Summary
В этой рукописи представлен подробный протокол для изображения динамики 3-D клеточной стенки живой ткани мха, что позволяет визуализировать отслоение клеточных стенок у мутантов ggb и утолщение паттернов клеточных стенок в диком типе во время развития в течение длительного периода.
Abstract
Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. В целом, для наблюдений в течение длительного периода метод требует трансформации флуоресцентного белка; однако для большинства систем генетическая трансформация либо отнимает много времени, либо технически недоступна. В этой рукописи представлен протокол для 3-D покадровой визуализации динамики клеточной стенки в течение 3-дневного периода с использованием калькофторового красителя (который окрашивает целлюлозу в клеточную стенку растения), разработанного во мхе Physcomitrium patens. Сигнал калькофторового красителя от клеточной стенки стабилен и может длиться в течение 1 недели без явного распада. С помощью этого метода показано, что отслойка клеток у мутантов ggb (при которой выбавливается бета-субъединица белка геранилгеранилтрансферазы-I) вызвана нерегулируемым расширением клеток и дефектами целостности клеточной стенки. Кроме того, паттерны окрашивания калькфтором меняются с течением времени; менее интенсивно окрашенные области коррелируют с будущими участками расширения/ветвления клеток в диком типе. Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.
Introduction
Клеточные стенки растений претерпевают динамические изменения при расширении и развитии клеток 1,2,3. Поддержание целостности клеточной стенки имеет решающее значение для адгезии растительных клеток во время роста и развития, а также для реакции на сигналы окружающей среды. Хотя визуализация динамики клеточной стенки живых клеток в течение длительного периода времени имеет решающее значение для понимания того, как клеточная адгезия поддерживается во время развития и адаптации к изменениям окружающей среды, современные методы непосредственного наблюдения динамики клеточной стенки все еще сложны.
Покадровая визуализация клеточных изменений может обеспечить информативную динамику развития организма с помощью флуоресцентного микроскопа высокого разрешения 4,5,6,7. В то время как покадровая 3D-визуализация имеет большой потенциал для изучения динамических изменений формы клеток во время роста и развития, метод обычно требует преобразования флуоресцентного белка 4,5,6,7. Однако для большинства систем генетические трансформации либо отнимают много времени, либо технически сложны. В качестве альтернативы уже давно доступны флуоресцентные красители, которые прикрепляются к клеточным компонентам. Флуоресцентные красители могут излучать флуоресцентный свет после облучения светом определенной длины волны. Распространенными примерами являются Edu, DAPI, PI, FM4-64 и кальцифтор белый 8,9,10. Одним из основных недостатков, однако, является то, что эти красители обычно могут использоваться только в фиксированной ткани или для коротких экспериментов, отчасти из-за вреда, который они наносят клетке 8,9,10.
Согласно протоколу, представленному здесь, сигналы калькофтора стабильны, когда белый калькофтор смешивается в среде во время покадровых экспериментов во мхе P. patens. Используя этот метод, отслоение клеток у мутантов ggb с использованием 3-D покадровой визуализации наблюдалось в течение 3-дневного периода3 (рисунок 1). Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Список материалов и оборудования см. в Таблице материалов , а в Таблице 1 - список решений, которые будут использоваться в настоящем протоколе.
1. Подготовка растений для стеклянной нижней посуды
- Выращивайте протонемальную ткань мха в агаровой среде BCDAT в чашке Петри 13 см при постоянном белом свете (~50 мкмоль м-2 с-1) в течение 7 дней при 25 °C в камере роста.
- Фильтруют-стерилизуют калькофтор белого цвета и хранят при 4 °C до использования. Реагент стабилен в течение нескольких месяцев.
- Диспергируйте 7-дневную ткань мха в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл стерилизованной воды. Убедитесь, что протонемальная ткань мха достаточно диспергирована в виде небольших кусочков в воде. Для дикого типа (WT) используйте щипцы для отделения протонематы; для мутанта ggb используйте пипетку P-1000.
- Добавьте 10 мкл стерилизованного белого калькофтора в микропробирку объемом 1,5 мл и оставьте микротрубку вертикально в капюшоне на 2 мин для окрашивания.
- Сразу после окрашивания смешайте растения с 200 мкл охлажденного BCDATG, содержащего среду BCDAT, дополненную 0,5% (мас./об.) глюкозы и 0,4% (мас./об.) геллановой камеди, путем пипетки P-1000 пять раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда BCDATG достаточно охлаждена (непосредственно перед затвердеванием среды), чтобы избежать стресса для растений. - Переложите смесь, содержащую растения и среду BCDATG, в стеклянную базовую посуду диаметром 27 мм. Убедитесь, что объем BCDATG для смешивания клеток составляет не более 200 мкл и что 200 мкл BCDATG с образцами равномерно распределены по поверхности стеклянной нижней тарелки 7 мм для получения тонкого слоя пленки, так что образцы находятся в пределах объективного рабочего расстояния во время визуализации.
- После затвердевания в течение 2 мин при комнатной температуре накройте тонкий слой 3 мл охлажденного BCDATG и дайте ему затвердеть в течение 10 мин, чтобы снова затвердеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что этапы 1.2-1.5 проводятся в стерильной вытяжке во избежание загрязнения. - На дне тарелки нарисуйте по девять линий в параллельном и перпендикулярном направлениях (рисунок 2). Пометьте строки символами от a до h и отметьте столбцы цифрами от 1 до 8. Используйте верхнюю, нижнюю, правую, среднюю и левую стороны, чтобы отметить позиции в пределах каждого квадрата. Например, если растение находится в квадрате во втором ряду и шестом столбце и расположено в верхней левой части квадрата, то этому растению дается название «b6_upper_left».
- Предварительно культивируйте стеклянную нижнюю посуду, содержащую растения под красным светом в течение 5 дней при 25 °C в камере роста, а затем под белым светом в течение 1-2 дней, прежде чем подвергаться покадровой визуализации каждый день в течение 3 дней. Для WT прекультуру растений в слабом красном свете (0,5 мкмоль m-2 s-1) сверху в течение 5 дней индуцировать фототропный ответ протонемата, чтобы растения могли прикрепляться к нижней части посуды11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слабый красный свет обеспечивается путем пропускания белого света через красный акриловый пластиковый фильтр толщиной 3 мм в светонепроницаемые коробки. Для мутантов ggb предварительная обработка в красный свет является необязательной, так как мутанты ggb не имеют фототропного ответа3.
2. Визуализация и 3D-реконструкция
- Поместите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую растения, на сцену перевернутого конфокального микроскопа, со стеклянным дном, обращенным к цели. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации калькофтора с объективом 20x. Делайте снимки с помощью лазера 405 нм, точечного отверстия при 1,0, усиления HV при 100, регулировки смещенного фона при 0, мощности лазера при 5%-7%, размера сканирования 1,024 x 1,024 и скорости сканирования 1/2 кадра/с. Соберите оптические секции 17-30 z-серии с размером шага 1,0 мкм. Назовите изображения с помощью кода на шаге 1.6, например "b6_upper_left-day0", и сохраните.
- Выберите канал DAPI в разделе Приобретение и установите флажок Z в ND Acquisition. Чтобы установить нижний и верхний пределы для Z-стека, нажмите кнопки Сверху и Снизу .
- Чтобы восстановить 3D-изображения, откройте файл .nd2 (рисунок 3A; см. Таблица материалов) и щелкните Том (Рисунок 3B).
3. Визуализация одних и тех же растений в разные моменты времени
- После каждого снимка поместите стеклянную базовую тарелку обратно в камеру роста.
- Повторите шаг 2.1 для визуализации и 3D-реконструкции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти те же растения, используйте код, упомянутый на шаге 1.6, и дайте название «b6_upper_left-day1» или «b6_upper_left-day2» в зависимости от возраста растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод позволяет наблюдать динамику клеточной стенки во время развития у мутантов дикого типа и ggb (рисунок 1). Результаты показали, что области с меньшим утолщением клеточной стенки коррелируют с участками расширения/ветвления клеток, что позволяет прогнозировать участки расширения/ветвления в диком типе (рисунок 1А). Поверхность клеточных стенок у мутантов ggb была разорвана во время развития из-за неконтролируемого расширения клеток3 (рисунок 1B). Более того, сигнал окрашивания поврежденной поверхности мутантов ggb (которая является более старой целлюлозой) сильнее, чем поверхность клетки (которая является более молодой целлюлозой) под поверхностью сломанной клеточной стенки.
Рисунок 1: 3-D временные ряды развития мха. (A,B) Динамические изменения поперечных стенок были показаны калькофторовым белым окрашиванием (которое окрашивает целлюлозу) в WT (A) и ggb мутантах (B). Для мутантов ggb (B) белые черты под каждым изображением указывают на сломанные поверхностные клеточные стенки на расширяющихся клетках, а оранжевые линии указывают на ячейки под поверхностью клеточной стенки в ggb. Панель B перепечатывается с разрешенияот 3. Обратите внимание, что различия в белом сигнале калькофтора могут быть обнаружены на поверхностных позициях клеток, а менее плотные области окрашивания (наконечники стрелок) коррелируют с участками расширения/ветвления клеток. Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: d = дни; WT = дикий тип; ggb = геранилгеранилтрансфераза-I бета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Маркировка местоположения растений. На дне тарелки было проведено девять линий в параллельных и перпендикулярных направлениях, чтобы отметить расположение квадратов. Символы от a до h использовались для маркировки строк, а цифры от 1 до 8 использовались для маркировки столбцов. Верхний, нижний, правый, средний и левый использовались для обозначения позиций в пределах каждого квадрата. Например, если растение (обозначаемое зеленой точкой) располагалось в квадрате во втором ряду и шестом столбце, а располагалось в верхней левой части, то растение называлось b6_upper_left. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Реконструкция 3D-изображений с помощью файла z-stack nd2. (A) Откройте файл nd2 в NIS-elements Viewer. Щелкните LUTs (круг), чтобы настроить контрастность и яркость изображений, и нажмите кнопку Громкость (квадрат), чтобы восстановить 3D-изображение. (B) Реконструированное 3D-изображение из A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Список решений, используемых в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покадровая 3D-реконструкция, или 4-D визуализация, является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеточной морфологии во время процессов развития. В этом протоколе, путем смешивания белого калькофтора в среде, динамика морфологии 3-D клеток может наблюдаться у мха P. patens. Используя этот метод, мы наблюдали, что поверхность клеточных стенок у мутантов ggb разрывается на части во время развития3. Кроме того, уменьшенное утолщение клеточных стенок коррелирует с участками расширения/ветвления клеток дикого типа, что позволяет прогнозировать участки расширения/ветвления. Кроме того, поскольку белый калькофтор может использоваться с другими красителями, такими как микросферы, может наблюдаться дополнительная информация о расширении клеток3.
Есть две причины, которые могут объяснить, как калькофторовый краситель может связываться в течение нескольких дней с растениями, не затрагивая / не повреждая молекулярную мишень. Во-первых, низкая рабочая концентрация (10 мкл в 200 мкл среды BCDATG или 5%) может быть достаточно низкой, чтобы протонемата мха не пострадала. Во-вторых, калькофтор может окрашивать зрелую стадию целлюлозы, потому что сигнал окрашивания намного сильнее в базальной части дикого типа (которая является более старой тканью), чем в апикальной области апикальной клетки (которая является более молодой тканью), а поверхность сломанной клеточной стенки мутантов ggb (которая является более старой целлюлозой) сильнее, чем клетки (которая является более молодой целлюлозой) под поверхностью сломанной клеточной стенки.
Этот протокол был использован для ткани мха, которая проста по структуре. Текущий протокол также может быть применен к другим системам с простыми структурами, такими как корневые волоски и трихомы у цветковых растений. Тем не менее, еще предстоит выяснить, работает ли белое окрашивание калькофтором для других систем с большим количеством клеточных слоев, таких как стебли. Более того, поскольку белый калькофтор смешивается со средой, ткань, подлежащая окрашиванию, должна быть погружена в среду. Поэтому оптимизация может потребоваться для применения этого протокола к другим системам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Суси Патрисию и Бетти Нанн из Университета Луисвилля за помощь с конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом (1456884 до M.P.R.) и Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда (1849213 m.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
