Summary
本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb 変異体の細胞壁の剥離と肥厚する細胞壁パターンの可視化を可能にします。
Abstract
蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。一般に、長期間にわたる観察のために、この技術は蛍光タンパク質の形質転換を必要とする。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子形質転換には時間がかかるか、技術的に利用できません。この原稿は、コケの Physcomitrium patensで開発されたカルコフルオロ色素(植物細胞壁のセルロースを染色する)を使用して、3日間にわたる細胞壁ダイナミクスの3Dタイムラプスイメージングのプロトコルを提示します。細胞壁からのカルコフルオール色素シグナルは安定しており、明らかな崩壊なしに1週間持続します。この方法を使用して、 ggb 変異体(タンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ-Iベータサブユニットがノックアウトされている)における細胞の剥離は、調節されていない細胞増殖および細胞壁完全性の欠陥によって引き起こされることが示されている。さらに、カルコフルアー染色のパターンは時間とともに変化します。それほど強く染色されていない領域は、野生型の将来の細胞増殖/分岐部位と相関しています。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。
Introduction
植物細胞壁は、細胞の拡大と発生の間に動的な変化を受けます1,2,3。細胞壁の完全性を維持することは、成長および発生中の植物細胞の接着、および環境シグナルへの応答にとって重要です。発生中の細胞接着や環境変化への適応を理解するためには、生細胞の細胞壁動態を長期間可視化することが重要ですが、細胞壁動態を直接観察する方法は依然として課題です。
細胞変化のタイムラプスイメージングは、高解像度蛍光顕微鏡4,5,6,7を用いて生物の有益な発生動態を提供することができる。タイムラプス3Dイメージングは、成長および発生中の細胞形状の動的変化を研究するための大きな可能性を秘めていますが、この技術は通常、蛍光タンパク質の形質転換を必要とします4,5,6,7。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子変換には時間がかかるか、技術的に困難です。代替として、細胞成分に付着する蛍光色素が長い間利用可能であった。蛍光色素は、特定の波長の光を照射した後に蛍光を発することができる。一般的な例は、Edu、DAPI、PI、FM4-64、およびカルコフルーアホワイト8,9,10です。しかしながら、1つの大きな欠点は、これらの色素が細胞に害を及ぼすこともあり、通常、固定組織または短時間の実験にしか使用できないことである8、9、10。
ここに示すプロトコルでは、コケP.パテンのタイムラプス実験中にカルコフルーアホワイトが培地内に混合されると、カルコフルーア信号は安定しています。この方法を用いて、3Dタイムラプスイメージングを用いてggb変異体における細胞の剥離を3日間にわたって観察した(図1)。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。
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Protocol
注意: 材料と機器のリストについては 材料の 表を、このプロトコルで使用されるソリューションのリストについては 表1 を参照してください。
1.ガラス底皿用植物の準備
- BCDAT寒天培地中のコケ原始組織を、一定の白色光(~50 μmol m-2 s-1)下で13 cmシャーレ中で、成長チャンバー内で25°Cで7日間成長させます。
- カルコフルオールホワイトをフィルター滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。試薬は数ヶ月間安定しています。
- 生後7日目のコケ組織を、20 μLの滅菌水を含む1.5 mLマイクロチューブに分散させます。コケの原始組織が小片として水中に十分に分散していることを確認してください。野生型(WT)の場合は、鉗子を使用してプロトンマタを分離します。 GGB 変異体には、P-1000ピペットを使用してください。
- 滅菌したカルコフルオールホワイト10 μLを1.5 mLマイクロチューブに加え、マイクロチューブをフード内で2分間直立させて染色します。
- 染色直後に、P-1000ピペットで5回ピペッティングすることにより、0.5%(w / v)グルコースと0.4%(w / v)ジェランガムを添加したBCDAT培地を含む200 μLの冷却BCDATGと植物を混合します。
注意: BCDATG培地が十分に冷却されていることを確認してください(培地が固化する直前)植物にストレスを与えないようにします。 - 植物とBCDATG培地を含む混合物を直径27mmのガラスベースディッシュに移します。細胞を混合するためのBCDATGの容量が200μL以下であり、サンプルを含む200μLのBCDATGが7mmのガラス底皿の表面に均一に分布してフィルムの薄層を生成し、サンプルがイメージング中に対物レンズの作動距離内にあることを確認してください。
- 室温で2分間固化させた後、薄層を冷却したBCDATG3 mLで覆い、10分間セットして再び固化させます。
注意: 汚染を避けるために、手順1.2〜1.5が滅菌フードで実行されていることを確認してください。 - 皿の底に、平行方向と垂直方向にそれぞれ9本の線を引きます(図2)。行を a から h までの文字でマークし、列に 1 から 8 までの数字をマークします。上、下、右、中央、左を使用して、各正方形内の位置をマークします。たとえば、植物が2行目と6列目の正方形にあり、正方形の左上部分に配置されている場合、この植物には「b6_upper_left」という名前が付けられます。
- 植物を含むガラス底皿を成長チャンバー内で25°Cで5日間赤色光下で前培養し、その後白色光下で1〜2日間、毎日最大3日間タイムラプスイメージングを行った。WTの場合、植物を上記からの弱い赤色光(0.5μmol m-2 s-1)で5日間前培養して、プロトネマタの光向性応答を誘導し、植物が皿11の底に付着できるようにした。
注意: 弱い赤色光は、白色光を厚さ3mmの赤いアクリルプラスチックフィルターに通して防光ボックスに入れることによって提供されます。ggb変異体の場合、ggb変異体は光向性応答を持たないため、赤色光での前培養はオプションです3。
2. イメージングと3次元再構成
- 植物を含むガラス底皿を倒立共焦点顕微鏡のステージに置き、ガラス底部を対物レンズに向けます。共焦点顕微鏡を使用して、20倍の対物レンズでカルコフルーアを視覚化します。405 nmレーザー、1.0のピンホール、100のHVゲイン、0のオフセットバックグラウンド調整、5%〜7%のレーザー出力、1,024 x 1,024のスキャンサイズ、および1/2フレーム/秒のスキャン速度で画像を撮影します。ステップサイズ1.0μmの17〜30個のzシリーズ光学セクションを収集します。手順 1.6 のコードを使用して画像に "b6_upper_left-day0" などの名前を付け、保存します。
- [集録] で DAPI チャネルを選択し、[ND 集録] の [Z] チェック ボックスをオンにします。Z スタックの下限と上限を設定するには、[上] ボタンと [下] ボタンをクリックします。
- 3-D イメージを再構築するには、.nd2 ファイル (図 3A; 材料表を参照) を開き、ボリューム (図 3B) をクリックします。
3. 異なる時点での同じ植物のイメージング
- 各イメージングの後、ガラスベースディッシュを成長チャンバーに戻します。
- イメージングと3D再構成について、手順2.1から繰り返します。
注意: 同じ植物を見つけるには、手順1.6で説明したコードを使用して、植物の年齢に応じて「b6_upper_left-day1」または「b6_upper_left-day2」という名前を付けます。
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Representative Results
この方法により、野生型および ggb 変異体の発生過程における細胞壁動態の観察が可能となります(図1)。その結果、細胞壁の肥厚が少ない領域は細胞増殖・分岐部位と相関し、野生型の増殖・分岐部位の予測が可能となりました(図1A)。 ggb 変異体の細胞壁の表面は、制御されない細胞増殖のために発生中に引き裂かれました3 (図1B)。さらに、 ggb 変異体(古いセルロース)の破砕表面の染色シグナルは、壊れた細胞壁表面の下の細胞表面(若いセルロース)よりも強い。
図1:コケの発達の3次元時系列。 (A,B)クロスウォールの動的変化は、WT(A)およびggb変異体(B)のカルコフルーアホワイト染色(セルロースを染色する)によって示されました。ggb変異体(B)の場合、各画像の下の白い破線は拡大する細胞の破断面の細胞壁を示し、オレンジ色の線はggbの細胞壁表面の下の細胞を示します。パネルBは3の許可を得て転載しています。なお、カルコフルーアの白色シグナルの違いは細胞の表面位置で検出でき、密度の低い染色領域(矢じり)は細胞の増殖/分岐部位と相関しています。スケールバー= 20μm。略語:d =日;WT =野生型;ggb = ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ-Iベータ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:植物の位置をマークする。 皿の底には、正方形の位置を示すために、それぞれ平行および垂直方向に9本の線が引かれました。文字aからhは行のマーキングに使用され、数字1から8は列のマーキングに使用されました。上、下、右、中央、左は、各正方形内の位置をマークするために使用されました。たとえば、植物(緑色の点で示されます)が2行目と6列目の正方形に配置され、左上に配置されている場合、その植物はb6_upper_leftと名付けられます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: nd2 z スタック ファイルを使用した 3-D 画像の再構築。 (A) NIS エレメントビューアで nd2 ファイルを開きます。LUT (円) をクリックして画像のコントラストと明るさを調整し、[ボリューム] (四角形) をクリックして 3-D イメージを再構築します。(B)Aから再構成された3次元画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:このプロトコルで使用されるソリューションのリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タイムラプス3D再構成、または4Dイメージングは、発生過程における細胞形態のダイナミクスを観察するための強力なツールです。このプロトコールでは、カルコフルオールホワイトを培地に混合することにより、コケ P.パテンの3D細胞形態の動態を観察することができます。この方法を用いて、 ggb 変異体の細胞壁の表面が発生中に引き裂かれることを観察しました3。さらに、細胞壁の肥厚の減少は、野生型の細胞増殖/分岐部位と相関しており、拡張/分岐部位の予測を可能にします。さらに、カルコフルオールホワイトはミクロスフェアなどの他の色素と一緒に使用できるため、細胞増殖に関する追加情報を観察することができます3。
カルコフルオール色素が分子標的に影響を与えたり損傷したりすることなく、植物に数日間結合する方法を説明できる2つの理由があります。まず、低使用濃度(BCDATG培地200 μLで10 μL、または5%)は、コケプロトネマタが影響を受けないように十分に低い場合があります。第二に、カルコフルオールは、染色シグナルが野生型の基底部(古い組織)で頂端細胞(若い組織)よりもはるかに強く、 ggb 変異体の壊れた細胞壁表面(古いセルロース)が壊れた細胞壁表面の下の細胞(若いセルロース)よりも強いため、セルロースの成熟段階を染色する可能性があります。
このプロトコルは、構造が単純なコケ組織に使用されています。現在のプロトコルは、顕花植物の根毛や毛状突起などの単純な構造を持つ他のシステムにも適用できます。ただし、カルコフルオール白色染色が、茎など、より多くの細胞層を持つ他のシステムで機能するかどうかはまだわかりません。さらに、カルコフルオールホワイトは培地と混合されるため、染色する組織は培地内に浸漬する必要があります。したがって、このプロトコルを他のシステムに適用するには、最適化が必要になる場合があります。
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Disclosures
著者らは、競合する利益や金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、共焦点顕微鏡の支援について、ルイビル大学のSoucy Patricia博士とBetty Nunn博士に感謝の意を表している。この研究は、全米科学財団(1456884からMPR)および全米科学財団協力協定(1849213からMPR)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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