Flotasjonsbasert T-celle isolering, aktivering og utvidelse fra humane perifere blod-mononukleære celleprøver ved bruk av mikrobobler

Summary

Målet med denne studien er å demonstrere muligheten for flotasjonsbasert separasjon for å isolere, aktivere og utvide primære humane T-celler.

Abstract

Prosessen med å isolere T-celler fra perifere mononukleære celler (PBMCs) for å etablere ex vivo-kulturer er avgjørende for forskning, klinisk testing og cellebaserte terapier. I denne studien presenteres en enkel, ny protokoll for å isolere, aktivere og utvide T-celler fra PBMCs ex vivo . Denne studien benytter funksjonalisert oppdriftsaktivert cellesortering (BACS) teknologi for å isolere og aktivere T-celler. Kort fortalt innebærer protokollen positiv seleksjon av CD3⁺ -celler fra leukopak-avledede PBMC-er, etterfulgt av en 48-timers kostimulering med forhåndskonjugerte anti-CD28-bundne streptavidinmikrobobler (SAMB) før transduksjon i 24-brønnsplater. Funksjonaliserte mikrobobler gir en unik mulighet til å aktivere celler flytende, noe som fører til proliferative fenotyper som muliggjør ekspansjon med minimal utmattelse. Denne teknikken gir redusert utmattelse fordi de kostimulerende mikroboblene forblir flytende og går tilbake til toppen av kulturmediet, og reduserer dermed tiden de ekspanderende cellene er i kontakt med de kostimulerende faktorene. Resultatene indikerer at de isolerte og kultiverte T-cellene får nok stimulering til å aktivere og proliferere, men ikke i en grad som fører til overaktivering, noe som deretter fører til utmattelse, som demonstrert ved tilstedeværelse av overdreven PD-1.

Introduction

Mer enn 500 chimere antigenreseptor (CAR) -T celleterapi kliniske studier utføres for tiden over hele verden, og fire CAR-T celleterapiprodukter er tilgjengelige på markedet¹. Imidlertid eksisterer det fortsatt mange CAR-T-celleforsknings- og produksjonsbehov som må tas opp for å forbedre effektiviteten, skalerbarheten og den langsiktige suksessen til disse potensielt kurative terapiene 2,3,4,5. Adoptiv CAR-T-celle klinisk forskning og produksjon begynner med T-celleisolasjon fra en perifer blodprøve og påfølgende stimulering, transduksjon og utvidelse av de isolerte cellene. Parametere som T-cellegjenoppretting, renhet og aktiverings- / utmattelsessignaler krever nøye vurdering når du velger celleisolasjons- og stimuleringsteknikker for CAR-T-celleforskning og produksjon ^3,4,6. Det er viktig at forbedring i terapeutisk utholdenhet av CAR-T-celleterapier ved å minimere de biologiske hindringene som følge av dagens produksjonsprosesser, for eksempel T-celleutmattelse, er nødvendig for å forbedre den terapeutiske effekten ^6,7.

Som et alternativ til tradisjonelle celleisolasjonsmetoder som fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk aktivert cellesortering (MACS), her demonstreres oppdriftsaktivert cellesortering (BACS) med mikrobobler for T-celleisolasjon. Microbubble separasjon bruker flytende, hule mikrosfærer (mikrobobler) for å binde målene og flyte dem til overflaten av væskeprøver ^8,9. Ved å funksjonalisere mikrobobler med antistoffer (dvs. anti-CD3), kan de ønskede T-cellepopulasjonene velges positivt fra perifere blodprøver. Deretter demonstreres bruk av en annen populasjon av antistofffunksjonaliserte mikrobobler (dvs. anti-CD28) for å stimulere og aktivere positivt utvalgte T-celler i suspensjon i dette arbeidet. Microbubbles tilbyr en enkel og svært justerbar isolasjons- og aktiveringsarbeidsflyt som genererer T-celler klar for suspendert cellekultur og nedstrøms applikasjoner som genetisk modifisering og utvidelse. Kritisk fremmer flytende celleaktivering med mikrobobler behersket cellestimulering for å forhindre overdreven T-celleutmattelse⁷.

For denne studien var flowcytometri det primære verktøyet som ble brukt til å analysere isolasjons-, aktiverings- og transduksjonssuksessen til de funksjonaliserte mikroboblene, samt å gi detaljert informasjon om de spesifikke underpopulasjonene som er tilstede under vekst- og ekspansjonsfasene etter transduksjon. I tillegg til flowcytometri ble lysfelt- og fluorescensmikroskopi brukt for å bekrefte cellehelsen, morfologien og transduksjonssuksessen. Basert på disse resultatene gir mikrobobleteknologien og protokollen et mer justerbart og mildere alternativ til de tradisjonelle isolasjons- og aktiveringsmetodene som for tiden er i bruk i dag; Spesielt viser mikrobobleaktiverte celler betydelig lavere uttrykk for T-celleutmattelsesmarkører enn det som vanligvis observeres med industristandardverktøy og sett.

Protocol

1. Isolering av T-celler med mikrobobler ved bruk av positivt utvalg

MERK: Denne protokollen beskriver en liten CD3⁺ positiv seleksjonsmetode ved bruk av SAMB-er.

1. Inkuber 3 x 10⁸ kommersielt oppnådde PBMC-er i 2,5 ml separasjonsbuffer med biotinylert anti-CD3 (OKT3) antistoff ved en konsentrasjon på 25 ng antistoff per 1 million celler (25 ng / M). Bland forsiktig ved pipettering opp og ned, og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
2. Tilsett streptavidinmikrobobler (SAMB) i forholdet 0,5 (SAMB-mengde):1 (cellemengde) i henhold til produsentens rapporterte SAMB-konsentrasjon.
3. Bland med en kommersiell end-over-end (EOE) rotator ved 20 o / min i 10-15 minutter ved romtemperatur. Sentrifuge i 5 minutter ved 400 x g ved romtemperatur.
4. Etter sentrifugering vil de positivt valgte cellene være på toppen av suspensjonen med SAMB-ene. De resterende ikke-valgte cellene vil være i cellepelleten i bunnen av røret. Ved hjelp av en 9-tommers glasspipette, sett spissen under boblecellelaget til bunnen av røret, aspirer cellepelleten og subnatant med en elektronisk pipette og overfør dem til et nytt rør.

2. Co-stimulering (aktivering) av de positivt valgte T-cellene

1. Resuspend boblecellelaget som er igjen i det opprinnelige røret i 1 ml komplett T-cellemedium (eller et annet ønsket medium).
2. Tell cellene i subnatanten med lysfeltmikroskopi ved hjelp av en automatisert celleteller, og trekk denne verdien fra startcellenummeret for å bestemme antall celler som er fanget i boblecellelaget.
3. Før dette trinnet, bland det biotinylerte anti-CD28-antistoffet med kommersielle SAMB-er i minst 2 timer for å lage de konjugerte anti-CD28 SAMB-ene. Kontakt SAMB-produsenten for å bestemme mengden anti-CD28-antistoff som trengs for konjugering. Tilsett anti-CD28 konjugerte SAMB-er til boblecellesuspensjonen som følge av trinn 2.1 ved å bruke et forhold på 1,5 (anti-CD28 SAMB):1 (celler).
4. Bland med EOE-rotasjon i 15 minutter, og juster deretter det totale volumet til 2 millioner celler per ml med komplett T-cellemedium eller et annet ønsket medium i henhold til cellenummeret oppnådd i trinn 2.2.

3. Utvidelse av de kostimulerte cellene i cellekulturmedium

1. Fordel 1 ml aktiverte celler fra trinn 2.4 med en konsentrasjon på 2 M/ml per brønn i en plate med 24 brønner. Inkuber i en fuktet 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C.
2. Etter 24 timer, tilsett 50 U / ml IL-2 og 25 ng / M løselig anti-CD3 (OKT3) for ytterligere å oppmuntre til ekspansjon, som beregnet ved hjelp av det opprinnelige antall celler belagt på dag 0. Plasser celleplaten tilbake i den fuktede CO_{2-inkubatoren} , og la den ruge over natten ved 37 °C.

4. Valgfritt: Transduksjon av aktiverte T-celler med lentivirus

MERK: Tilnærmingen som brukes her er tilpasset fra Prommersberger et al. ¹⁰.

1. Tine lentiviruset ved romtemperatur, og bland kort ved pipettering.
2. Fjern forsiktig midten av natanten, 600 μL fra hver brønn, uten å berøre dattercellene som nå er på bunnen av brønnen eller boblelaget som har blitt igjen på overflaten av løsningen.
3. Tilsett 5 μg / ml heksadimetrinbromid per brønn for å forbedre viral transduksjon. Legg til lentiviralpartiklene ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 3 (lentivirale partikler per celle).
4. Sentrifuger platen i 45 minutter ved 800 x g og 32 °C ved hjelp av langsom akselerasjon og ingen pause for retardasjon. Inkuber cellene i 4 timer i en fuktet CO 2-inkubator ved 37 °C.
5. Etter 4 timer tilsett 600 μL kommersielt tilgjengelig, ferskt komplett T-cellemedium og 50 U/ml IL-2 til hver brønn, og plasser celleplaten tilbake i den fuktede CO 2-inkubatoren ved 37 °C for_{T-celleutvidelse} .

5. Utvidelse av T-cellene (med eller uten forutgående transduksjon)

1. Hver 2. dag, fjern halvparten av mediet fra midten av natanten, erstatt det med friskt, komplett T-cellemedium, og tilsett IL-2 i en konsentrasjon på 50 U / ml.
2. Tell T-cellene to ganger i uken for å vurdere celletettheten. Når celletettheten overstiger 2 x 10 6-2,5 x 10⁶ celler / ml, overfør cellene til et større kar, fortynn dem til 5 x 10⁵ celler / ml.

6. Høsting av T-cellene og flowcytometri

1. Bland innholdet i hver brønn forsiktig ved å pipettere opp og ned. Fjern hele innholdet i brønnen, inkludert mikroboblene, og overfør dem til et 1,5 ml rør.
2. Vask hver brønn med 400 μL kalsiumfri og magnesiumfri DPBS (−/−), og overfør løsningen til et 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
3. Aspirer supernatanten, og resuspendere cellepelleten i 50 μL separasjonsbuffer.
4. Stain med et aktiverings- og utmattelsesantistoff/fargecocktail, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Forbered fargecocktailene som følger - aktiveringscocktail: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; utmattelse cocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
5. Tilsett 1 ml separasjonsbuffer, og bland forsiktig. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å vaske ut overflødige antistoffer. Aspirer supernatanten helt.
6. Resuspend cellepelleten i 1 ml separasjonsbuffer, og overfør til et passende kar (f.eks. Et FACS-rør, en 96-brønnsplate, etc.) for flowcytometrianalysen. Anbefalt kartlegging av flowcytometrianalyse er beskrevet i figur 1.

Representative Results

T-celler ble isolert fra kjøpte PBMC-er og belagt for aktivering som beskrevet i protokollen. De negative kontrollprøvene (kjøpte PBMCer) ble ikke aktivert. Disse kontrollprøvene ble inkludert for å demonstrere effekten som mikrobobleaktiveringsprosessen hadde på de eksperimentelle prøvene sammenlignet med de uberørte og ustimulerte T-cellekontrollene, slik at aktiveringsmarkørene som ble observert var resultatet av de ekstra aktiveringsfaktorene og ikke var iboende for T-cellene selv. I henhold til eksperimentell disposisjon i figur 2 ble cellene sådd ved 2 x 10⁶ celler / ml i T-cellemedium og var enten uberørt / ustimulert eller co-stimulert med anti-CD3 (klon OKT3) og anti-CD28 (klon 28,2) SAMB. Etter 48 timers stimulering i kultur ble cellene transdusert med lentiviral partikkelkoding for zsGreen. Ved 4 dager og 6 dager etter transduksjon ble cellene avbildet, høstet og overflatefarget ved hjelp av AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (eller PE-CD69, avhengig av om henholdsvis utmattelses- eller aktiveringspanelene ble brukt) og 7-AAD. ZsGreen-transgenet kunne påvises i FITC-kanalen. Flowcytometri-gating-tilnærmingen er beskrevet i figur 1. Økninger i levedyktige T-celletall og transgene-positive T-celler ble observert mellom kontrollprøven og cellene som fikk mikroboble-kostimulering (figur 3). Økte effektorcellepopulasjoner ble også observert i mikrobobleprøvene (figur 4). T-celler som uttrykker økte aktiverings- og utmattelsesmarkører ble observert blant celleprøvene som fikk mikroboble-kostimulering (figur 5 og figur 6). Celleutvidelse ble observert mellom dag 4 og dag 6 av de kostimulerte prøvene, noe som indikerer at cellene var aktive, proliferative og passerte transgenet etter hvert som de utvidet seg.

Figur 1: Eksempel gating skjema-urørt / negativ kontrollprøve. Fra singletene ble populasjonscellene gated neste ved hjelp av SSC-A / FSC-A. De totale CD3 + -cellene ble inngjerdet, etterfulgt av levedyktig CD3 ⁺ gating ved hjelp av 7-AAD for å bestemme levedyktigheten til befolkningen. Alle påfølgende populasjoner og beregninger ble bestemt ut fra den levedyktige 7-AAD(−)/CD3⁺(+)-populasjonen, som vist ved hjelp av pilene som indikerer delpopulasjonsportene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Eksperimentell tidslinjeoversikt. Protokollens dager er nevnt ovenfor, og de tilsvarende dagene etter transduksjon (D0-D6) brukes i figurene nedenfor. Cellene ble belagt umiddelbart etter valg og aktivering. Kontrollbrønnene ble generert ved hjelp av en mikroboble negativ seleksjonsprotokoll. Kontroll-T-cellene mottok ikke kostimuleringsmidler og gjennomgikk ikke transduksjon, selv om de mottok IL-2 for å sikre at cellene ble holdt sunne nok til å opprettholde rimelig levedyktighet gjennom hele forsøket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Vurdering av levedyktige og vellykket transducerte celler etter transduksjon. (A) Levedyktige CD3⁺ -celler 4 dager og 6 dager etter transduksjon. Levedyktigheten ble bestemt gjennom flowcytometrianalyse, der populasjonen ble kvantifisert ved å samle 7-AAD(−)/CD3⁺(+)-celler. (B) Antall celler vellykket transdusert med rLV.EF1.zsGreen ble bestemt gjennom flowcytometri, hvor den levedyktige 7-AAD (−) / CD3 ⁺ (+) populasjonen ble videre inngjerdet i zsGreen (+) celler. Alle tilstandene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Levedyktige CD4+- og CD8⁺ T-celler. CD4⁺- og CD8+ T-cellepopulasjonene ble kvantifisert ved å samle den levedyktige CD3+-populasjonen (CD3+ [+]/7-AAD[−]) og måle uttrykket til (A) CD4+ og (B) CD8⁺. Alle tilstandene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Levedyktige aktiverte T-celler. Den levedyktige CD3⁺ -populasjonen ble også analysert for spesifikke aktiveringsmarkører som angitt i figurene ovenfor. (A) CD69 er en tidlig markør for aktivering; (B) CD25 er en midt-til-sen aktiveringsmarkør. Prosentandelene over feilfeltene representerer prosentandelen av levedyktige CD3⁺ -celler som uttrykker den respektive markøren. Alle tilstandene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Utmattede T-celler. Den levedyktige CD3⁺-populasjonen ble også analysert for utmattelsesmarkører (PD-1). (A) Totalt antall 7-AAD (−) / CD3 ⁺ (+) / PD-1 + (⁺) celler på dag 4 og dag 6 etter transduksjon. (B) Prosentandelen PD-1⁺-celler. På dag 4 og dag 6 hadde den aktiverte/transducerte prøvepopulasjonen ~25 % levedyktige CD3+/PD-1+-celler, mens kontrollprøvepopulasjonen hadde ~2 % levedyktige CD3+/PD-1⁺-celler. Merk at det startende / isolerte materialet hadde < ~ 15% levedyktige CD3 ⁺ / PD-1 ⁺ celler (post-isolasjon / pre-kultur data ikke vist). Alle tilstandene ble utført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den beskrevne protokollen tillater isolering av T-celler fra PBMC-prøver og aktivering av suspenderte T-celler i dyrkningsmedier med mikrobobler. Denne metoden er avhengig av funksjonaliserte mikrobobler hvis iboende oppdrift gir en unik mulighet til å introdusere kostimulerende signaler til celler og aktivere dem mens de er suspendert i et kulturmedium, og dermed redusere eksponeringen av de ekspanderende cellene til langvarig stimulering; slik overstimulering kan resultere i økt ekspresjon av T-celleutmattelsesmarkører og redusert terapeutisk effekt¹¹. Stimerte T-celler som er flytende festet til funksjonaliserte mikrobobler, produserer uberørte datterceller som faller til bunnen av cellekulturplaten for ekspansjon, noe som tillater en vekstperiode vekk fra de flytende stimuleringsfaktorene. Det har blitt detaljert i litteraturen hvordan langvarig eksponering av isolerte T-celler til stimuleringsfaktorer - som magnetiske perlebaserte protokoller¹² - kan påvirke utvidelsen og terapeutisk effekt ^6,7,11 negativt.

Siden denne rapporterte protokollen er avhengig av det positive utvalget av CD3⁺ -celler, er det avgjørende å fjerne subnatanten under boblecellelaget forsiktig, men grundig i isolasjonsfasen av denne protokollen. Dette sikrer at bare den positivt selekterte T-cellepopulasjonen blir ytterligere stimulert og belagt. Dette er også et viktig skritt for å bestemme antall celler valgt fra den startende PBMC-prøven, noe som er nødvendig for nøyaktige beregninger av kostimulering og plating.

Disse mikrobobleprotokollutviklingsaktivitetene for T-celleaktivering og utvidelse utnyttet et bredt spekter av markører under flowcytometrianalyse, noe som muliggjorde grundig karakterisering av den isolerte og stimulerte T-cellepopulasjonen for å vurdere kritiske T-celleparametere, inkludert aktivering, utmattelse og klonal ekspansjon. Sammenlignet med vanlige T-celleisolasjons- og stimuleringsteknologier, for eksempel magnetiske perlebaserte protokoller, tar denne mikrobobleprotokollen sikte på å minimere overstimuleringen av celler uten å ofre ekspansjonen og tilsvarende effektorfunksjonsevner til de isolerte T-cellene. Fremtidige anvendelser av denne mikrobobleteknikken vil inkludere ulike protokoller for T-celle positivt utvalg, kostimulering og påfølgende mikroboblecellekulturer for å møte en rekke arbeidsflytbehov for celleterapiforskning og produksjonssamfunn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000