Summary
Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol til at afbilde 3D-cellevægsdynamikken i levende mosvæv, hvilket muliggør visualisering af frigørelse af cellevægge i ggb-mutanter og fortykkelse af cellevægsmønstre i vildtypen under udvikling over en lang periode.
Abstract
Time-lapse billeddannelse med fluorescensmikroskopi tillader observation af de dynamiske ændringer i vækst og udvikling på cellulære og subcellulære niveauer. Generelt kræver teknikken til observationer over en lang periode transformation af et fluorescerende protein; Men for de fleste systemer er genetisk transformation enten tidskrævende eller teknisk utilgængelig. Dette manuskript præsenterer en protokol for 3-D time-lapse billeddannelse af cellevægsdynamik over en 3-dages periode ved hjælp af calcofluorfarvestof (som pletter cellulose i plantecellevæggen), udviklet i mos Physcomitrium patens. Calcofluorfarvestofsignalet fra cellevæggen er stabilt og kan vare i 1 uge uden åbenlyst henfald. Ved hjælp af denne metode har det vist sig, at frigørelsen af celler i ggb-mutanter (hvor proteinet geranylgeranyltransferase-I beta-underenhed er slået ud) skyldes ureguleret celleudvidelse og cellevægintegritetsdefekter. Desuden ændres mønstrene for calcofluorfarvning over tid; Mindre intenst farvede områder korrelerer med de fremtidige celleudvidelses- / forgreningssteder i vildtypen. Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.
Introduction
Plantecellevægge gennemgår dynamiske ændringer under celleudvidelse og udvikling 1,2,3. Opretholdelse af cellevægsintegritet er afgørende for plantecelleadhæsion under vækst og udvikling samt for reaktionen på miljøsignaler. Selvom visualisering af cellevægsdynamik i levende celler over en lang periode er afgørende for at forstå, hvordan celleadhæsion opretholdes under udvikling og tilpasning til miljøændringer, er de nuværende metoder til direkte observation af cellevægsdynamik stadig udfordrende.
Time-lapse billeddannelse af cellulære ændringer kan give informativ udviklingsdynamik af en organisme ved hjælp af et fluorescensmikroskop med høj opløsning 4,5,6,7. Mens time-lapse 3D-billeddannelse har et stort potentiale for at studere dynamiske ændringer af celleform under vækst og udvikling, kræver teknikken normalt transformation af et fluorescerende protein 4,5,6,7. Men for de fleste systemer er genetiske transformationer enten tidskrævende eller teknisk udfordrende. Som et alternativ har fluorescerende farvestoffer, der fastgøres til cellulære komponenter, længe været tilgængelige. De fluorescerende farvestoffer kan udsende fluorescerende lys efter bestråling med lys med en bestemt bølgelængde. Almindelige eksempler er Edu, DAPI, PI, FM4-64 og calcofluor hvid 8,9,10. En stor ulempe er imidlertid, at disse farvestoffer typisk kun kan bruges i fast væv eller til korte forsøg, delvis på grund af den skade, de forårsager på cellen 8,9,10.
Med protokollen præsenteret her er calcofluorsignaler stabile, når calcofluor hvid blandes i mediet under time-lapse-eksperimenter i mos P. patens. Ved hjælp af denne metode blev frigørelsen af celler i ggb-mutanter ved hjælp af 3-D time-lapse-billeddannelse observeret over en 3-dages periode3 (figur 1). Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for listen over materialer og udstyr og tabel 1 for listen over løsninger, der skal anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af planter til glasbundsfade
- Mosprotonemalt væv dyrkes i BCDAT agarmedium i en 13 cm petriskål under konstant hvidt lys (~50 μmol m-2 s-1) i 7 dage ved 25 °C i vækstkammeret.
- Calcofluorhviden filtreres og opbevares ved 4 °C indtil brug. Reagenset er stabilt i flere måneder.
- Spred det 7 dage gamle mosvæv i et 1,5 ml mikrorør indeholdende 20 μL steriliseret vand. Sørg for, at mosprotonemalvævet er tilstrækkeligt spredt som små stykker i vandet. For vildtype (WT) skal du bruge tang til at adskille protonemata; til ggb-mutanten skal du bruge en P-1000-pipette.
- Tilsæt 10 μL steriliseret calcofluor white i 1,5 ml mikrorøret og lad mikrorøret stå lodret i emhætten i 2 minutter til farvning.
- Umiddelbart efter farvning blandes planterne med 200 μL afkølet BCDATG, indeholdende BCDAT-medium suppleret med 0,5% (w / v) glucose og 0,4% (w / v) gellangummi ved pipettering fem gange med en P-1000 pipette.
BEMÆRK: Sørg for, at BCDATG-mediet er afkølet nok (lige før mediet størkner) for at undgå at stresse planterne. - Blandingen indeholdende planterne og BCDATG-substratet overføres til en glasbundskål med en diameter på 27 mm. Sørg for, at volumenet af BCDATG til blanding af cellerne ikke er mere end 200 μL, og at de 200 μL BCDATG med prøver fordeles jævnt på overfladen af 7 mm glasbundskålen for at producere et tyndt lag film, så prøverne er inden for den objektive arbejdsafstand under billeddannelsen.
- Efter størkning i 2 minutter ved stuetemperatur dækkes det tynde lag med 3 ml afkølet BCDATG og lad det sætte sig i 10 minutter for at størkne igen.
BEMÆRK: Sørg for, at trin 1.2-1.5 udføres i en steril hætte for at undgå kontaminering. - På bunden af skålen tegnes ni linjer hver i parallel og vinkelret retning (figur 2). Marker rækkerne med tegn fra a til h, og markér kolonnerne med tal fra 1 til 8. Brug øverste, nederste, højre, midterste og venstre til at markere positionerne i hver firkant. For eksempel, hvis en plante er i en firkant i anden række og den sjette kolonne og er placeret øverst til venstre på pladsen, får denne plante navnet "b6_upper_left".
- Forkultur glasbundskålen med planterne under rødt lys i 5 dage ved 25 °C i vækstkammeret og derefter under hvidt lys i 1-2 dage, før den udsættes for time-lapse-billeddannelse hver dag i op til 3 dage. For WT skal du fordyrke planterne i svagt rødt lys (0,5 μmol m-2 s-1) fra ovenstående i 5 dage for at fremkalde protonemataens fototrope respons, så planterne kan fastgøres til bunden af skålene11.
BEMÆRK: Det svage røde lys tilvejebringes ved at føre et hvidt lys gennem et 3 mm tykt rødt akrylplastfilter ind i lystætte kasser. For ggb-mutanter er prækultivering i rødt lys valgfri, da ggb-mutanterne ikke har et fototropisk respons3.
2. Billeddannelse og 3D-rekonstruktion
- Placer glasbundskålen, der indeholder planter, på scenen i et omvendt konfokalmikroskop med glasbunden vendt mod målet. Brug et konfokalmikroskop til visualisering af calcofluor med en 20x objektiv linse. Tag billeder med 405 nm-laseren, pinhullet ved 1,0, HV-forstærkning ved 100, forskydningsbaggrundsjustering ved 0, lasereffekt ved 5% -7%, en scanningsstørrelse på 1.024 x 1.024 og en scanningshastighed på 1/2 billede/s. Saml 17-30 z-serie optiske sektioner med en trinstørrelse på 1,0 μm. Navngiv billederne ved hjælp af koden i trin 1.6, f.eks. "b6_upper_left-day0", og gem.
- Vælg DAPI-kanalen i Anskaffelse , og markér afkrydsningsfeltet Z i ND-anskaffelse. Hvis du vil indstille de nedre og øvre grænser for Z-stakken, skal du klikke på knapperne Top og Bund .
- For at rekonstruere 3D-billederne skal du åbne .nd2-filen (figur 3A; se materialetabellen) og klikke på diskenheden (figur 3B).
3. Billeddannelse af de samme planter på forskellige tidspunkter
- Efter hver billeddannelse sættes glasbundskålen tilbage i vækstkammeret.
- Gentag fra trin 2.1 for billedbehandling og 3D-rekonstruktion.
BEMÆRK: For at finde de samme planter skal du bruge koden nævnt i trin 1.6 og give navnet "b6_upper_left-day1" eller "b6_upper_left-day2" i henhold til planternes alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode tillader observation af cellevægsdynamik under udvikling i vildtype- og ggb-mutanter (figur 1). Resultaterne viste, at områder med mindre fortykkelse af cellevæggen korrelerer med celleekspansions- / forgreningsstederne, hvilket giver mulighed for forudsigelse af ekspansions- / forgreningssteder i vildtypen (figur 1A). Overfladen af cellevæggene i ggb-mutanter blev revet fra hinanden under udviklingen på grund af ukontrolleret celleudvidelse3 (figur 1B). Desuden er farvningssignalet for den ødelagte overflade af ggb-mutanter (som er ældre cellulose) stærkere end celleoverfladen (som er yngre cellulose) under den ødelagte cellevægoverflade.
Figur 1: 3D-tidsserier af mosudvikling. (A,B) Dynamiske ændringer i tværvægge blev vist ved calcofluor hvid farvning (som pletter cellulose) i WT (A) og ggb mutanter (B). For ggb-mutanter (B) angiver hvide streglinjer under hvert billede de ødelagte overfladecellevægge på de ekspanderende celler, og orange linjer angiver cellerne under cellevægsoverfladen i ggb. Panel B er genoptrykt med tilladelse fra3. Bemærk, at forskellene i calcofluor hvidt signal kan detekteres på cellernes overfladepositioner, og mindre tætte farvningsområder (pilespidser) er korreleret med celleekspansions- / forgreningsstederne. Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: d = dage; WT = vildtype; ggb = geranylgeranyltransferase-I beta. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Markering af planternes placering. På bunden af skålen blev ni linjer hver tegnet i parallelle og vinkelrette retninger for at markere placeringen af firkanter. Tegn a til h blev brugt til markering af rækker, og tallene 1 til 8 blev brugt til markering af kolonner. Øvre, nederste, højre, midterste og venstre blev brugt til at markere positioner inden for hver firkant. For eksempel, hvis en plante (betegnet med en grøn prik) var placeret i en firkant i anden række og den sjette kolonne og placeret i øverste venstre del, blev planten navngivet b6_upper_left. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Rekonstruktion af 3D-billeder ved hjælp af en nd2 z-stack-fil . (A) Åbn en nd2-fil i NIS-elementernes fremviser. Klik på LUT'er (cirkel) for at justere kontrasten og lysstyrken i billeder, og klik på Lydstyrke (firkant) for at rekonstruere 3D-billedet. (B) Rekonstrueret 3D-billede fra A. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Liste over løsninger, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse 3-D rekonstruktion, eller 4-D billeddannelse, er et kraftfuldt værktøj til at observere dynamikken i cellulær morfologi under udviklingsprocesser. I denne protokol kan dynamikken i 3D-cellulær morfologi observeres i mosen P. patens ved at blande calcofluorhviden i mediet. Ved hjælp af denne metode observerede vi, at overfladen af cellevægge i ggb-mutanter rives fra hinanden under udvikling3. Desuden er den reducerede fortykkelse af cellevægge korreleret med celleekspansions- / forgreningsstederne i vildtype, hvilket muliggør forudsigelse af ekspansions- / forgreningsstederne. Yderligere, fordi calcofluor hvid kan anvendes sammen med andre farvestoffer, såsom mikrosfærer, kan yderligere oplysninger om celleudvidelse observeres3.
Der er to grunde, der kan forklare, hvordan calcofluorfarvestoffet kan binde sig i dagevis til planter uden at påvirke / beskadige det molekylære mål. For det første kan den lave arbejdskoncentration (10 μL i 200 μL BCDATG-medium eller 5%) være tilstrækkelig lav til, at mosprotonemata ikke påvirkes. For det andet kan calcofluor plette det modne stadium af cellulose, fordi farvningssignalet er meget stærkere i den basale del af vildtype (som er ældre væv) end den apikale region af den apikale celle (som er yngre væv), og den ødelagte cellevægoverflade af ggb-mutanter (som er ældre cellulose) er stærkere end cellerne (som er yngre cellulose) under den ødelagte cellevægoverflade.
Denne protokol er blevet brugt til mosvæv, som er enkel i struktur. Den nuværende protokol kan også anvendes på andre systemer med enkle strukturer, såsom rodhår og trichomer i blomstrende planter. Det er dog stadig at se, om calcofluor hvid farvning fungerer for andre systemer med flere cellelag, såsom stilke. Fordi calcofluorhviden blandes med mediet, skal vævet, der skal farves, nedsænkes i mediet. Derfor kan optimering være påkrævet for at anvende denne protokol på andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Soucy Patricia og Betty Nunn ved University of Louisville for hjælp med det konfokale mikroskop. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (1456884 til MPR) og af en National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 til MPR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
