Summary
Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.
Abstract
T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC'lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC'lerden CD3 + hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28'e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB'ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1'in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.
Introduction
Şu anda dünya çapında 500'den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır1. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır 3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir 6,7.
Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır 8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder7.
Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu
NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli CD3+ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar.
- Ticari olarak elde edilen 3 x 108 PBMC'leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Streptavidin mikrokabarcıklarını (SAMB'lar) üreticinin rapor ettiği SAMB konsantrasyonuna göre 0.5 (SAMB miktarı):1 (hücre miktarı) oranında ekleyin.
- Oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 20 rpm'de ticari bir uçtan uca (EOE) rotatör kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüj.
- Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler SAMB'lerle süspansiyonun en üstünde olacaktır. Kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. 9 inç cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi tabakasının altına tüpün altına yerleştirin, hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve yeni bir tüpe aktarın.
2. Pozitif seçilmiş T hücrelerinin birlikte uyarılması (aktivasyonu)
- Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını 1 mL'lik tam T hücre ortamında (veya istenen başka bir ortamda) yeniden askıya alın.
- Otomatik bir hücre sayacı kullanarak brightfield mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve kabarcık hücresi katmanında yakalanan hücre sayısını belirlemek için bu değeri başlangıç hücre numarasından çıkarın.
- Bu adımdan önce, konjuge anti-CD28 SAMB'leri oluşturmak için biyotinile anti-CD28 antikoru ticari SAMB'lerle en az 2 saat karıştırın. Konjugasyon için gereken anti-CD28 antikoru miktarını belirlemek için SAMBs üreticisine başvurun. Anti-CD28 konjuge SAMB'leri, 1.5 (anti-CD28 SAMB'ler):1 (hücreler) oranını kullanarak adım 2.1'den kaynaklanan kabarcık hücresi süspansiyonuna ekleyin.
- EOE rotasyonunu kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın ve ardından toplam hacmi, adım 2.2'de elde edilen hücre sayısına göre tam T hücre ortamı veya istenen başka bir ortam ile mL başına 2 milyon hücreye ayarlayın.
3. Hücre kültürü ortamında birlikte uyarılan hücrelerin genişlemesi
- Adım 2.4'ten 1 mL aktive edilmiş hücreyi, 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 M / mL konsantrasyonda dağıtın. 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe inkübe edin.
- 24 saat sonra, 0. günde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, genişlemeyi daha da teşvik etmek için 50 U / mL IL-2 ve 25 ng / M çözünür anti-CD3 (OKT3) ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmesine izin verin.
4. İsteğe bağlı: Aktive olmuş T hücrelerinin lentivirüs ile transdüksiyonu
NOT: Burada kullanılan yaklaşım Prommersberger ve ark.'dan uyarlanmıştır. 10.
- Lentivirüsü oda sıcaklığında çözün ve pipetleyerek, kısaca karıştırın.
- Orta natant, 600 μL'yi, şu anda kuyunun dibinde bulunan yavru hücrelere veya çözeltinin yüzeyinde kalan kabarcık tabakasına dokunmadan her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın.
- Viral transdüksiyonu arttırmak için kuyu başına 5 μg / mL hekzadimetrin bromür ekleyin. Lentiviral parçacıkları 3'lük bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) ekleyin (hücre başına lentiviral parçacıklar).
- Yavaş hızlanma ve yavaşlama için ara vermeden plakayı 800 x g ve 32 °C'de 45 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
- 4 saat sonra, her bir kuyucuğa 600 μL ticari olarak temin edilebilen, taze tam T hücresi ortamı ve 50 U / mL IL-2 ekleyin ve hücre plakasını T hücresi genişlemesi için 37 ° C'de nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.
5. T hücrelerinin genişlemesi (önceden transdüksiyon olsun veya olmasın)
- Her 2 günde bir, ortamın yarısını orta natanttan çıkarın, taze, tam T hücresi ortamı ile değiştirin ve 50 U / mL'lik bir konsantrasyonda IL-2 ekleyin.
- Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın. Hücre yoğunluğu 2 x 10 6-2.5 x 106 hücre / mL'yi aştığında, hücreleri daha büyük bir kaba aktarın ve 5 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.
6. T hücrelerinin toplanması ve akış sitometrisi
- Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Her bir oluğu 400 μL kalsiyum içermeyen ve magnezyum içermeyen DPBS (-/-) ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj.
- Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 μL ayırma tamponunda yeniden askıya alın.
- Aktivasyon ve tükenme antikoru / boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Boyama kokteyllerini aşağıdaki gibi hazırlayın - aktivasyon kokteyli: AF700-CD3, PE / Göz Kamaştırma-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; Tükenme kokteyli: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- 1 mL ayırma tamponu ekleyin ve yavaşça karıştırın. Fazla antikorları yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin.
- Hücre peletini 1 mL ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometri analizi için uygun bir kaba (örneğin, bir FACS tüpü, 96 delikli bir plaka, vb.) aktarın. Önerilen akış sitometri analizi geçit şeması Şekil 1'de detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T hücreleri satın alınan PBMC'lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC'ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmamasını sağladı. Şekil 2'deki deneysel taslağa göre, hücreler T hücre ortamında 2 x 106 hücre / mL'de tohumlandı ve ya el değmemiş / uyarılmamış ya da anti-CD3 (klon OKT3) ve anti-CD28 (klon 28.2) SAMB'lerle birlikte uyarıldı. Kültürde 48 saatlik stimülasyondan sonra, hücreler zsGreen için kodlanan lentiviral parçacık ile dönüştürüldü. Transdüksiyondan sonraki 4 gün ve 6 günde, hücreler AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (veya sırasıyla tükenme veya aktivasyon panellerinin kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak PE-CD69) ve 7-AAD kullanılarak görüntülendi, hasat edildi ve yüzey boyandı. ZsGreen transgeni FITC kanalında tespit edilebildi. Akış sitometrisi geçit yaklaşımı Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Kontrol örneği ile mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücreler arasında canlı T hücre sayılarında ve transgen-pozitif T hücrelerinde artışlar gözlenmiştir (Şekil 3). Mikrokabarcık örneklerinde artmış efektör hücre popülasyonları da gözlenmiştir (Şekil 4). Mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücre örnekleri arasında artmış aktivasyon ve tükenme belirteçlerini eksprese eden T hücreleri gözlenmiştir (Şekil 5 ve Şekil 6). Birlikte uyarılan örneklerin 4. ve 6. gün zaman noktaları arasında hücre genişlemesi gözlendi, bu da hücrelerin aktif, proliferatif olduğunu ve genişledikçe transgeni geçtiğini gösterdi.
Şekil 1: Örnek geçit şeması-el değmemiş/negatif kontrol örneği. Bekarlardan başlayarak, popülasyon hücreleri daha sonra SSC-A / FSC-A kullanılarak kapatıldı. Toplam CD3 + hücreleri dışarı kapatıldı, ardından popülasyonun yaşayabilirliğini belirlemek için 7-AAD kullanılarak canlı CD3 + geçidi izlendi. Sonraki tüm popülasyonlar ve hesaplamalar, alt popülasyon kapılarını gösteren oklar kullanılarak gösterildiği gibi, uygulanabilir 7-AAD (-) / CD3 + (+) popülasyonundan belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Deneysel zaman çizelgesine genel bakış. Protokolün günleri yukarıda belirtilmiştir ve transdüksiyon sonrası ilgili günler (D0-D6) aşağıdaki şekillerde kullanılmıştır. Hücreler seçim ve aktivasyondan hemen sonra kaplandı. Kontrol kuyuları bir mikrokabarcık negatif seçim protokolü kullanılarak üretildi. Kontrol T hücreleri, ko-stimülasyon ajanları almadı ve transdüksiyona uğramadı, ancak hücrelerin deney boyunca makul canlılığı koruyacak kadar sağlıklı tutulmasını sağlamak için IL-2 aldılar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transdüksiyon sonrası canlı ve başarılı bir şekilde dönüştürülmüş hücrelerin değerlendirilmesi . (A) Transdüksiyondan 4 gün ve 6 gün sonra canlı CD3 + hücreleri. Canlılık, popülasyonun 7-AAD (-) / CD3 + (+) hücreler üzerinde geçit ile ölçüldüğü akış sitometrisi analizi ile belirlendi. (B) rLV.EF1.zsGreen ile başarılı bir şekilde dönüştürülen hücrelerin sayısı, canlı 7-AAD (-) / CD3 + (+) popülasyonunun zsGreen (+) hücrelerine daha fazla kapılandığı akış sitometrisi ile belirlendi. Tüm koşullar üçlü olarak uygulandı (n = 3). Veriler ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Canlı CD4+ ve CD8+ T hücreleri. CD4 + ve CD8 + T hücre alt popülasyonları, uygulanabilir CD3 + popülasyonu (CD3 + [+] / 7-AAD [-]) üzerinde geçit yaparak ve (A) CD4 + ve (B) CD8 + ekspresyonunu ölçerek ölçüldü. Tüm koşullar üçlü olarak uygulandı (n = 3). Veriler ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Canlı aktive olmuş T hücreleri. Uygulanabilir CD3 + popülasyonu, yukarıdaki rakamlarda gösterildiği gibi spesifik aktivasyon belirteçleri için de analiz edildi. (A) CD69 aktivasyonun erken bir belirtecidir; (B) CD25 orta-geç aktivasyon belirtecidir. Hata çubuklarının üzerindeki yüzdeler, ilgili belirteci ifade eden canlı CD3+ hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Tüm koşullar üçlü olarak uygulandı (n = 3). Veriler ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tükenmiş T hücreleri. Uygulanabilir CD3 + popülasyonu da tükenme (PD-1) belirteçleri için analiz edildi. (A) Transdüksiyon sonrası 4. gün ve 6. günde 7-AAD(-)/CD3+(+)/PD-1+(+) hücrelerin toplam sayısı. (B) PD-1+ hücrelerinin yüzdesi. 4. gün ve 6. günde, aktive edilmiş / dönüştürülmüş örnek popülasyonu ~% 25 canlı CD3 + / PD-1 + hücrelerine sahipken, kontrol örneği popülasyonunda ~% 2 canlı CD3 + / PD-1 + hücreleri vardı. Not olarak, başlangıç / izole materyal <~% 15 uygulanabilir CD3 + / PD-1 + hücrelerine sahipti (izolasyon sonrası / kültür öncesi veriler gösterilmedi). Tüm koşullar üçlü olarak uygulandı (n = 3). Veriler ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunun artmasına ve terapötik etkinliğin azalmasına neden olabilir11. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara yüzdürücü bir şekilde bağlanan uyarılmış T hücreleri, genişleme için hücre kültürü plakasının dibine düşen el değmemiş yavru hücreler üretir ve bu da yüzdürücü stimülasyon faktörlerinden uzakta bir büyüme periyoduna izin verir. İzole edilmiş T hücrelerinin manyetik boncuk bazlı protokoller12 gibi stimülasyon faktörlerine uzun süre maruz kalmasının genişlemeyi ve terapötik etkinliği nasıl olumsuz etkileyebileceği literatürde ayrıntılı olarak açıklanmıştır 6,7,11.
Bu bildirilen protokol, CD3 + hücrelerinin pozitif seçimine dayandığından, bu protokolün izolasyon aşamasında kabarcık hücresi tabakasının altındaki subnatantı dikkatlice ama iyice çıkarmak çok önemlidir. Bu, sadece pozitif olarak seçilen T hücresi popülasyonunun daha fazla uyarılmasını ve kaplanmasını sağlar. Bu aynı zamanda, doğru ko-stimülasyon ve kaplama hesaplamaları için gerekli olan başlangıç PBMC örneğinden seçilen hücre sayısını belirlemek için önemli bir adımdır.
T hücresi aktivasyonu ve genişlemesi için bu mikrokabarcık protokolü geliştirme faaliyetleri, akış sitometrisi analizi sırasında çok çeşitli belirteçlerden yararlanarak, aktivasyon, tükenme ve klonal genişleme dahil olmak üzere kritik T hücresi parametrelerini değerlendirmek için izole edilmiş ve uyarılmış T hücresi popülasyonunun kapsamlı karakterizasyonuna izin vermiştir. Manyetik boncuk bazlı protokoller gibi yaygın olarak kullanılan T hücresi izolasyonu ve stimülasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, bu mikrokabarcık protokolü, izole edilmiş T hücrelerinin genişleme ve karşılık gelen efektör fonksiyon yeteneklerinden ödün vermeden hücrelerin aşırı uyarılmasını en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Bu mikrokabarcık tekniğinin gelecekteki uygulamaları, hücre terapisi araştırması ve üretim toplulukları için çeşitli iş akışı ihtiyaçlarını karşılamak için T hücresi pozitif seçimi, birlikte stimülasyon ve müteakip mikrokabarcık hücre kültürleri için çeşitli protokolleri içerecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar, gönderim sırasında, mikrokabarcık ayırma ürünleri üreten ve satan Akadeum Life Sciences'ın çalışanlarıdır.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
