Summary
Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der 3D-Zellwanddynamik von lebendem Moosgewebe vor, das die Visualisierung der Ablösung von Zellwänden in ggb-Mutanten und die Verdickung von Zellwandmustern im Wildtyp während der Entwicklung über einen langen Zeitraum ermöglicht.
Abstract
Zeitrafferaufnahmen mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Beobachtung der dynamischen Veränderungen von Wachstum und Entwicklung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Im Allgemeinen erfordert die Technik für Beobachtungen über einen langen Zeitraum die Umwandlung eines fluoreszierenden Proteins. Für die meisten Systeme ist die genetische Transformation jedoch entweder zeitaufwendig oder technisch nicht verfügbar. Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik über einen Zeitraum von 3 Tagen unter Verwendung des Calcofluorfarbstoffs (der Zellulose in der pflanzlichen Zellwand färbt) vor, der im Moos Physcomitrium patens entwickelt wurde. Das Calcofluor-Farbstoffsignal von der Zellwand ist stabil und kann 1 Woche ohne offensichtlichen Zerfall anhalten. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass die Ablösung von Zellen in ggb-Mutanten (bei denen die Protein-Geranylgeranyltransferase-I-beta-Untereinheit ausgeschaltet ist) durch unregulierte Zellexpansion und Zellwandintegritätsdefekte verursacht wird. Darüber hinaus ändern sich die Muster der Calcofluor-Färbung im Laufe der Zeit; Weniger intensiv gefärbte Regionen korrelieren mit den zukünftigen Zellexpansions-/Verzweigungsstellen im Wildtyp. Diese Methode kann auf viele andere Systeme angewendet werden, die Zellwände enthalten und die mit Calcofluor gefärbt werden können.
Introduction
Pflanzliche Zellwände unterliegen dynamischen Veränderungen während der Zellexpansion und -entwicklung 1,2,3. Die Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität ist entscheidend für die Adhäsion von Pflanzenzellen während des Wachstums und der Entwicklung sowie für die Reaktion auf Umweltsignale. Obwohl die Visualisierung der Zellwanddynamik lebender Zellen über einen langen Zeitraum entscheidend ist, um zu verstehen, wie die Zelladhäsion während der Entwicklung und Anpassung an Umweltveränderungen aufrechterhalten wird, sind die aktuellen Methoden zur direkten Beobachtung der Zellwanddynamik immer noch eine Herausforderung.
Die Zeitraffer-Bildgebung zellulärer Veränderungen kann mit einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop 4,5,6,7 Aufschluss über die Entwicklungsdynamik eines Organismus geben. Während die Zeitraffer-3D-Bildgebung ein großes Potenzial für die Untersuchung dynamischer Veränderungen der Zellform während des Wachstums und der Entwicklung bietet, erfordert die Technik normalerweise die Transformation eines fluoreszierenden Proteins 4,5,6,7. Für die meisten Systeme sind genetische Transformationen jedoch entweder zeitaufwendig oder technisch anspruchsvoll. Als Alternative stehen seit langem Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung, die an zelluläre Bestandteile binden. Die Fluoreszenzfarbstoffe können nach Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge Fluoreszenzlicht emittieren. Gängige Beispiele sind Edu, DAPI, PI, FM4-64 und Calcofluorweiß 8,9,10. Ein großer Nachteil ist jedoch, dass diese Farbstoffe typischerweise nur in festem Gewebe oder für kurze Experimente verwendet werden können, zum Teil aufgrund der Schäden, die sie für die Zelle verursachen 8,9,10.
Mit dem hier vorgestellten Protokoll sind Calcofluor-Signale stabil, wenn Calcofluor-Weiß während Zeitraffer-Experimenten im Moos P. patens innerhalb des Mediums gemischt wird. Mit dieser Methode wurde die Ablösung von Zellen in ggb-Mutanten mittels 3D-Zeitraffer-Bildgebung über einen Zeitraum von 3 Tagen beobachtet3 (Abbildung 1). Diese Methode kann auf viele andere Systeme angewendet werden, die Zellwände enthalten und die mit Calcofluor gefärbt werden können.
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Protocol
ANMERKUNG: Die Liste der Materialien und Ausrüstungen finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1 die Liste der in diesem Protokoll zu verwendenden Lösungen.
1. Vorbereitung von Pflanzen für Glasbodenschalen
- Züchten Sie das Moosprotonengewebe in BCDAT-Agarmedium in einer 13 cm Petrischale unter konstantem weißem Licht (~50 μmol m-2 s-1) für 7 Tage bei 25 °C in der Wachstumskammer.
- Das Calcofluor weiß filtern und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern. Das Reagenz ist mehrere Monate stabil.
- Dispergieren Sie das 7 Tage alte Moosgewebe in ein 1,5 ml Mikroröhrchen mit 20 μL sterilisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Moosprotonengewebe als kleine Stücke im Wasser ausreichend verteilt ist. Für den Wildtyp (WT) verwenden Sie eine Pinzette, um die Protonemata zu trennen. Verwenden Sie für die ggb-Mutante eine P-1000-Pipette.
- Geben Sie 10 μL des sterilisierten Calcofluorweißes in das 1,5 mL Mikroröhrchen und lassen Sie das Mikroröhrchen für 2 min aufrecht in der Haube zur Färbung.
- Unmittelbar nach der Färbung mischen Sie die Pflanzen mit 200 μL gekühltem BCDATG, das BCDAT-Medium enthält, das mit 0,5% (w/v) Glukose und 0,4% (w/v) Gellangummi angereichert ist, indem Sie fünfmal mit einer P-1000-Pipette pipettieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das BCDATG-Medium ausreichend abgekühlt ist (kurz bevor das Medium erstarrt), um eine Belastung der Pflanzen zu vermeiden. - Die Mischung mit den Pflanzen und dem BCDATG-Medium in eine Glasbodenschale mit einem Durchmesser von 27 mm überführen. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von BCDATG zum Mischen der Zellen nicht mehr als 200 μl beträgt und dass die 200 μl BCDATG mit den Proben gleichmäßig auf der Oberfläche der 7 mm Glasbodenschale verteilt werden, um eine dünne Schicht Film zu erzeugen, so dass sich die Proben während der Bildgebung innerhalb des objektiven Arbeitsabstands befinden.
- Nach dem Erstarren für 2 min bei Raumtemperatur die dünne Schicht mit 3 ml abgekühltem BCDATG abdecken und 10 min ruhen lassen, um wieder zu erstarren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schritte 1.2 bis 1.5 in einer sterilen Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. - Zeichnen Sie auf der Unterseite der Schale jeweils neun Linien in paralleler und senkrechter Richtung (Abbildung 2). Markieren Sie die Zeilen mit Zeichen von a bis h und markieren Sie die Spalten mit Zahlen von 1 bis 8. Verwenden Sie oben, unten, rechts, in der Mitte und links, um die Positionen innerhalb jedes Quadrats zu markieren. Wenn sich beispielsweise eine Pflanze in einem Quadrat in der zweiten Reihe und der sechsten Spalte befindet und im oberen linken Teil des Quadrats positioniert ist, erhält diese Pflanze den Namen "b6_upper_left".
- Die Glasbodenschale mit den Pflanzen wird 5 Tage lang bei 25 °C in der Wachstumskammer unter rotem Licht und dann 1-2 Tage lang unter weißem Licht vorkultiviert, bevor sie bis zu 3 Tage lang täglich einer Zeitrafferaufnahme unterzogen wird. Für WT werden die Pflanzen 5 Tage lang in schwachem rotem Licht (0,5 μmol m-2 s-1) von oben vorkultiviert, um die phototrope Reaktion der Protonemata zu induzieren, so dass sich die Pflanzen am Boden der Schalenanheften können 11.
HINWEIS: Das schwache rote Licht wird erzeugt, indem ein weißes Licht durch einen 3 mm dicken roten Acrylkunststofffilter in lichtdichte Boxen geleitet wird. Für ggb-Mutanten ist die Vorkultivierung in rotem Licht optional, da die ggb-Mutanten keine phototrope Reaktion3 haben.
2. Bildgebung und 3D-Rekonstruktion
- Stellen Sie die Glasbodenschale mit den Pflanzen auf die Bühne eines inversen konfokalen Mikroskops, wobei der Glasboden dem Objektiv zugewandt ist. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Visualisierung von Calcofluor mit einer 20-fachen Objektivlinse. Nehmen Sie Bilder mit dem 405-nm-Laser, der Lochblende bei 1,0, der HV-Verstärkung bei 100, der Offset-Hintergrundanpassung bei 0, der Laserleistung bei 5 % bis 7 %, einer Scangröße von 1.024 x 1.024 und einer Scangeschwindigkeit von 1/2 Bilder/s auf. Sammeln Sie 17-30 optische Abschnitte der z-Serie mit einer Schrittweite von 1,0 μm. Benennen Sie die Bilder mit dem Code in Schritt 1.6, z. B. "b6_upper_left-day0", und speichern Sie sie.
- Wählen Sie den DAPI-Kanal unter Akquisition aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Z in ND-Erfassung. Klicken Sie auf die Schaltflächen "Oben" und "Unten", um die Unter- und Obergrenze für den Z-Stapel festzulegen.
- Um die 3D-Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie die .nd2-Datei (Abbildung 3A; siehe Materialverzeichnis) und klicken Sie auf das Volume (Abbildung 3B).
3. Abbildung der gleichen Pflanzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten
- Legen Sie nach jeder Bildgebung die Glasbodenschale wieder in die Wachstumskammer.
- Wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.1 für die Bildgebung und 3D-Rekonstruktion.
HINWEIS: Um die gleichen Pflanzen zu finden, verwenden Sie den in Schritt 1.6 genannten Code und geben Sie den Namen "b6_upper_left-Tag1" oder "b6_upper_left-Tag2" an, je nach Alter der Pflanzen.
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Representative Results
Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Zellwanddynamik während der Entwicklung in Wildtyp- und ggb-Mutanten (Abbildung 1). Die Ergebnisse zeigten, dass Regionen mit geringerer Verdickung der Zellwand mit den Zellexpansions-/Verzweigungsstellen korrelieren, was die Vorhersage von Expansions-/Verzweigungsstellen im Wildtyp ermöglicht (Abbildung 1A). Die Oberfläche der Zellwände in ggb-Mutanten wurde während der Entwicklung durch unkontrollierte Zellexpansionauseinandergerissen 3 (Abbildung 1B). Darüber hinaus ist das Färbungssignal der gebrochenen Oberfläche von ggb-Mutanten (die ältere Cellulose ist) stärker als die Zelloberfläche (die jüngere Zellulose ist) unter der gebrochenen Zellwandoberfläche.
Abbildung 1: 3D-Zeitreihe der Moosentwicklung . (A,B) Dynamische Veränderungen der Querwände wurden durch Kalcofluorweißfärbung (die Cellulose färbt) in WT (A) und ggb-Mutanten (B) gezeigt. Für ggb-Mutanten (B) zeigen weiße Strichlinien unter jedem Bild die gebrochenen Oberflächenzellwände auf den expandierenden Zellen an, und orangefarbene Linien zeigen die Zellen unter der Zellwandoberfläche in ggb an. Tafel B wird mit Genehmigung von3 nachgedruckt. Beachten Sie, dass die Unterschiede im Calcofluor-Weißsignal an den Oberflächenpositionen der Zellen nachgewiesen werden können und weniger dichte Färbebereiche (Pfeilspitzen) mit den Zellexpansions-/Verzweigungsstellen korreliert sind. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: d = Tage; WT = Wildtyp; ggb = Geranylgeranyltransferase-I beta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Markierung des Standorts von Pflanzen. Auf dem Boden der Schale wurden jeweils neun Linien parallel und senkrecht gezeichnet, um die Position der Quadrate zu markieren. Die Zeichen a bis h wurden zum Markieren von Zeilen und die Nummern 1 bis 8 zum Markieren von Spalten verwendet. Oben, unten, rechts, in der Mitte und links wurden zum Markieren von Positionen innerhalb jedes Quadrats verwendet. Wenn sich beispielsweise eine Pflanze (gekennzeichnet durch einen grünen Punkt) in einem Quadrat in der zweiten Reihe und der sechsten Spalte befindet und im oberen linken Teil positioniert ist, wurde die Pflanze b6_upper_left genannt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Rekonstruktion von 3D-Bildern mit Hilfe einer nd2-Z-Stack-Datei . (A) Öffnen Sie eine nd2-Datei im NIS-elements Viewer. Klicken Sie auf LUTs (Kreis), um den Kontrast und die Helligkeit der Bilder anzupassen, und klicken Sie auf Lautstärke (Quadrat), um das 3D-Bild zu rekonstruieren. (B) Rekonstruiertes 3D-Bild von A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Liste der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Zeitraffer-3D-Rekonstruktion oder 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik der Zellmorphologie während Entwicklungsprozessen zu beobachten. In diesem Protokoll kann durch Mischen des Calcofluorweißes in das Medium die Dynamik der 3-D-Zellmorphologie im Moos P. patens beobachtet werden. Mit dieser Methode beobachteten wir, dass die Oberfläche von Zellwänden in ggb-Mutanten während der Entwicklungauseinandergerissen wird 3. Darüber hinaus korreliert die reduzierte Verdickung der Zellwände mit den Zellexpansions-/Verzweigungsstellen beim Wildtyp, was eine Vorhersage der Expansions-/Verzweigungsstellen ermöglicht. Da Calcofluorweiß mit anderen Farbstoffen, wie z. B. Mikrosphären, verwendet werden kann, können zusätzliche Informationen über die Zellexpansion beobachtet werden3.
Es gibt zwei Gründe, die erklären könnten, warum der Calcofluorfarbstoff tagelang an Pflanzen binden kann, ohne das molekulare Ziel zu beeinflussen / zu schädigen. Erstens kann die niedrige Arbeitskonzentration (10 μl in 200 μl BCDATG-Medium oder 5%) ausreichend niedrig sein, damit das Moosprotonemata nicht beeinträchtigt wird. Zweitens kann das Calcofluor das reife Stadium der Cellulose färben, da das Färbesignal im basalen Teil des Wildtyps (das älteres Gewebe ist) viel stärker ist als in der apikalen Region der apikalen Zelle (die jüngeres Gewebe ist), und die gebrochene Zellwandoberfläche von ggb-Mutanten (die ältere Cellulose ist) ist stärker als die Zellen (die jüngere Cellulose ist) unter der gebrochenen Zellwandoberfläche.
Dieses Protokoll wurde für Moosgewebe verwendet, das einfach strukturiert ist. Das aktuelle Protokoll kann auch auf andere Systeme mit einfachen Strukturen angewendet werden, wie z. B. Wurzelhaare und Trichome in Blütenpflanzen. Es bleibt jedoch abzuwarten, ob die Calcofluor-Weißfärbung für andere Systeme mit mehr Zellschichten, wie z.B. Stämmen, funktioniert. Da das Calcofluorweiß mit dem Medium vermischt ist, muss das zu färbene Gewebe in das Medium eingetaucht werden. Daher kann eine Optimierung erforderlich sein, um dieses Protokoll auf andere Systeme anzuwenden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Soucy Patricia und Betty Nunn von der University of Louisville für die Unterstützung mit dem konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) und durch ein National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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