Summary
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per visualizzare le dinamiche della parete cellulare 3D del tessuto di muschio vivente, consentendo la visualizzazione del distacco delle pareti cellulari nei mutanti ggb e l'ispessimento dei modelli di parete cellulare nel tipo selvatico durante lo sviluppo per un lungo periodo.
Abstract
L'imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l'osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. In generale, per osservazioni su un lungo periodo, la tecnica richiede la trasformazione di una proteina fluorescente; Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, la trasformazione genetica richiede tempo o tecnicamente non è disponibile. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare per un periodo di 3 giorni utilizzando colorante calcofluor (che colora la cellulosa nella parete cellulare della pianta), sviluppato nel muschio Physcomitrium patens. Il segnale del colorante calcofluor dalla parete cellulare è stabile e può durare per 1 settimana senza evidente decadimento. Utilizzando questo metodo, è stato dimostrato che il distacco delle cellule nei mutanti ggb (in cui la subunità beta della proteina geranilgeraniltransferasi-I viene eliminata) è causato dall'espansione cellulare non regolata e da difetti di integrità della parete cellulare. Inoltre, i modelli di colorazione del calcofluor cambiano nel tempo; Le regioni meno intensamente colorate sono correlate con i futuri siti di espansione/ramificazione cellulare nel tipo selvatico. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.
Introduction
Le pareti cellulari delle piante subiscono cambiamenti dinamici durante l'espansione e lo sviluppo cellulare 1,2,3. Il mantenimento dell'integrità della parete cellulare è fondamentale per l'adesione delle cellule vegetali durante la crescita e lo sviluppo, nonché per la risposta ai segnali ambientali. Sebbene visualizzare le dinamiche della parete cellulare delle cellule viventi per un lungo periodo di tempo sia fondamentale per capire come viene mantenuta l'adesione cellulare durante lo sviluppo e l'adattamento ai cambiamenti ambientali, i metodi attuali per osservare direttamente le dinamiche della parete cellulare sono ancora impegnativi.
L'imaging time-lapse dei cambiamenti cellulari può fornire dinamiche di sviluppo informative di un organismo utilizzando un microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione 4,5,6,7. Mentre l'imaging 3D time-lapse ha un grande potenziale per studiare i cambiamenti dinamici della forma cellulare durante la crescita e lo sviluppo, la tecnica normalmente richiede la trasformazione di una proteina fluorescente 4,5,6,7. Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, le trasformazioni genetiche richiedono tempo o sono tecnicamente impegnative. In alternativa, i coloranti fluorescenti che si attaccano ai componenti cellulari sono disponibili da tempo. I coloranti fluorescenti possono emettere luce fluorescente dopo l'irradiazione con luce di una certa lunghezza d'onda. Esempi comuni sono Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor white 8,9,10. Uno dei principali svantaggi, tuttavia, è che questi coloranti possono essere tipicamente utilizzati solo in tessuti fissi o per brevi esperimenti, in parte a causa del danno che causano alla cellula 8,9,10.
Con il protocollo presentato qui, i segnali calcofluor sono stabili quando il bianco calcofluor viene miscelato all'interno del mezzo durante gli esperimenti time-lapse nel muschio P. patens. Utilizzando questo metodo, il distacco delle cellule nei mutanti ggb utilizzando l'imaging time-lapse 3D è stato osservato in un periodo di 3 giorni3 (Figura 1). Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.
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Protocol
NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l'elenco dei materiali e delle apparecchiature e la Tabella 1 per l'elenco delle soluzioni da utilizzare in questo protocollo.
1. Preparazione di piante per piatti con fondo di vetro
- Coltivare il tessuto protonemico di muschio in mezzo di agar BCDAT in una capsula di Petri di 13 cm sotto luce bianca costante (~50 μmol m-2 s-1) per 7 giorni a 25 °C nella camera di crescita.
- Filtrare-sterilizzare il calcofluor bianco e conservare a 4 °C fino all'uso. Il reagente è stabile per diversi mesi.
- Disperdere il tessuto di muschio di 7 giorni in un microtubo da 1,5 ml contenente 20 μL di acqua sterilizzata. Assicurarsi che il tessuto protonemico del muschio sia sufficientemente disperso come piccoli pezzi nell'acqua. Per il tipo selvatico (WT), utilizzare una pinza per separare i protonemati; per il mutante ggb , utilizzare una pipetta P-1000.
- Aggiungere 10 μL di bianco calcofluor sterilizzato nel microtubo da 1,5 mL e lasciare il microtubo in posizione verticale nel cappuccio per 2 minuti per la colorazione.
- Immediatamente dopo la colorazione, mescolare le piante con 200 μL di BCDATG raffreddato, contenente terreno BCDAT integrato con glucosio allo 0,5% (p/v) e gomma gellan allo 0,4% (p/v), pipettando cinque volte con una pipetta P-1000.
NOTA: Assicurarsi che il mezzo BCDATG sia sufficientemente raffreddato (appena prima che il mezzo si solidifichi) per evitare di stressare le piante. - Trasferire la miscela contenente le piante e il mezzo BCDATG in una base di vetro di 27 mm di diametro. Assicurarsi che il volume di BCDATG per la miscelazione delle cellule non sia superiore a 200 μL e che i 200 μL di BCDATG con i campioni siano distribuiti uniformemente sulla superficie del piatto inferiore di vetro da 7 mm per produrre un sottile strato di pellicola, in modo che i campioni si trovino entro la distanza di lavoro oggettiva durante l'imaging.
- Dopo aver solidificato per 2 minuti a temperatura ambiente, coprire lo strato sottile con 3 ml di BCDATG raffreddato e lasciarlo riposare per 10 minuti per solidificare di nuovo.
NOTA: Assicurarsi che i passaggi 1.2-1.5 siano condotti in un cappuccio sterile per evitare la contaminazione. - Sul fondo del piatto, disegna nove linee ciascuna in direzione parallela e perpendicolare (Figura 2). Contrassegnare le righe con caratteri da a a h e contrassegnare le colonne con numeri da 1 a 8. Usa superiore, inferiore, destra, centro e sinistra per contrassegnare le posizioni all'interno di ogni quadrato. Ad esempio, se una pianta si trova in un quadrato nella seconda fila e nella sesta colonna ed è posizionata nella parte in alto a sinistra del quadrato, a questa pianta viene dato il nome di "b6_upper_left".
- Precoltura il piatto con fondo di vetro contenente le piante sotto luce rossa per 5 giorni a 25 °C nella camera di crescita, e poi sotto luce bianca per 1-2 giorni prima di essere sottoposto a imaging time-lapse ogni giorno per un massimo di 3 giorni. Per WT, precoltura le piante in luce rossa debole (0,5 μmol m-2 s-1) da quanto sopra per 5 giorni per indurre la risposta fototropica del protonemata, in modo che le piante possano attaccarsi al fondo dei piatti11.
NOTA: La debole luce rossa viene fornita facendo passare una luce bianca attraverso un filtro in plastica acrilica rossa di 3 mm di spessore in scatole a prova di luce. Per i mutanti ggb, la precoltura in luce rossa è facoltativa, poiché i mutanti ggb non hanno una risposta fototropica 3.
2. Imaging e ricostruzione 3D
- Posizionare il piatto di vetro contenente piante sul palcoscenico di un microscopio confocale invertito, con il fondo di vetro rivolto verso l'obiettivo. Utilizzare un microscopio confocale per la visualizzazione del calcofluor con una lente obiettivo 20x. Scatta immagini con il laser a 405 nm, il foro stenopeico a 1,0, il guadagno HV a 100, la regolazione dello sfondo offset-0, la potenza del laser al 5% -7%, una dimensione di scansione di 1.024 x 1.024 e una velocità di scansione di 1/2 fotogramma / s. Raccogli sezioni ottiche serie Z 17-30 con una dimensione del passo di 1,0 μm. Assegna un nome alle immagini utilizzando il codice nel passaggio 1.6, ad esempio "b6_upper_left-day0", e salva.
- Selezionare il canale DAPI in Acquisizione e selezionare la casella Z in Acquisizione ND. Per impostare i limiti inferiore e superiore per lo stack Z, fare clic sui pulsanti Superiore e Inferiore .
- Per ricostruire le immagini 3D, aprire il file .nd2 (Figura 3A; vedere Tabella dei materiali) e fare clic sul volume (Figura 3B).
3. Imaging delle stesse piante in diversi punti temporali
- Dopo ogni imaging, rimettere la base di vetro nella camera di crescita.
- Ripetere il passaggio 2.1 per l'imaging e la ricostruzione 3D.
NOTA: per trovare le stesse piante, utilizzare il codice indicato nel passaggio 1.6 e dare il nome "b6_upper_left-giorno1" o "b6_upper_left-giorno2", in base all'età delle piante.
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Representative Results
Questo metodo consente l'osservazione della dinamica della parete cellulare durante lo sviluppo in mutanti wild type e ggb (Figura 1). I risultati hanno mostrato che le regioni con meno ispessimento della parete cellulare sono correlate con i siti di espansione / ramificazione cellulare, consentendo la previsione di siti di espansione / ramificazione nel tipo selvatico (Figura 1A). La superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb è stata lacerata durante lo sviluppo a causa dell'espansione cellulare incontrollata3 (Figura 1B). Inoltre, il segnale di colorazione della superficie rotta dei mutanti ggb (che è cellulosa più vecchia) è più forte della superficie cellulare (che è cellulosa più giovane) sotto la superficie della parete cellulare rotta.
Figura 1: Serie storica 3D dello sviluppo del muschio. (A,B) I cambiamenti dinamici nelle pareti trasversali sono stati mostrati dalla colorazione bianca calcofluor (che colora la cellulosa) nei mutanti WT (A) e ggb (B). Per i mutanti ggb (B), le linee tratteggiate bianche sotto ogni immagine indicano le pareti cellulari della superficie rotta sulle celle in espansione e le linee arancioni indicano le celle sotto la superficie della parete cellulare in ggb. Il pannello B è ristampato con il permesso di3. Si noti che le differenze nel segnale bianco calcofluor possono essere rilevate sulle posizioni superficiali delle cellule e le regioni di colorazione meno dense (punte di freccia) sono correlate ai siti di espansione / ramificazione cellulare. Barre della scala = 20 μm. Abbreviazioni: d = giorni; WT = wild type; ggb = geranilgeraniltransferasi-I beta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Marcatura della posizione delle piante. Sul fondo del piatto, nove linee ciascuna sono state disegnate in direzioni parallele e perpendicolari per segnare la posizione dei quadrati. I caratteri da a a h sono stati utilizzati per contrassegnare le righe e i numeri da 1 a 8 sono stati utilizzati per contrassegnare le colonne. Superiore, inferiore, destro, centrale e sinistro sono stati utilizzati per contrassegnare le posizioni all'interno di ciascun quadrato. Ad esempio, se una pianta (indicata da un punto verde) si trovava in un quadrato nella seconda fila e nella sesta colonna e posizionata nella parte in alto a sinistra, la pianta veniva chiamata b6_upper_left. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Ricostruzione di immagini 3D utilizzando un file z-stack nd2. (A) Aprire un file nd2 nel visualizzatore NIS-elements. Fare clic su LUT (cerchio) per regolare il contrasto e la luminosità delle immagini e fare clic su Volume (quadrato) per ricostruire l'immagine 3D. (B) Immagine 3D ricostruita da A. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Elenco delle soluzioni utilizzate in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La ricostruzione 3D time-lapse, o imaging 4-D, è un potente strumento per osservare le dinamiche della morfologia cellulare durante i processi di sviluppo. In questo protocollo, mescolando il bianco calcofluor nel mezzo, la dinamica della morfologia cellulare 3D può essere osservata nel muschio P. patens. Usando questo metodo, abbiamo osservato che la superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb viene fatta a pezzi durante lo sviluppo3. Inoltre, il ridotto ispessimento delle pareti cellulari è correlato con i siti di espansione/ramificazione cellulare in wildtype, consentendo la previsione dei siti di espansione/ramificazione. Inoltre, poiché il bianco calcofluor può essere utilizzato con altri coloranti, come le microsfere, è possibile osservare ulteriori informazioni sull'espansione cellulare3.
Ci sono due ragioni che potrebbero spiegare come il colorante calcofluor possa legarsi per giorni alle piante senza influenzare / danneggiare il bersaglio molecolare. In primo luogo, la bassa concentrazione di lavoro (10 μL in 200 μL di terreno BCDATG o 5%) può essere sufficientemente bassa da non influenzare il protonemata di muschio. In secondo luogo, il calcofluor può macchiare lo stadio maturo della cellulosa, perché il segnale di colorazione è molto più forte nella parte basale del wild type (che è tessuto più vecchio) rispetto alla regione apicale della cellula apicale (che è tessuto più giovane), e la superficie della parete cellulare rotta dei mutanti ggb (che è cellulosa più vecchia) è più forte delle cellule (che è cellulosa più giovane) sotto la superficie della parete cellulare rotta.
Questo protocollo è stato utilizzato per il tessuto di muschio, che è semplice nella struttura. L'attuale protocollo può essere applicato anche ad altri sistemi con strutture semplici, come i peli radicali e i tricomi nelle piante da fiore. Tuttavia, resta da vedere se la colorazione bianca calcofluor funziona per altri sistemi con più strati cellulari, come gli steli. Inoltre, poiché il bianco calcofluor viene miscelato con il mezzo, il tessuto da colorare deve essere immerso all'interno del mezzo. Pertanto, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per applicare questo protocollo ad altri sistemi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti o finanziari.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la dottoressa Soucy Patricia e Betty Nunn dell'Università di Louisville per l'assistenza con il microscopio confocale. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) e da un National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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