Summary
이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.
Abstract
형광 현미경을 사용한 타임랩스 이미징을 통해 세포 및 세포하 수준에서 성장 및 발달의 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 일반적으로 장기간에 걸친 관찰을 위해이 기술은 형광 단백질의 변형이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전자 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 사용할 수 없습니다. 이 원고는 이끼 Physcomitrium patens에서 개발 된 calcofluor 염료 (식물 세포벽의 셀룰로오스를 염색)를 사용하여 3 일 동안 세포벽 역학의 3D 타임 랩스 이미징을위한 프로토콜을 제시합니다. 세포벽의 칼코플루오르 염료 신호는 안정적이며 명백한 감쇠 없이 1주일 동안 지속될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 ggb 돌연변이 체 (단백질 제라 닐 제라 닐 트랜스퍼 라제 -I 베타 서브 유닛이 녹아웃 됨)에서 세포의 분리가 조절되지 않은 세포 확장 및 세포벽 무결성 결함으로 인해 발생하는 것으로 나타났습니다. 또한, 칼코 플루오르 염색의 패턴은 시간이 지남에 따라 변합니다. 덜 강하게 염색된 영역은 야생형의 미래 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있습니다. 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.
Introduction
식물 세포벽은 세포 확장 및 발달 동안 역동적 인 변화를 겪습니다 1,2,3. 세포벽 무결성을 유지하는 것은 성장 및 발달 중 식물 세포 접착과 환경 신호에 대한 반응에 매우 중요합니다. 장기간에 걸쳐 살아있는 세포의 세포벽 역학을 시각화하는 것이 개발 및 환경 변화에 적응하는 동안 세포 접착이 유지되는 방법을 이해하는 데 중요하지만 세포벽 역학을 직접 관찰하는 현재의 방법은 여전히 어렵습니다.
세포 변화의 타임 랩스 이미징은 고해상도 형광 현미경 4,5,6,7을 사용하여 유기체의 유익한 발달 역학을 제공 할 수 있습니다. 타임랩스 3D 이미징은 성장 및 발달 중 세포 모양의 동적 변화를 연구할 수 있는 많은 잠재력을 가지고 있지만, 이 기술은 일반적으로 형광 단백질 4,5,6,7의 형질전환이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전 적 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 어렵습니다. 대안으로, 세포 성분에 부착되는 형광 염료는 오랫동안 이용 가능해왔다. 형광 염료는 특정 파장의 빛으로 조사 한 후 형광등을 방출 할 수 있습니다. 일반적인 예로는 Edu, DAPI, PI, FM4-64 및 칼코플루오르 화이트 8,9,10이 있습니다. 그러나 한 가지 주요 단점은 이러한 염료가 일반적으로 고정 조직 또는 짧은 실험에만 사용될 수 있다는 것인데, 이는 부분적으로 세포 8,9,10에 대한 피해로 인한 것입니다.
여기에 제시된 프로토콜을 사용하면 이끼 P. patens의 타임 랩스 실험 중에 칼코플루오르 화이트가 배지 내에서 혼합될 때 칼코플루오르 신호가 안정적입니다. 이 방법을 사용하여 3-D 타임 랩스 이미징을 사용하여 ggb 돌연변이 체에서 세포의 분리를 3 일 기간 동안 관찰했습니다3 (그림 1). 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.
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Protocol
참고: 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에서 사용할 솔루션 목록은 표 1 을 참조하십시오.
1. 유리 바닥 접시 용 식물 준비
- 성장 챔버에서 25°C에서 7일 동안 일정한 백색광(~50μmol m-2s-1) 하에 13cm 페트리 접시의 BCDAT 한천 배지에서 이끼 양성자 조직을 성장시킵니다.
- 필터-백색의 칼코플루오로를 멸균하고 사용 전까지 4°C에서 보관한다. 시약은 몇 달 동안 안정적입니다.
- 7일 된 이끼 조직을 멸균수 20μL가 포함된 1.5mL 마이크로튜브에 분산시킵니다. 이끼 양성자 조직이 물에 작은 조각으로 충분히 분산되어 있는지 확인하십시오. 야생형 (WT)의 경우 포셉을 사용하여 양성자를 분리하십시오. GGB 돌연변이의 경우 P-1000 피펫을 사용하십시오.
- 멸균된 칼코플루오르 화이트 10μL를 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 염색을 위해 마이크로튜브를 후드에 2분 동안 똑바로 세워 둡니다.
- 염색 직후, P-1000 피펫으로 5회 피펫팅하여 0.5%(w/v) 포도당과 0.4%(w/v) 젤란 검이 보충된 BCDAT 배지가 포함된 냉각된 BCDATG 200μL와 식물을 혼합합니다.
알림: 식물에 스트레스를주지 않도록 BCDATG 매체가 충분히 냉각되었는지 확인하십시오 (매체가 응고되기 직전). - 식물과 BCDATG 배지를 포함하는 혼합물을 직경 27 mm 유리 베이스 접시에 옮깁니다. 세포를 혼합하기 위한 BCDATG의 부피가 200μL 이하이고 샘플이 있는 BCDATG 200μL가 7mm 유리 바닥 접시 표면에 고르게 분포되어 박막 층을 생성하여 샘플이 이미징 중 목표 작동 거리 내에 있는지 확인합니다.
- 실온에서 2분간 고형화시킨 후, 냉각된 BCDATG 3mL로 얇게 층을 덮고 10분간 그대로 두어 다시 고형화시킨다.
알림: 오염을 방지하기 위해 1.2-1.5단계를 멸균 후드에서 수행해야 합니다. - 접시 바닥에 평행 및 수직 방향으로 각각 9 개의 선을 그립니다 (그림 2). 행에는 a에서 h까지의 문자로 표시하고 열에는 1에서 8까지의 숫자로 표시합니다. 위, 아래, 오른쪽, 중간 및 왼쪽을 사용하여 각 사각형 내의 위치를 표시합니다. 예를 들어, 식물이 두 번째 행과 여섯 번째 열의 사각형에 있고 사각형의 왼쪽 상단에 위치하면이 식물에 "b6_upper_left"라는 이름이 지정됩니다.
- 식물을 함유하는 유리 바닥 접시를 성장 챔버에서 25°C에서 5일 동안 적색광 하에 전배양한 다음, 최대 3일 동안 매일 타임랩스 이미징을 실시하기 전에 1-2일 동안 백색광 하에서 전처리한다. WT의 경우, 양성자 종착의 광변성 반응을 유도하기 위해 5 일 동안 위로부터의 약한 적색광 (0.5 μmol m-2s-1)에서 식물을 전배양하여 식물이 접시(11)의 바닥에 부착 될 수 있도록한다.
알림: 약한 적색광은 3mm 두께의 빨간색 아크릴 플라스틱 필터를 통해 백색광을 내광성 상자에 통과시켜 제공됩니다. ggb 돌연변이체의 경우, ggb 돌연변이체는 광변성 반응을 갖지 않기 때문에 적색광에서 전배양하는 것은 선택 사항입니다3.
2. 이미징 및 3D 재구성
- 식물이 들어 있는 유리 바닥 접시를 도립 컨포칼 현미경의 스테이지 위에 놓고 유리 바닥이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 20x 대물 렌즈로 칼코플루오르를 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 405nm 레이저, 핀홀 1.0, HV 게인 100, 오프셋 배경 조정 0, 레이저 출력 5%-7%, 스캔 크기 1,024 x 1,024, 스캔 속도 1/2 프레임/초로 이미지를 촬영합니다. 스텝 크기가 1.0 μm인 17-30 z-시리즈 광학 섹션을 수집합니다. 1.6단계의 코드(예: "b6_upper_left-day0")를 사용하여 이미지 이름을 지정하고 저장합니다.
- [획득]에서 DAPI 채널을 선택하고 ND 획득에서 Z 상자를 선택합니다. Z 스택의 하한과 상한을 설정하려면 상단 및 하단 버튼을 클릭합니다.
- 3차원 이미지를 재구성하려면 .nd2 파일(그림 3A, 재료 표 참조)을 열고 볼륨(그림 3B)을 클릭합니다.
3. 다른 시점에서 동일한 식물 이미징
- 각 이미징 후 유리 베이스 접시를 성장 챔버에 다시 넣습니다.
- 이미징 및 3D 재구성을 위해 2.1단계부터 반복합니다.
참고 : 동일한 식물을 찾으려면 1.6 단계에서 언급 한 코드를 사용하고 식물의 나이에 따라 "b6_upper_left-day1"또는 "b6_upper_left-day2"라는 이름을 지정하십시오.
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Representative Results
이 방법을 사용하면 야생형 및 ggb 돌연변이체에서 발달하는 동안 세포벽 역학을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 결과는 세포벽이 덜 두꺼워지는 영역이 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있어 야생형에서 확장/분지 부위를 예측할 수 있음을 보여주었습니다(그림 1A). ggb 돌연변이체에서 세포벽의 표면은 제어되지 않은 세포 확장3 으로 인해 발달 중에 찢어졌습니다(그림 1B). 또한, ggb 돌연변이체(오래된 셀룰로오스)의 깨진 표면의 염색 신호는 깨진 세포벽 표면 아래의 세포 표면(더 어린 셀룰로오스)보다 강합니다.
그림 1: 이끼 발달의 3D 시계열 . (A,B) 횡벽의 동적 변화는 WT (A) 및 ggb 돌연변이체 (B)에서 칼코 플루오르 백색 염색 (셀룰로오스를 염색 함)에 의해 나타났다. ggb 돌연변이체(B)의 경우 각 이미지 아래의 흰색 점선은 확장 세포의 부서진 표면 세포벽을 나타내고 주황색 선은 ggb의 세포벽 표면 아래에 있는 세포를 나타냅니다. 패널 B 는3의 허가를 받아 재인쇄됩니다. calcofluor 백색 신호의 차이는 세포의 표면 위치에서 감지 될 수 있으며 덜 조밀 한 염색 영역 (화살촉)은 세포 확장 / 분지 부위와 상관 관계가 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : d = 일; WT = 야생형; ggb = 제라닐제라닐트랜스퍼라제-I 베타. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 식물의 마킹 위치. 접시의 바닥에는 사각형의 위치를 표시하기 위해 각각 9 개의 선이 평행하고 수직 인 방향으로 그려졌습니다. 문자 a에서 h는 행을 표시하는 데 사용되었으며 숫자 1에서 8은 열을 표시하는 데 사용되었습니다. 위, 아래, 오른쪽, 중간 및 왼쪽은 각 사각형 내의 위치를 표시하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 식물 (녹색 점으로 표시)이 두 번째 행과 여섯 번째 열의 사각형에 있고 왼쪽 상단에 위치하면 식물의 이름이 b6_upper_left로 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: nd2 z-stack 파일을 사용한 3차원 이미지 재구성. (ᅡ) NIS 요소 뷰어에서 nd2 파일을 엽니다. LUT(원)를 클릭하여 이미지의 대비와 밝기를 조정하고 볼륨(사각형)을 클릭하여 3D 이미지를 재구성합니다. (B) A에서 재구성 된 3-D 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
타임랩스 3D 재구성 또는 4D 이미징은 발달 과정에서 세포 형태의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜에서, 배지에서 칼코 플루오르 화이트를 혼합함으로써, 3-D 세포 형태의 역학이 이끼 P. patens에서 관찰 될 수있다. 이 방법을 사용하여 ggb 돌연변이 체의 세포벽 표면이 발달 중에 찢어지는 것을 관찰했습니다3. 또한, 세포벽의 감소된 농축은 야생형의 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있어, 확장/분지 부위의 예측을 가능하게 한다. 또한, calcofluor white는 마이크로스피어와 같은 다른 염료와 함께 사용될 수 있기 때문에, 세포 확장에 대한 추가적인 정보가 관찰될 수 있다3.
칼코플루오르 염료가 분자 표적에 영향을 미치거나 손상시키지 않고 식물에 며칠 동안 결합할 수 있는 방법을 설명할 수 있는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 낮은 작업 농도 (BCDATG 배지 200μL 중 10μL 또는 5 %)는 모스 프로톤 마타가 영향을받지 않도록 충분히 낮을 수 있습니다. 둘째, 칼코플루오르는 셀룰로오스의 성숙 단계를 염색할 수 있는데, 그 이유는 염색 신호가 정점 세포(젊은 조직)의 정점 영역보다 야생형(오래된 조직)의 기저부에서 훨씬 강하고 ggb 돌연변이체의 부서진 세포벽 표면(오래된 셀룰로오스)이 깨진 세포벽 표면 아래의 세포(더 어린 셀룰로오스)보다 강하기 때문입니다.
이 프로토콜은 구조가 단순한 이끼 조직에 사용되었습니다. 현재 프로토콜은 꽃 피는 식물의 뿌리털 및 트리코메와 같은 간단한 구조를 가진 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 그러나 calcofluor 백색 염색이 줄기와 같이 더 많은 세포층을 가진 다른 시스템에서 작동하는지 여부는 여전히 남아 있습니다. 또한, 칼코플루오르 화이트가 배지와 혼합되기 때문에, 염색될 조직은 배지 내에 침지되어야 한다. 따라서 이 프로토콜을 다른 시스템에 적용하려면 최적화가 필요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자들은 컨포칼 현미경에 대한 도움을 준 루이빌 대학의 Soucy Patricia 박사와 Betty Nunn 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (MPR에 1456884)과 국립 과학 재단 협력 협정 (MPR에 1849213)에 의해 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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