Summary
单吻合十二指肠回肠旁路术 (SADI-S) 是一种新兴的减肥手术,具有重要的代谢作用。在本文中,我们提出了一种可靠且可重复的小鼠SADI-S模型。
Abstract
肥胖是世界范围内的主要健康问题。作为应对措施,减肥手术已经出现,通过限制性和吸收不良机制治疗肥胖及其相关合并症(例如糖尿病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎、心血管事件和癌症)。了解这些程序允许这种改进的机制通常需要将它们转移到动物身上,特别是在小鼠中,因为很容易产生转基因动物。最近,单吻合十二指肠回肠旁路术与袖状胃切除术(SADI-S)已成为一种同时使用限制性和吸收不良作用的手术,在严重肥胖的情况下被用作胃旁路术的替代方案。到目前为止,该程序与强大的代谢改善有关,这导致其在日常临床实践中的使用显着增加。然而,由于缺乏动物模型,这些代谢效应背后的机制研究得很少。在本文中,我们提出了一种可靠且可重复的小鼠SADI-S模型,特别关注围手术期管理。这种新的啮齿动物模型的描述和使用将有助于科学界更好地了解SADI-S诱导的分子,代谢和结构变化,并更好地确定临床实践的手术适应症。
Introduction
肥胖是一种新兴的流行情况,患病率日益增加,全世界每20名成年人中约有1人受到影响1。近年来,减肥手术已成为受影响成年人最有效的治疗选择,改善了体重减轻和代谢紊乱2,3,结果因所用外科手术的类型而异。
减肥手术的效果主要有两种机制:旨在增加饱腹感的限制(例如在袖状胃切除术(SG)中,80%的胃被切除)和吸收不良。在暗示限制和吸收不良的手术中,单吻合十二指肠回肠旁路术联合袖状胃切除术 (SADI-S) 已被提出作为 Roux-en-Y 胃旁路术 (RYGB) 的替代方案,其中在大约 20% 的患者中观察到体重恢复4,5。在这种技术中,袖状胃切除术与小肠重新排列有关,将其分为胆道和短公共肢体(占小肠总长度的三分之一)(图1A)。从技术上讲,SADI-S 比 RYGB 具有仅需要一次吻合的优势,可将手术时间缩短约 30%。此外,这种方法保留了幽门,有助于降低消化性溃疡疾病的风险并限制吻合口渗漏。SADI-S还与高代谢改善率有关,在过去几年中强烈支持其使用6,7。
由于代谢效应已成为减肥手术的基础,阐明其机制似乎至关重要。因此,使用动物模型进行减肥手术对于更好地了解其代谢作用以及所涉及的细胞和分子途径至关重要8。例如,这些模型有助于更好地了解SG或RYGB在受控环境中9后食物摄入量的变化,以及通过肠道屏障10,11研究葡萄糖或胆固醇通量;这些信息在临床研究中很少可用。这些知识可以帮助确定他们的最佳手术适应症。我们之前描述了SG和RYGB12的小鼠模型。然而,尽管SADI-S在临床实践中取得了有希望的结果,但它仅在大鼠13,14,15中开发和描述。然而,鉴于其遗传延展性,小鼠模型过去可用于研究此类程序的各种代谢效应16,17,18,并且SADI-S小鼠模型可用于评估SADI-S的影响,尽管技术困难。
在本文中,我们以可重复的方式描述了SADI-S程序在小鼠中的适应性(图1B)。特别注意围手术期护理的描述。
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Protocol
该协议已获得当地法国动物实验伦理委员会的批准(Comité d'éthique en expérimentation animale;参考CEEA-PdL n 06)。
1.术前准备
- 手术前3天在正常饮食中添加凝胶饮食食品。手术前6小时禁食小鼠。
- 在带氧气(1 L / min)的专用腔室中用5%异氟醚(1L / min)诱导麻醉。皮下注射丁丙诺啡(0.1mg / kg),阿莫西林(15mg / kg),甲氧氯普胺(1mg / kg),美洛昔康(1mg / kg)和铁(0.5mg / kg)。
- 使用电动剃须刀从剑突开始剃除小鼠腹部的前 2/3 部分。使用碘聚维酮溶液分两步消毒小鼠的腹部。
- 将鼠标仰卧放在覆盖有干净垫子的专用加热垫上。使用含有2%-2.5%异氟醚(0.4升/分钟)和氧气(0.4升/分钟)的鼻锥维持麻醉。使用捏脚趾测试来确认麻醉深度。
- 用无菌保鲜膜盖住鼠标。为了在小鼠的腹部应用过度伸展,请固定下爪并使用放置在小鼠背后放置的 1 mL 注射器或等效物。用未来切口的大小在无菌敷料中切开一个开口,并将其用作覆盖小鼠的操作区域。一般安装如图 2A所示。
- 手术前,请使用口罩、磨砂帽和消毒手套。使用消毒器械进行手术。
2. SADI-S 协议
- 中位剖腹手术
- 在双目显微镜(8倍放大倍率)下,通过将腹部皮肤从剑突打开到腹部中部,用剪刀或手术刀进行正中剖腹手术。确保剑突和肌肉腱膜层可见(图2B)。
注意:在做皮肤切口前5分钟在手术部位皮下注射布比卡因(3mg / kg)。 - 用剪刀在腹部肌肉之间沿着白线打开腹壁。小心不要进入胸腔(图2C)。
- 在双目显微镜(8倍放大倍率)下,通过将腹部皮肤从剑突打开到腹部中部,用剪刀或手术刀进行正中剖腹手术。确保剑突和肌肉腱膜层可见(图2B)。
- 十二指肠排除
- 使用湿润的棉签轻轻地从腹腔中移动十二指肠,以查看其前侧和后侧。定位主胆管,在小网膜和十二指肠后侧的双目显微镜下立即可见(图3A,黑色箭头)。
- 在胆管主管近端,在双目显微镜下观察十二指肠动脉之间的区域(图3A,B,蓝色虚线圆圈)。使用弯曲的微镊子从十二指肠的一侧到另一侧穿透该区域,并使用6-0不可吸收的缝合线在动脉之间进行十二指肠结扎(图3C-E)。注意不要结扎十二指肠动脉的分支。
- 袖状胃切除术
- 使用湿润的棉签和非创伤性钳夹从腹腔中动员胃。使用微型剪刀将胃与周围器官分开:分离大网膜,切开胃和脾之间的短胃动脉(脾动脉分支),以及连接胃和食道下部的脂肪瘤(图4A,B)。
- 使用微型剪刀,通过打开眼底进行5毫米的胃切开术,并使用棉签去除残留的食物(图4C,箭头)。用无菌盐水溶液(37°C)冲洗胃切开部位,以避免去除的胃内容物污染。
- 沿胃的较大曲率使用手术夹(中等大小,5.6 毫米),以排除大约 80% 的胃。两个剪辑就足够了。用微型剪刀剪掉排除的胃(图4D-G)。
- 通过从胃切除术的开始到结束进行运行缝合(8-0)来锚定手术夹以确定不渗透性(图4H)。
- 十二指肠回肠吻合术
- 在双目显微镜下,观察位于盲肠前的最后一个回肠环(图5A)。从最后一个回肠袢轻轻地将小肠从腹腔外移动。如图 5B所示布置小肠,使最后一个回肠袢位于左侧。使用先前尺寸的缝合绳,测量距最后一个回肠袢 10 cm(约为小肠总长度的 1/3);这将是未来吻合术的部位。
- 为了确保未来的胆道支从其左侧到达吻合部位,在未来吻合部位周围做一个大的小肠环。使用微型剪刀,在这一点上打开小肠进行4毫米的小肠切开术(图5C-E)。用无菌盐水溶液(37°C)冲洗肠切开部位以避免污染。
- 在幽门之后立即在胃和步骤2.2.2中进行的结扎术(图5F)之间对十二指肠的排除部分进行4mm肠切开术。放置可吸收的 5 mm x 5 mm 止血胶原蛋白敷料,以利于体内平衡。
- 使用不可吸收的8-0缝合,进行左右十二指肠回肠吻合术。从后侧吻合开始,然后是前侧吻合(图5G-I)。
- 腹腔闭合
- 显示腹腔内的小肠,使胆道支从腹部左上侧到达吻合口,总肢落到腹部下部。
注意:用约5mL无菌0.9%盐水溶液(37°C)灌洗腹部三次。然后,从腹部抽出液体以去除残留的胃肠道液体和消化的食物,以避免细菌感染和随后的腹部炎症。 - 使用1mL注射器将其直接施用腹腔,用500μL37°C盐水溶液重新水化小鼠。
- 使用单根 6-0 不可吸收的跑步缝合线关闭肌肉腱膜层。使用6-0不可吸收的分离缝合线关闭腹部皮肤(图5J,K)。
- 显示腹腔内的小肠,使胆道支从腹部左上侧到达吻合口,总肢落到腹部下部。
3. 一般术后护理
- 停止异氟醚后,让小鼠在用鼻罩充气的0.4 L / min O2 下的加热垫上醒来。当完全唤醒时,可以通过完全的电机回收来确保,将小鼠单独放在30°C培养箱中的笼子中。将小鼠在30°C培养箱中放置5天(气体或湿度没有特定条件)。
注意:笼子应事先加热。 - 允许手术后立即自由取水。将维生素补充剂,包括维生素B1,B9,B12和脂溶性维生素(A,D,E,K)添加到水(800mg / 180 mL水)中,直到方案结束。
- 从第 1 天到第 3 天,每天两次皮下注射丁丙诺啡 (0.1 mg/kg) 维持镇痛,之后每天一次直至第 5 天。继续每天一次皮下注射阿莫西林(15mg / kg),美洛昔康(1mg / kg)和甲氧氯普胺(1mg / kg),直到第3天。每天皮下注射一次铁(0.5 mg / kg),直到方案结束。
4. 一般测量和安乐死
- 每天称量小鼠,直到术后第5天。然后在第 7 天称重,然后每周称重。
- 要测量每日食物摄入量,每个笼子放置一只小鼠。放置已知重量的固体饮食,并测量24小时后剩余的固体饮食的重量。在第 3、4、5、7 天测量食物摄入量,然后每周测量一次。
- 在心脏左心房切口进行血液采样(500至600μL血液)后,在全身麻醉下(5%异氟醚(1L / min)与氧气(1L / min)皮下注射丁丙诺啡(0.1mg / kg)后,通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
- 使用需要 20 μL 血液的自动血液学分析仪测量血红蛋白浓度。
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Representative Results
学习曲线
该模型的学习曲线如图 6 所示。观察到手术时间逐渐减少,在4周的强化训练后达到约60分钟的手术(图6A)。术后5天生存率也随着时间的推移而改善,在常规练习期间达到77%(图6B)。最常见的死亡原因是吻合口瘘和导致胆道腹膜炎的传入袢综合征。我们在第一个月晚些时候用本手稿中描述的技术观察到没有死亡。值得注意的是,先前进行的实验没有用运行缝合线固定手术夹,导致三分之二的病例夹移,导致1例在31天时因小肠阻塞而死亡。这些结果强调,掌握这种模式需要强化训练。
一般参数
具有C57BL6 / J背景的小鼠被随机分配到SADI-S组(n = 9;5雄性,4雌性)和假对照组(n = 4;2雄性,2雌性)。在SADI-S小鼠和假小鼠之间,平均术前体重(27.9g±0.98g±28.5g2.4g)和年龄(14.8周±7.2周vs.18.7周±10.3周)没有显着差异。一只小鼠在术后第4天SADI-S后死于吻合口瘘,因此被排除在以下分析之外。与假对照小鼠相比,SADI-S小鼠从术后第四天开始体重减轻:21.7g±1.6g±0.7g(p = 0.0081)(图7A)。SADI-S小鼠的每日食物摄入量(14天)显着增加(4.4g±0.1±每天0.6g,p = 0.027)(图7B)。
手术后28天处死小鼠。SADI-S组中的一只小鼠没有表现出明显的体重减轻,似乎具有十二指肠透化。在其他7只小鼠中未观察到此类事件。如图 7C所示,补铁后SADI-S组的血红蛋白浓度与假对照小鼠无显著差异。
图 1:单吻合十二指肠回肠旁路术与袖状胃切除术 (SADI-S) 的表现形式。 (A)在人类中,十二指肠从主胆管近端切开。与残余十二指肠进行侧末十二指肠回肠吻合术,定义胆道肢(吻合术前)和公共肢体,其测量小肠总长度的三分之一(吻合后)。(B)在小鼠中,十二指肠通过结扎近端排除在主胆管附近,并进行外侧十二指肠回肠吻合术。该图是使用 BioRender.com 和施维雅医学艺术模板创建的,这些模板根据知识共享署名 3.0 未移植许可证进行许可;https://smart.servier.com/。请点击此处查看此图的大图。
图 2:SADI-S 的鼠标 安装。 (A) 常规安装。(B)从木突(胸骨基底)到腹部中部的皮肤开口。(C)肌肉腱膜层和腹膜开口。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:十二指肠排除。 (A)十二指肠后侧十二指肠动脉之间的缺血窗口(蓝色虚线圆圈),位于主胆管之前(黑色箭头)。(B)十二指肠前侧十二指肠动脉之间的缺血窗口(蓝色虚线圆圈)。(中,四)使用6-0不可吸收缝合线排除十二指肠。(E)排除十二指肠的最终视图。 请点击此处查看此图的大图。
图4:袖状胃切除术。 (A)更大的网膜切除。(B)切开胃短动脉。(C)初始胃切开术(蓝色箭头)。(D-G)使用两个手术夹切除胃心脏区域。(H)手术夹固定使用6-0不可吸收缝合线。请点击此处查看此图的大图。
图 5:十二指肠回肠吻合术。 (A)识别最后一个回肠袢(星号)。(B)从最后一个回肠袢(星号)到未来吻合部位(蓝色箭头)计数10厘米(小肠总长度的三分之一)。(中,四)围绕未来吻合部位的小肠旋转(蓝色箭头)。(E)回肠切开术。(F) 十二指肠切开术(白色箭头)。(G-I)十二指肠切开术(白色箭头)和回肠小肠切开术(蓝色箭头)之间的两层左右吻合术。(J)肌肉腱膜层闭合。(K) 皮肤闭合。请点击此处查看此图的大图。
图6:SADI-S程序学习曲线 。 (A)训练对手术持续时间的影响。数据以SEM±平均值表示。 (B)训练对五天生存的影响。数据以百分比表示。 请点击此处查看此图的大图。
图7:SADI-S后的一般参数。 (A)术后体重,(B)第14天测量24小时的食物摄入量,以及(C)SADI-S和假对照小鼠的血红蛋白浓度。数据以平均值表示±SEM。 使用双向方差分析(使用Sidak多重比较检验)或曼-惠特尼非参数检验进行统计比较。* p < 0.05;** p < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
减肥手术的技术不断发展,似乎是目前肥胖和相关代谢合并症最有效的治疗方法3,19,20。SADI-S手术于2007年首次描述4,是一种有前途的手术,与其他吸收不良手术相比,具有更大的代谢作用。动物模型,特别是允许快速生成转基因模型的小鼠,迫切需要充分了解这些改进背后的机制。在这里,我们描述了小鼠SADI-S的可靠且可复制的模型。
SADI-S手术的第一个关键步骤是排除十二指肠,只允许胆汁和胰腺分泌物进入十二指肠和小肠的前三分之二。在人类中,十二指肠被切开,允许端对侧十二指肠回肠吻合术 4.在Montana等人描述的大鼠SADI-S模型中15,在少数情况下,通过不可吸收的缝合线或手术钳夹排除十二指肠是不完美的,导致十二指肠再透化(即,将推注重新引入原始消化道)。然而,十二指肠的一部分随后进行端对侧吻合在小鼠中很难转位,导致我们更喜欢十二指肠结扎术。事实上,如果十二指肠完全横断,十二指肠血管的短长度限制了十二指肠的活动,使得难以进行末端-外侧吻合术。最初的实验(数据未显示)显示死亡率很高,即使有训练有素和熟练的实验人员也是如此。本研究仅观察到一例再透化病例。在此步骤中必须特别注意十二指肠动脉。十二指肠的环形血管断流在所有情况下都会导致死亡,但可以预期小鼠会从远端血管结扎引起的小的血管化区域恢复。小鼠十二指肠血管化的解剖学变异性使我们无法描述恒定的定位来执行这种排除。然而,幽门后十二指肠必须有 0.5 cm 才能进行端对侧吻合。
进行吻合术时的另一个关键步骤是显示肠道,使胆道支从左侧到达十二指肠回肠吻合部位。否则,食物会阻碍胆汁流动,导致胆道肢扩张,胆汁扩散到腹腔,小鼠在术后第2天左右死于胆汁腹膜炎。这种类似于传入环综合征21 的情况可以通过以回肠吻合区为中心的小肠环来预防。这是必要的,因为与人类相反,在小鼠22中80%的病例中,盲肠位于腹部左侧。
在人类中,公共肢体的尺寸约为250厘米以限制营养不良,这相当于小肠总长度的约三分之一23。在手术之前,我们在类似的喂养条件下(食物饮食下的C57BL6 / J)测量了小鼠模型小肠的总长度,以确定共同肢体的大小。由于不同遗传背景或不同喂养条件的小鼠之间的小肠长度可能有所不同,我们强烈建议未来的外科医生进行试点研究以测量肠道大小。对于具有相同背景的每只小鼠,应使用相同的大小,因为应避免在手术期间系统地将整个肠道外部化以进行完整测量(因为脱水、体温过低和内脏损伤的风险增加)。
袖状胃切除术是原始SADI-S技术的一部分,除了吸收不良外,还允许限制4。文献12,24,25,26中提供了几种小鼠袖状胃切除术模型。使用手术夹而不是单独的缝合线可以显着增加时间24并减少失血,这是手术成功的两个必要条件。使用 8-0 锚固手术夹在我们的实验中,跑步缝合在所有情况下都防止了胃夹迁移。通过去除心脏区域,该技术可以去除约80%的胃12。然而,在该模型中,与假对照小鼠相比,SADI-S与过度喂养有关,旨在(可能)补偿由肠道衍生引起的吸收不良。其他模型表明,从长远来看,小鼠袖状胃切除术优先改变食物摄入行为,而不是每天摄入食物的绝对数量11,26。这种有限的限制效应是这种模式的局限性。
该协议具有75%的存活率。值得注意的是,5天生存期是长期生存的有力预测指标,因为在我们的实验中没有发生晚期死亡。未观察到吻合口狭窄。然而,要达到这一存活率,需要由专门从事动物手术的实验者进行至少 3 周的强化显微外科培训;随着时间的推移,生存率的增加与手术时间的减少相关。围手术期护理是该技术成功的关键之一。除了基于抗生素的系统治疗外,还需要严格的镇痛方案,并且必须逐步引入营养,仅使用凝胶饮食 3 天。如前所述12,在吸收不良手术后,必须补充维生素B1,B9,B12和脂溶性维生素(A,D,E,K),以及补铁,这在我们的实验中预防了贫血,但尚未描述SADI-S模型15。
总之,SADI-S可以在小鼠中成功转座,只需对其在人类中的描述进行一些修改。这种技术需要训练和严格的围手术期方案。与以前的模型相比,将这种手术应用于小鼠可以更好地了解这种有前途的程序的强大代谢作用的机制,并有助于更好地定义其手术适应症。
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Disclosures
克莱尔·布兰查德(Claire Blanchard)已获得美敦力(Medtronic)的报酬,以提供临床浸入式课程。
Acknowledgments
我们感谢Ethicon(强生外科技术)慷慨地提供缝合线和手术夹。这项工作得到了NExT人才项目,南特大学,南特CHU的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agagani needle 26 G | Terumo | 050101B | 26 G needle |
Betadine dermique | Pharma-gdd | 3300931499787 | Povidone solution |
Betadine scrub | Pharma-gdd | 3400931499787 | Povidone solution |
Binocular microscope | Optika Microscopes Italy | SZN-9 | Binocular stereomicroscope |
Buprecare | Animalcare | 3760087151244 | Buprenorphin |
Castroviejo, straight 9 cm | F.S.T | 12060-02 | Micro scissors |
Castroviejo, straight 9 cm | F.S.T | 12060-02 | Needle holder |
Chlorure de sodium Fresenius 0.9% | Fresenius Kabi | BE182743 | NaCl 0.9% |
Clamoxyl | Med'vet | 5414736007496 | Amoxicilline |
Cotton buds | Comed | 2510805 | Cotton swabs |
Element HT5 | Scilvet | Element HT5 | Automated hematology analyzer |
Emeprid | CEVA | 3411111914365 | Metoclopramid |
Extra Fine Graefe Forceps, curved (tip width: 0.5 mm) | F.S.T | 11152-10 | Surgical forceps |
Extra Fine Graefe Forceps, straight (tip width: 0.5 mm) | F.S.T | 11150-10 | Surgical forceps |
Fercobsang | Vetoprice | QB03AE04 | Iron, multivitamins and minerals |
Forane | Baxter | 1001936060 | Isoflurane |
Graefe forceps, straight (tip width: 0.8 mm) | F.S.T | 11050-10 | Forceps |
Graphpad Prism version 8.0 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0 | Software for statistical analysis |
Heat pad | Intellibio innovation | A-2101-00300 | Heat pad |
Incubator | Bioconcept Technologies | Manufactured on demand | Incubator |
Lighting | Optika Microscopes Italy | CL-30 | Lighting for microscopy |
Ocrygel | Med'vet | 3700454505621 | Carboptol 980 NF |
Pangen 2.5 cm x 3.5 cm | Urgovet | A02978 | Haemostatic collagen compress |
Prolene 6/0 | B.Braun | 3097915 | Optilene 6/0 (0.7 metric) 75 cm 2XDR13 CV2 RCP, suture cord |
Prolene 8/0 | Ethicon | 8732 | 2 x BV175-6 MP, 3/8 Circle, 8 mm, suture cord |
Scissors | F.S.T | 146168-09 | Surgical scissors |
Sterile compresses | Laboartoire Sylamed | 211S05-50 | Non-woven sterile compressed |
Terumo Syringe | Terumo | 50828 | 1 mL syringe |
Titanium hemostatic clip | Péters Surgical | B2180-1 | Surgical clip |
Vannas Wolff | F.S.T | 15009-08 | Micro scissors |
Vita Rongeur | Virbac | 3597133087611 | Vitamin supplementation |
Vitaltec stainless | Péters Surgical | PB 220-EB Medium | Surgical clip applier |
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