk område. (A) Et eksempel på det kirurgiske området og verktøyene som trengs for å utføre CHI-kirurgi (ispakke for kollisjonen, stereotaksisk ramme utstyrt med kollisjonen, kollisjonskontrollboksen og kirurgiske verktøy) er vist. (B) Et nærbilde av 5 mm stålsondespissen, bittbøylen og hodestøtteapparatet, som illustrerer plasseringen som er nødvendig for midtlinjekollisjonen. (C) Hodestøtteapparatet er laget av en 1 ml latexpipettepære festet til slangen med parafilm. En 10 ml sprøyte er fylt med vann for å blåse opp pæren, med en stoppekran for å holde pæren oppblåst når den er på plass. (D) Slagorkontrollboks: (1) en stor knapp for å justere slaghastigheten, (2) en brønnteller, (3) en vippebryter for forlenging / tilbaketrekking, (4) en vippebryter som, når den trykkes ned, vil levere støtet. (E) Når støtet ikke er i bruk, holdes det på en ispose for å forhindre overoppheting og mulig funksjonsfeil. (F) En digital stereotaktisk skjerm brukes til å etablere koordinatene x (anterior-posterior), y (medial-lateral) og z (dorsal-ventral). Trinn 2: Kirurgisk prosedyre. (G,H) Den bedøvede og barberte musen er festet inn i den stereotaksiske rammen, (I) et midtlinjesnitt er laget for å avsløre (J) bregma, (K) som brukes under operasjonen for å stille opp kollisjonen. Trinn 3: Gjenoppretting. (L) Musen fjernes fra den stereotaktiske rammen. Etter at hodebunnen er lukket ved å stifte eller suturere huden sammen, plasseres den i et rent restitusjonsbur på siden. (M) Musen overvåkes til musen ruller over og høyrerefleksen oppstår. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: De temporale mønstrene av astrocytt (GFAP) og mikroglia (IBA1) morfologiske forandringer etter en CHI. (A) GFAP-farging ved lav forstørrelse viser den regionale økningen i farging sett i cortex i CHI-gruppen. Det morfologiske utseendet til astrocyttene er vist i de høyere forstørrelsesinnsatsene, som ble tatt fra de midterste hjerneseksjonene og fra de samme områdene i cortexen. (B) IBA1-positiv farging i cortex etter 1 dag, 7 dager og 2 måneder etter skade viser endringer i mikroglias morfologi i neocortex etter CHI (n = 7-14, 50/50 mann/kvinne). Musene (CD-1/129 bakgrunn) var 8 måneder gamle på operasjonstidspunktet. Denne figuren er tilpasset fra 11 og gjengitt med tillatelse. Skala bar = 1 mm, 50 μm og 100 μm som angitt på figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: CHI-induserte minneunderskudd i RAWM og aktiv unngåelse. (A) Ved 2 uker etter skaden var både CHI- og sham-opererte mus i stand til å lære RAWM-oppgaven, men CHI-musene gjorde flere feil sammenlignet med shammusene (*** p < 0,0005); humbug (n = 20/20 mann/kvinne); CHI (n = 20/20 hann/kvinne). Musene (C57BL/6J) var 3-4 måneder gamle på operasjonstidspunktet. (B) Ved 4 uker etter skade var CHI- og sham-opererte mus i stand til å lære den aktive unngåelsesoppgaven, men CHI-musene unngikk færre fotstøt sammenlignet med shammusene (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); humbug (n = 10/10 mann/kvinne); CHI (n = 9/10 hann/kvinne). Musene (C57BL/6J) var 3-5 måneder gamle på operasjonstidspunktet. Data vises som gjennomsnitt ± SEM. (A) Dette tallet er tilpasset fra 12 og gjengitt med tillatelse. (B) Dette tallet er tilpasset fra 13 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trinn er involvert i å gjenskape en konsistent skademodell ved hjelp av den beskrevne modellen. For det første er det viktig å sikre dyret riktig inn i den stereotaktiske rammen. Dyrets hode skal ikke kunne bevege seg sideveis, og skallen skal være helt flat med bregma og lambda som leser de samme koordinatene. Riktig plassering av ørestengene er det vanskeligste aspektet ved denne operasjonen, og dette kan bare læres med praksis. Hvis skallen ikke er i vater, bør hodet justeres før du induserer CHI. Unnlatelse av å justere hodeposisjonen vil forårsake kraniebrudd. For å vurdere at skallen er flat, bør man se på gapet mellom skallen og slagspissen fra alle vinkler rundt spissen. Mus med deprimerte kraniebrudd bør utelukkes fra forsøk, da de har en mye sterkere inflammatorisk respons og en mer alvorlig skade sammenlignet med mus som ikke fikk kraniebrudd19. I tillegg viser mus med kraniefrakturer mer alvorlige TBI-utfall, som posttraumatisk respiratorisk depresjon, sekundær rebound-skade og til slutt død20.
I denne studien ble dyrets hode sikret med ørestenger. Spesielt anbefales det bare å bruke musspesifikke acetalharpiksørestenger med et konisk punkt, ikke store rotteørestenger. Det er mulig å bruke ikke-punktering gummi-tipped ørestenger, men disse ørestengene vil komprimere skallen, endre biomekanikken til CHI, og er mindre reproduserbare. I tillegg er det en begrensning for å bruke ørestenger, da det ikke tillater rotasjonskrefter. Likevel oppveier den større reproduserbarheten til ørestengene det begrensede antallet rotasjonskrefter som kan genereres hvis hodet er ufiksert.
Å feste hodet med ørestenger kan imidlertid også forårsake skade på øret ved støt hvis slagkreftene alle er plassert ved ørene. Et hodestøtteapparat plassert under hodet for å forskyve kreftene bort fra ørene ble utviklet. Etter å ha testet flere putelignende gjenstander, var den som fungerte best, 1 ml latex-pipettepæren fylt med vann. Pipettepæren under dyrets hode kan utvides etter at dyret er i den stereotaktiske rammen, slik at den kan ha en tett passform og gi full støtte under hodet. Når det er plassert riktig, bør det ikke være blødning fra ørene eller atferdsmessige indikasjoner på øreskade (rulling / hodetilt) etter skaden.
Noen versjoner av CHI-modellen bruker en gummispisssonde 21,22 eller metallhjelm 23,24 for å redusere forekomsten av kraniebrudd. Så lenge slagspissen på 5 mm er i flukt med skallen, er det ikke nødvendig å bruke noen av dem. Det kan være fristende for nye brukere som ikke har lang erfaring med stereotaktisk kirurgi å indusere skaden med spissen som ikke er i flukt med skallen i medial-lateralplan. Hvis skallen ikke er nivå i medial-lateralplanet, er det fordi ørestengene ikke er plassert riktig. Den eneste løsningen på dette problemet er å fjerne dyret fra påvirkningen og tilordne musen til en svindelskade. Hvis spissen ikke er flush på det fremre-bakre planet, må høyden på bitestangen justeres og spissen justeres med bregma. Bruk av en 5 mm slagor med flat spiss reduserer også sjansen for å forårsake kraniebrudd19 sammenlignet med slagspisser med mindre diametre. Andre viktige faktorer å vurdere er alder og vekt av motivet, samt skallen tykkelse25 og stammer av musene26.
Hos mennesker er en mild TBI ikke forbundet med død i løpet av de første minuttene etter skaden. Hos dyr kan selv en mild skade forårsake død. Men i denne modellen er dødeligheten nesten alltid forbundet med kirurgiske komplikasjoner, ikke skaden alene. Den vanligste årsaken til at en mus vil dø etter virkningen er dybden av anestesi. Dette kan skje hvis operasjonen tok lengre tid enn forventet, eller hvis isofluran gassen var i en høyere konsentrasjon enn nødvendig for det dyret. Hvis dyrets pust er treg eller anstrengt, kan dette være et tegn på at anestesidybden bør reduseres før virkningen leveres. Hvis dyrets pust er langsom eller anstrengt på tidspunktet for påvirkning, vil dyret sannsynligvis ha apné og kan dø.
Det er mange modeller av mild TBI. Hver har styrker og svakheter, og denne modellen er ikke annerledes. Som rapportert, her er beskrevet en enkelt hitmodell av TBI, men modellen har blitt brukt til å forårsake en repeterende TBI15. Trinnene beskrevet i denne protokollen kan gjentas for å indusere en repeterende TBI-skade. Ved evaluering av de ulike TBI-modellene er det viktig å vurdere om modellen har den ønskede patologien som man forsøker å modellere. Man bør også vurdere hvor reproduserbar modellen er. Det anbefales sterkt at utgangspunktet for å bruke denne eller en hvilken som helst TBI-modell er å uavhengig validere og karakterisere at modellen fungerer som tidligere rapportert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health under tildelingsnummer R01NS120882, RF1NS119165 og R01NS103785 og forsvarsdepartementets prisnummer AZ190017. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health eller Department of Defense.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
