Summary
Protokollen beskriver mild traumatisk hjerneskade i en musemodel. Især forklares en trinvis protokol til at fremkalde en mild midterlinie lukket hovedskade og karakteriseringen af dyremodellen fuldt ud.
Abstract
Meget reproducerbare dyremodeller af traumatisk hjerneskade (TBI) med veldefinerede patologier er nødvendige for at teste terapeutiske indgreb og forstå mekanismerne for, hvordan en TBI ændrer hjernens funktion. Tilgængeligheden af flere dyremodeller af TBI er nødvendig for at modellere de forskellige aspekter og sværhedsgrader af TBI, der ses hos mennesker. Dette manuskript beskriver brugen af en midterlinje lukket hovedskade (CHI) til at udvikle en musemodel af mild TBI. Modellen betragtes som mild, fordi den ikke producerer strukturelle hjernelæsioner baseret på neuroimaging eller groft neuronalt tab. Imidlertid skaber en enkelt påvirkning tilstrækkelig patologi til, at kognitiv svækkelse kan måles mindst 1 måned efter skaden. En trin-for-trin protokol til inducering af en CHI i mus ved hjælp af en stereotaksisk styret elektromagnetisk slaglegeme er defineret i papiret. Fordelene ved den milde midterlinje CHI model omfatter reproducerbarheden af de skade-inducerede ændringer med lav dødelighed. Modellen er tidsmæssigt karakteriseret op til 1 år efter skaden for neuroimaging, neurokemiske, neuropatologiske og adfærdsmæssige ændringer. Modellen supplerer åbne kraniemodeller med kontrolleret kortikal påvirkning ved hjælp af den samme slaganordning. Således kan laboratorier modellere både mild diffus TBI og fokal moderat til svær TBI med samme slaglegeme.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er forårsaget af en ekstern kraft på hjernen, ofte forbundet med fald, sportsskader, fysisk vold eller trafikulykker. I 2014 fastslog centrene for sygdomsbekæmpelse og forebyggelse, at 2,53 millioner amerikanere besøgte akutafdelingen for at søge lægehjælp til TBI-relaterede ulykker1. Da mild TBI (mTBI) repræsenterer størstedelen af TBI-tilfælde, er der i løbet af de sidste årtier blevet vedtaget flere modeller af mTBI, som inkluderer vægttab, stempeldrevet lukket hovedskade og kontrolleret kortikal påvirkning, rotationsskade, mild væskepercussionskade og eksplosionsskademodeller 2,3. Heterogeniteten af mTBI-modellerne er nyttig til at adressere de forskellige funktioner, der er forbundet med mTBI, der ses hos mennesker, og til at hjælpe med at evaluere de cellulære og molekylære mekanismer, der er forbundet med hjerneskade.
Af de almindeligt anvendte modeller for lukket hovedskade er en af de første og mest anvendte modeller vægttabsmetoden, hvor en genstand tabes fra en bestemt højde på dyrets hoved (bedøvet eller vågen)2,4. I vægttabsmetoden afhænger skadens sværhedsgrad af flere parametre, herunder kraniotomi udført eller ej, hoved fast eller frit, og afstanden og vægten af den faldende genstand 2,4. En ulempe ved denne model er den store variation i skadens sværhedsgrad og den høje dødelighed forbundet med respirationsdepression 5,6. Et almindeligt alternativ er at levere stødet ved hjælp af en pneumatisk eller elektromagnetisk enhed, som kan gøres direkte på den udsatte dura (kontrolleret kortikal påvirkning: CCI) eller lukket kranium (lukket hovedskade: CHI). En af styrkerne ved den stempeldrevne skade er dens høje reproducerbarhed og lave dødelighed. CCI kræver imidlertid kraniotomi7,8, og en kraniotomi i sig selv inducerer betændelse9. I stedet er der i CHI-modellen ikke behov for kraniotomi. Som allerede nævnt har hver model begrænsninger. En af begrænsningerne ved CHI-modellen beskrevet i dette papir er, at operationen udføres ved hjælp af en stereotaksisk ramme, og dyrets hoved er immobiliseret. Mens fuld hovedimmobilisering sikrer reproducerbarhed, tager den ikke højde for bevægelse efter stødet, der kan bidrage til skaden forbundet med en mTBI.
Denne protokol beskriver en grundlæggende metode til at udføre en CHI-påvirkning med en kommercielt tilgængelig elektromagnetisk slaganordning10 i en mus. Denne protokol beskriver de nøjagtige parametre, der er involveret for at opnå en meget reproducerbar skade. Især har efterforskeren præcis kontrol over parametrene (dybde af skade, opholdstid og slaghastighed) for præcist at definere skadens sværhedsgrad. Som beskrevet producerer denne CHI-model en skade, der resulterer i bilateral patologi, både diffus og mikroskopisk (dvs. kronisk aktivering af glia, aksonal og vaskulær skade) og adfærdsmæssige fænotyper 11,12,13,14,15. Derudover betragtes den beskrevne model som mild, da den ikke fremkalder strukturelle hjernelæsioner baseret på MR eller grove læsioner på patologi selv 1 år efter skaden16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De udførte eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky, og både ARRIVE og vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr blev fulgt under undersøgelsen.
1. Kirurgisk opsætning
BEMÆRK: Mus er anbragt i grupper på 4-5/bur, luftfugtigheden i staldrummet holdes på 43%-47%, og temperaturen holdes på 22-23 °C. Mus får ad libitum adgang til mad og vand og udsættes for en 12 timer / 12 timers lys / mørk cyklus (7 am / 7 pm).
- Brug et udpeget kirurgisk område, såsom en hætte eller dedikeret kirurgisk procedurerum, til at udføre dyreoperationen.
- Sørg for, at det kirurgiske område omfatter en varmepude, en stereotaksisk ramme udstyret med en elektromagnetisk slaglegeme og en anæstesimaske designet til administration af isoflurangas (se figur 1A).
- Sørg for, at kirurgen eller personalet, der er involveret i operationen, bærer en ren laboratoriefrakke, en ansigtsmaske, handsker og en kirurgisk hætte.
- Brug sterile kirurgiske værktøjer, sterile applikatorer med bomuldsspids og gazebind. Brug en varm perlesterilisator til at sterilisere instrumenterne mellem mus i løbet af operationsdagen.
- Brug et anæstesiinduktionskammer til at forberede musen til operation i et præ-op-område.
- Brug varmepuder til at opretholde dyrets temperatur, rengør post-op museholdebure og timere til at registrere musens oprettende refleks efter operationen.
2. Procedure før operationen
- Klargør hovedstøtteapparatet (se figur 1B).
- Fjern den valsede enderyg fra en 1 ml latexpipettepære (oppustelig ende) (se figur 1C).
- Fastgør pæren til slangen ved hjælp af parafilm (se figur 1C).
- Tilslut slangen til en 10 ml sprøjte ved hjælp af en stophane. Fyld sprøjten med vand (se figur 1C).
BEMÆRK: 1 ml latexpipettepæren placeres under musens hoved for at fortrænge slagkraften væk fra ørerne. Prøv at fjerne så meget luft som muligt fra pæren før brug, så pæren er fyldt med for det meste vand og ikke luft.
- Opsætning af slaglegeme.
- Vælg 5 mm sondespidsen, skru den fast på stemplet nederst i midten af aktuatoren (inde i den større cylinder), og stram forsigtigt sonden uden at anvende overdreven kraft. Stram spidsen mellem stødene igen (se figur 1B).
- Før du tænder slaglegemet, skal du sikre dig, at kontakten Forlæng/træk tilbage er placeret i midterpositionen Fra. Tilslut derefter kablet på aktuatoren til stikket på frontpanelet på slaglegemets kontrolboks og sensorkablet til stikket på frontpanelet. Tænd derefter for afbryderen på bagpanelet (se figur 1D).
BEMÆRK: Vippekontakten Forlæng/træk tilbage skal forblive i midterpositionen Fra, når den ikke er i brug. - Indstil anslagshastigheden ved at dreje den store knap på venstre side af kontrolboksen, indtil der vises en slaghastighed på 5,0 ± 0,2 m/s på displayet (se figur 1D).
- Indstil opholdstælleren til 100 ms ved at dreje drejeknapperne, indtil dvælen viser 0,01 (se figur 1D).
BEMÆRK: Dvælen er tidspunktet for kontakt, før automatisk tilbagetrækning finder sted. - Placer slaglegemets aktuator på en ispose for at forhindre plastcylinderen i at udvide sig, hvilket låser cylinderen på plads, hvilket forhindrer cylinderens bevægelse og levering af fremtidige stød (se figur 1E).
- Forbered musen til operation.
- Undersøg musen visuelt før operationen og fjern musen fra undersøgelsen, hvis en af følgende tilstande observeres: dårlig pelstilstand, sløvhed eller dårlig vægt (<20 g) for en 4 måneder gammel mus.
- Bedøv musen med 4% -5% isofluran i 100% ilt ved hjælp af et induktionskammer placeret på en varmepude i 1-2 min.
- Barber pelsen fra operationsstedet ved hjælp af en elektrisk hårklipper.
- Rens hovedet med sterile alkoholforberedelsespuder og påfør et topisk bedøvelsesmiddel til den barberede hovedbund mindst 15 minutter før operationens start.
- Sæt musen tilbage i et rent holdebur før operationen. Start operationen efter mindst 15 minutters topisk anæstetisk applikation (induktionstid).
BEMÆRK: Tiden for anæstesi kan variere afhængigt af det bedøvelsesmiddel, der anvendes i proceduren.
- Kontroller endnu en gang, at den stereotaksiske ramme, slaglegemet og det digitale stereotaksiske display (se figur 1F) er klar til brug.
- Sæt musen tilbage i isofluraninduktionskammeret med 4-5% isofluran i 100% oxygen i ca. 3 min.
- Fastgør musen i hovedfasen.
3. Kirurgisk indgreb
- Fastgør musen i den stereotaksiske ramme ved hjælp af lette koniske ørestænger med acetalharpiks, en bidestang og en musebedøvelsesmaske (se figur 1G, H). Isoflurangassen leveres ved 2%-3% i rumluft ved 100-200 ml/min. Overvåg omhyggeligt musens åndedræt for at sikre dybden af anæstesi og juster gasniveauet efter behov.
- Påfør sterilt øjensmøremiddel på øjnene for at forhindre hornhindetørring.
- Steriliser hovedbunden med povidon-jod vatpinde og sterile alkoholpuder tre gange.
- Sørg for, at musen er dybt bedøvet ved at kontrollere manglen på et tåklemmerespons.
- Lav et ca. 1 cm midterlinjesnit i hovedbunden mellem øjnene og halsen ved hjælp af en skalpel, der blotlægger kraniet (se figur 1I).
- Lad kraniet tørre i 1-2 min.
- Identificer bregma (skæringspunktet mellem koronale og sagittale suturer) og lambda (skæringspunktet mellem sagittale og lambdoide suturer) (se figur 1J).
BEMÆRK: Et musehjerneatlas kan bruges som reference. - Placer hovedstøtteapparatet under hovedet og pust pæren op med vand, indtil den presser mod bunden af musens hoved, men løfter ikke hovedet væk fra bidestangen.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at reducere mulige øreproblemer fra CHI. Ethvert dyr med skader på øret fra ørestængerne, hvilket resulterer i rulning eller blødning, bør elimineres fra undersøgelsen og aflives. - Flyt slaglegemet på plads over dyrets hoved.
- Forlæng slaglegemet ved at placere vippekontakten Forlæng /træk tilbage (på slaglegemets kontrolboks) på Forlæng.
BEMÆRK: Sørg for at kontrollere, at spidsen er trukket helt ud ved at trække ned på spidsen. - Stil slaglegemet op, indtil det er centreret over bregma (se figur 1K).
- Nulstil de digitale stereotaksiske x- og y-koordinater i stereotaksisk læser til 0 (på den berøringsfølsomme skærm)
- Juster sonden over anslagsstedet ved at flytte sonden fra bregma over til målkoordinaterne: medial-lateral = 0,0 mm, anterior-posterior = -1,6 mm.
- Sæt kontaktsensoren fast på dyrets øre.
- Sænk langsomt sondespidsen med den forlængede sonde, indtil der er foretaget første kontakt med overfladen. Stop ved bip.
- Nulstil de digitale stereotaksiske z-koordinater i stereotakslæseren til 0.
- Kontroller omhyggeligt, om spidsen flugter med kraniet (mediale-laterale og forreste bageste planer).
BEMÆRK: Placering af sondespidsen er det mest afgørende trin i denne proces for at forhindre kraniebrud og øreskader. - Træk slaglegemet tilbage ved at placere vippekontakten på kontrolboksen i positionen Træk tilbage. Spidsen trækker sig tilbage og har ikke mere kontakt med dyrets hoved indtil tidspunktet for påvirkningen.
- Indstil slagdybden ved at justere den dorsale ventrale dybde til -1,2 mm.
BEMÆRK: Dybden af påvirkningen påvirker skadens sværhedsgrad. Dybden skal titeres for forskellige aldre, vægte og stammer af mus til den ønskede skadessværhedsgrad. Dybden skal muligvis justeres/titeres igen over tid for at opretholde en ensartet skadessværhedsgrad. Sværhedsgraden kan vurderes neuropatologisk: mikroglia og astrocytter (IHC) og adfærdsmæssigt: den radiale armvandlabyrint og den aktive undgåelsestest. - Overvåg omhyggeligt musens åndedræt for at sikre anæstesidybden og juster gasniveauet efter behov.
BEMÆRK: Ofte bør procentdelen af isoflurangas sænkes eller lukkes i 10-20 s før påvirkning. Hold nøje øje med, at åndedrættet accelererer lidt. Hvis åndedrættet er for langsomt på tidspunktet for påvirkningen, kan dyret dø inden for de første 60 s efter påvirkningen fra apnø. Dette kan forhindres ved at justere dybden af anæstesi i sekunderne før påvirkningen. - Fremkald påvirkningen ved at trykke på højre vippekontakt for at støde. Sondespidsen går ned ved den viste hastighed og forbliver derefter nede i den indstillede opholdstid og trækker sig tilbage.
BEMÆRK: Falske mus får samme håndtering som CHI-musene, men påvirkningen leveres ikke. - Start timeren umiddelbart efter, at CHI-stødet er leveret, for at registrere oprettetiderne (tid til at vende tilbage fra sideposition til udsat position), eller start timeren, når musen fjernes fra stereotaksrammen for skinmusene. Den gennemsnitlige oprettende reflekstid er 5-15 min.
BEMÆRK: De oprettende reflekstider kan variere afhængigt af musens belastning og alder. - Evaluer musene for synlige kraniebrud, blødninger og apnø. Ekskluder musene med en deprimeret kraniebrud eller synlig blødning fra undersøgelsen.
BEMÆRK: Der er graduerede niveauer af kraniebrud. Dyr med dekomprimerede kraniebrud, hvor knoglen observerbart presser ind i hjernevævet, aflives (CO2 først og halshugning anvendes som en sekundær metode). Hvis slaglegemespidsen er indstillet korrekt, er disse typer kraniebrud yderst sjældne. Hvis der opstår et kraniebrud, er den mere almindelige præsentation en lille dråbe blod på kraniet og en let taktil skrubning af kraniet, ofte langs suturen, der forbinder den bageste spids af næsebenet. Disse mus er noteret som mulige kraniebrud i optegnelserne, men er normalt ikke udelukket fra undersøgelsen. - Fjern dyret fra den stereotaxiske ramme.
- Luk hovedbunden ved at hæfte huden sammen.
BEMÆRK: Absorberbare eller ikke-absorberbare suturer kan bruges til at lukke hovedbunden som et alternativ til hæfteklammer. - Påfør tredobbelt antibiotisk salve med en steril applikator med bomuldsspids på det lukkede snit.
- Sæt musen tilbage i et rent holdebur til genopretning. Halvdelen af restitutionsburet er på en varmepude (lav indstilling), hvilket giver mulighed for at bevæge sig væk fra varmen, når det er vågent, og opretholde dyrets temperatur, mens det er bevidstløst (se figur 1L).
BEMÆRK: Musen placeres på sin side i genopretningsburet. For at forhindre kvælning skal du placere dyret i et genopretningsbur uden strøelse eller på et væv, hvis strøelse er i buret. - Sæt kontakten Udvid/træk tilbage i positionen Center/Fra .
BEMÆRK: Strømmen fortsætter med at køre, hvis kontakten efterlades i enten forlængelses- eller tilbagetrækningsposition, hvilket får stemplet til at svulme op. Slaglegemet vil så ikke være funktionelt, før stemplet køler ned. - Fjern slaglegemet fra holderen, og læg det forsigtigt på isposen.
BEMÆRK: Opbevaring af slaglegemet på en ispose hjælper med at reducere den potentielle hævelse af slaglegemet. - Overvåg dyret, indtil den oprettende refleks opstår, og dokumentér tiden indtil opretning (se figur 1M).
BEMÆRK: Den oprettende refleks defineres som det øjeblik, musen vender tilbage til en udsat position. Buret skal efterlades uforstyrret; Musen kunne rette, hvis buret berøres, flyttes eller udsættes for nogle lyde. - Sæt musene tilbage i deres hjemmebur, når de er vågne og opmærksomme. Normalt er dyrene inden for 1 time efter skade fuldt bevidste og ambulerer. Tilsæt også lidt fugtig mad i bunden af buret.
4. Pleje efter operationen
- Overvåg dyrene i 5 dage efter operationen.
- Registrer deres vægt og eventuelle fysiske / adfærdsmæssige ændringer som vejrtrækning (kvalitativ åndedrætsfunktion), gang, krop og hår frakke tilstand, spise, drikke, afføring og vandladning.
- Overhold musen for tegn på ubehag og det kirurgiske sår for hævelse, ekssudater eller røde kanter, ordehiscence. Kontakt en dyrlæge, hvis dyret viser tegn på smerte og ubehag (vokaliseringer, ikke bevæger sig, hypotermi, drikker eller spiser ikke).
- Fjern hæfteklammerne 7-10 dage efter operationen under anæstesi og på en varmepude.
BEMÆRK: Hvis der anvendes ikke-absorberbare suturer, skal de fjernes 7-10 dage efter operationen under anæstesi.
5. Rengøring
- Rengør og steriliser det kirurgiske område og værktøjer.
- Rengør sondespidsen efter hver brug og sidst på dagen med alkoholforberedelsespuder.
BEMÆRK: Slaglegemet kalibreres på fabrikken og rapporteres at være stabilt over tid og brug. Ingen rutinemæssig kalibrering er nødvendig. Slaglegemet og stereotaksrammen skal dog rutinemæssigt inspiceres. Modelslutpunktets perimetre såsom oprettende reflekstid, dødelighed og neuropatologi bør også overvåges for at evaluere mulig eksperimentel drift.
6. Udelukkelseskriterier
- Ekskluder dyr før operation med en dårlig helbredstilstand, som dårlig vægt < 20 g for en 4 måneder gammel mus, sløvhed og dårlig pelstilstand.
- Ekskluder dyr med komplikationer under operationen som en deprimeret kraniebrud, en synlig blødning relateret til kirurgi eller øreblødning.
- Ekskluder dyr fra undersøgelsen med følgende postoperative symptomer: manglende spisning og/eller normal bevægelse, usædvanlige vokaliseringer, vægttab eller manglende helbredelse af såret normalt efter operationen.
BEMÆRK: Denne model kan bruges som en gentagen model af mild TBI. Hvis musene får den anden operation 24 timer fra den første, kan hæfteklammerne eller suturen fjernes, og det samme snit kan bruges til at udsætte kraniet. Et nyt snit skal foretages, hvis der går længere tid mellem operationerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne stereotaxiske elektromagnetiske slaganordning er alsidig. Det bruges til både en åben kraniekontrolleret kortikal påvirkning (CCI) eller en lukket hovedskade (CHI) kirurgi. Desuden kan skadens sværhedsgrad moduleres ved at ændre skadeparametrene såsom slaghastighed, opholdstid, slagdybde, slagkraft og skademål. Heri beskrives en CHI-operation med en 5,0 mm stålspidsslaglegeme. Denne skade betragtes som mild, fordi der ikke er nogen strukturelle hjernelæsioner. Dødeligheden hos voksne mus er mindre end 0,9%11,14 og stiger lidt for at nå ~2,5% hos ældre mus (>8 måneder gamle)11. Dødelighed opstår i løbet af de første 2 minutter på grund af apnø, som stort set kan forhindres ved nøje at overvåge dybden af anæstesi i sekunderne før påvirkningen.
Fordelen ved denne CHI-model er, at virkningen producerer bilateral diffus patologi uden at skulle eksponere den kortikale durale overflade (kraniotomi). En anden funktion, der gør dette til en effektiv TBI-model, er, at mindre end 1% af musene udelukkes fra undersøgelsen på grund af kraniebrud eller øreproblemer efter den kirurgiske procedure. Det er vigtigt, at modellen producerer neuropatologiske og adfærdsmæssige svækkelser med en enkelt indvirkning, hvilket reducerer den eksperimentelle kompleksitet forbundet med gentagne milde CHI-modeller15. For eksempel identificeres et reproducerbart tidsmæssigt mønster af mikroglia og astrocytmorfologiske ændringer11 (figur 2A, B). Ved validering af modellen anbefales det at bruge startområderne for de forreste bageste koordinater som -1,5 mm ± 0,2 mm og slagdybden som 1,0 ± 0,2 mm. Koordinaterne skal muligvis justeres for musenes alder og belastning samt mærke og model for det anvendte udstyr. Når indstillingerne er valideret, skal de holdes konstante for et eksperiment. Til validering anbefales den neuropatologiske karakterisering af mikroglia og astrocytter 3 dage efter skade. Immunohistokemisk (IHC) farvning blev afsluttet efter metoderne i Bachstetter et al.18. Specifikt blev 30 μm koronale fritflydende sektioner farvet til glialaktivering med kanin anti-GFAP (1:10.000) og til astrocytter ved hjælp af en kanin anti-IBA1 (1:10.000). En HRP konjugeret ged anti-kanin IgG (1:200) blev brugt til at detektere både GFAP og IBA-1. Der blev anvendt kvantificeringssoftware til at kvantificere farvningen i hver af de betragtede regioner. Derudover blev der 1 dag efter skade fundet aksonale skademarkører i neocortex, og ændringer i mitokondriemetabolisme blev fundet 28 dage efter CHI16 (data ikke vist).
De sekundære endepunkter til validering af modellen ville være adfærdsmæssige assays. Reproducerbare CHI-inducerede underskud i den radiale arm vandlabyrint (RAWM)12 og aktiv undgåelse13 adfærd blev fundet (figur 3). Musene blev testet i en 8-armet RAWM, en særlig læringstest, som beskrevet i Macheda et al.12. Kort fortalt blev musene testet i i alt 28 forsøg over en 4-dages protokol og havde 60 s til at lokalisere platformen placeret i målarmen. Det samlede antal forsøg pr. dag var syv; Dag 1 og dag 2 blev betragtet som træningsdage og dag 3 og 4 som testdage. I løbet af træningsdagene blev musene trænet i at lokalisere platformen, skiftevis mellem synlige og skjulte forsøg; I løbet af testdagene var platformen skjult under alle forsøg. Eksperimenterne blev optaget ved hjælp af et kamera, og et sporingssystem blev brugt til adfærdsanalyse (antal fejl, samlet afstand og latenstid). Musene blev testet 2 uger efter skaden. Selvom der ikke var nogen effekt af sex, lavede CHI-musene flere fejl for at udføre opgaven og nå platformen (figur 3A). Desuden er hukommelsessvigt blevet påvist i en 6-arm RAWM test11,14,15,16 samt. Aktiv undgåelse, en associativ læringsbaseret test, er blevet brugt til at måle de kognitive underskud forbundet med denne milde model af CHI. Musene blev testet ved hjælp af en 5-dages protokol og udsat for 50 forsøg / dag13. Musene blev trænet til at undgå et mildt fodstød (ubetinget stimulus, US) ved at forbinde en betinget stimulus (CS, lys) med den. Over tid lærte musene at undgå USA, når CS blev præsenteret. CHI-musene havde nedsat kognitiv funktion ved aktiv undgåelse sammenlignet med skinmus (figur 3B). De falske hunmus lærte betydeligt hurtigere sammenlignet med hannerne, men kønnet spillede ikke en rolle i CHI-mus13. Adfærd blev registreret ved hjælp af aktiv/passiv undgåelsessoftware. Et reproducerbart underskud i motorfunktionen ud over den første uge efter skaden er ikke påvist11.
I denne milde TBI-model blev der ikke fundet nogen grove strukturelle læsioner i hjernen, og en enkelt påvirkning inducerede bilateral gliaaktivering og ændringer i mikrogliamorfologi. Også kognitive underskud er forbundet med denne TBI-model.
Figur 1: Trin 1: Opsætning af kirurgisk område. (A) Et eksempel på det kirurgiske område og de værktøjer, der er nødvendige for at udføre CHI-kirurgi (ispose til slaglegemet, stereotaksisk ramme udstyret med slaglegemet, slaglegemets kontrolboks og kirurgiske værktøjer) vises. (B) Et nærbillede af 5 mm stålsondespidsen, bidestangen og hovedstøtteapparatet, som illustrerer den nødvendige placering til midterlinjekollisionen. (C) Hovedstøtteapparatet er fremstillet af en 1 ml latexpipettepære, der er fastgjort til slangen ved hjælp af parafilm. En 10 ml sprøjte er fyldt med vand for at puste pæren op, med en stophane for at holde pæren oppustet, når den er på plads. (D) Slaglegemets kontrolboks: (1) en stor knap til justering af slaghastigheden, (2) en opholdstæller, (3) en udvid/tilbagetræk-vippekontakt, (4) en vippekontakt, der, når den trykkes ned, leverer stødet. E) Når slaglegemet ikke er i brug, opbevares det på en ispose for at forhindre overophedning og eventuelle funktionsfejl. (F) Et digitalt stereotaksisk display bruges til at bestemme x-koordinaterne (anterior-posterior), y (medial-lateral) og z (dorsal-ventral). Trin 2: Kirurgisk procedure. (G,H) Den bedøvede og barberede mus er fastgjort i den stereotaksiske ramme, (I) et midterlinjesnit er lavet for at udsætte (J) bregma, (K), som bruges under operationen til at stille slaglegemet op. Trin 3: Gendannelse. (L) Musen fjernes fra den stereotaksiske ramme. Når hovedbunden er lukket ved at hæfte eller sy huden sammen, placeres den i et rent genopretningsbur på siden. (M) Musen overvåges, indtil musen ruller rundt, og den oprettende refleks opstår. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De tidsmæssige mønstre af astrocyt (GFAP) og microglia (IBA1) morfologiske ændringer efter en CHI. (A) GFAP-farvning ved lav forstørrelse viser den regionale stigning i farvning set i CHI-gruppens cortex. Det morfologiske udseende af astrocytterne er vist i de højere forstørrelsesindsætninger, som blev taget fra de midterste hjernesektioner og fra de samme områder af cortex. (B) IBA1-positiv farvning i cortex 1 dag, 7 dage og 2 måneder efter skade viser ændringer i mikrogliamorfologi i neocortex efter CHI (n = 7-14, 50/50 mand / kvinde). Musene (CD-1/129 baggrund) var 8 måneder gamle på operationstidspunktet. Dette tal er blevet tilpasset fra 11 og gengivet med tilladelse. Skalastang = 1 mm, 50 μm og 100 μm som angivet i figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CHI-inducerede hukommelsesunderskud i RAWM og aktiv undgåelse. (A) 2 uger efter skaden var både de CHI- og sham-opererede mus i stand til at lære RAWM-opgaven, men CHI-musene lavede flere fejl sammenlignet med skinmusene (*** p < 0,0005); humbug (n = 20/20 mand/kvinde); CHI (n = 20/20 mand/kvinde). Musene (C57BL/6J) var 3-4 måneder gamle på operationstidspunktet. (B) 4 uger efter skaden var CHI- og shamopererede mus i stand til at lære den aktive undgåelsesopgave, men CHI-musene undgik færre fodstød sammenlignet med skinmusene (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); humbug (n = 10/10 mand/kvinde); CHI (n = 9/10 mand/kvinde). Musene (C57BL/6J) var 3-5 måneder gamle på operationstidspunktet. Data vises som middelværdi ± SEM. (A) Dette tal er blevet tilpasset fra 12 og gengivet med tilladelse. (B) Dette tal er blevet tilpasset fra 13 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trin er involveret i at genskabe en konsistent skadesmodel ved hjælp af den beskrevne model. For det første er det afgørende at fastgøre dyret korrekt i den stereotaxiske ramme. Dyrets hoved bør ikke kunne bevæge sig sideværts, og kraniet skal være helt fladt med bregma og lambda, der læser de samme koordinater. Korrekt placering af ørestængerne er det sværeste aspekt af denne operation, og dette kan kun læres med praksis. Hvis kraniet ikke er plant, skal hovedet justeres, før der induceres CHI. Manglende justering af hovedets positionering vil forårsage kraniebrud. For at vurdere, at kraniet er fladt, skal man se på afstanden mellem kraniet og slagspidsen fra alle vinkler omkring spidsen. Mus med deprimerede kraniebrud bør udelukkes fra forsøg, da de har en meget stærkere inflammatorisk reaktion og en mere alvorlig skade sammenlignet med mus, der ikke led kraniebrud19. Derudover viser mus med kraniebrud mere alvorlige TBI-resultater, såsom posttraumatisk respirationsdepression, sekundær rebound-skade og til sidst død20.
I denne undersøgelse blev dyrets hoved sikret med ørestænger. Især anbefales kun musespecifikke acetalharpiksørestænger med et konisk punkt at blive brugt, ikke store rotteørestænger. Det er muligt at bruge ikke-punkterings gummispidsede ørestænger, men disse ørestænger komprimerer kraniet, ændrer CHI's biomekanik og er mindre reproducerbare. Derudover er der en begrænsning for at bruge ørestænger, da det ikke tillader nogen rotationskræfter. Ikke desto mindre opvejer ørestængernes større reproducerbarhed det begrænsede antal rotationskræfter, der kan genereres, hvis hovedet ikke er fastgjort.
Fastgørelse af hovedet med ørestænger kan dog også forårsage skade på øret ved stød, hvis slagkræfterne alle er placeret ved ørerne. Et hovedstøtteapparat placeret under hovedet for at forskyde kræfterne væk fra ørerne blev udviklet. Efter at have testet flere pudelignende genstande var den, der fungerede bedst, 1 ml latexpipettepæren fyldt med vand. Pipettepæren under dyrets hoved kan udvides, efter at dyret er i stereotaxisk ramme, så det kan have en tæt pasform og give fuld støtte under hovedet. Når den placeres korrekt, bør der ikke være blødning fra ørerne eller adfærdsmæssige indikationer på øreskader (rullende/hovedhældning) efter skaden.
Nogle versioner af CHI-modellen bruger en gummispidssonde 21,22 eller metalhjelm 23,24 for at reducere forekomsten af kraniebrud. Så længe 5 mm slaglegemet flugter med kraniet, er det ikke nødvendigt at bruge nogen af dem. Det kan være fristende for nye brugere, der ikke har stor erfaring med stereotaksisk kirurgi at fremkalde skaden med spidsen ikke flush med kraniet i medial-lateral plan. Hvis kraniet ikke er plant i det mediale-laterale plan, skyldes det, at ørestængerne ikke er placeret korrekt. Den eneste løsning på dette problem er at fjerne dyret fra slaglegemet og tildele musen til en skinskade. Hvis spidsen ikke flugter med det forreste og bageste plan, skal bidestangens højde justeres, og spidsen justeres igen med bregmaen. Brug af en 5 mm slaglegeme med en flad spids reducerer også risikoen for at forårsage kraniebrud19 sammenlignet med slaglegemespidser med mindre diametre. Andre vigtige faktorer at overveje er motivets alder og vægt samt kranietykkelsen25 og musenes stammer26.
Hos mennesker er en mild TBI ikke forbundet med døden i de første minutter efter skaden. Hos dyr kan selv en mild skade forårsage død. Men i denne model er dødelighed næsten altid forbundet med kirurgiske komplikationer, ikke skaden alene. Den mest almindelige årsag til, at en mus ville dø efter påvirkningen, er dybden af anæstesi. Dette kan forekomme, hvis operationen tog længere tid end forventet, eller hvis isoflurangassen var i en højere koncentration end nødvendigt for det pågældende dyr. Hvis dyrets vejrtrækning er langsom eller anstrengt, kan dette være et tegn på, at anæstesidybden skal reduceres, inden virkningen leveres. Hvis dyrets åndedræt er langsomt eller anstrengt på tidspunktet for påvirkningen, vil dyret sandsynligvis have apnø og kan dø.
Der er mange modeller af mild TBI. Hver har styrker og svagheder, og denne model er ikke anderledes. Som rapporteret, her er beskrevet en enkelt hit model af TBI, men modellen er blevet brugt til at forårsage en gentagen TBI15. De trin, der er beskrevet i denne protokol, kan gentages for at fremkalde en gentagen TBI-skade. Når man vurderer de forskellige TBI-modeller, er det vigtigt at overveje, om modellen har den ønskede patologi, som man forsøger at modellere. Man bør også overveje, hvor reproducerbar modellen er. Det anbefales kraftigt, at udgangspunktet for at bruge denne eller enhver TBI-model er uafhængigt at validere og karakterisere, at modellen fungerer som tidligere rapporteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health under tildelingsnumrene R01NS120882, RF1NS119165 og R01NS103785 og Department of Defense award nummer AZ190017. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Department of Defense.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
