Summary
Este manuscrito presenta un protocolo detallado para obtener imágenes de la dinámica de la pared celular 3D del tejido de musgo vivo, lo que permite la visualización del desprendimiento de las paredes celulares en mutantes ggb y engrosar los patrones de pared celular en el tipo salvaje durante el desarrollo durante un largo período.
Abstract
Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. En general, para observaciones durante un período prolongado, la técnica requiere la transformación de una proteína fluorescente; Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, la transformación genética requiere mucho tiempo o no está técnicamente disponible. Este manuscrito presenta un protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular durante un período de 3 días utilizando colorante calcofluor (que tiñe la celulosa en la pared celular de la planta), desarrollado en el musgo Physcomitrium patens. La señal de colorante calcofluor de la pared celular es estable y puede durar 1 semana sin descomposición obvia. Usando este método, se ha demostrado que el desprendimiento de células en mutantes ggb (en el que la proteína geranilgeraniltransferasa-I subunidad beta es eliminada) es causado por la expansión celular no regulada y defectos de integridad de la pared celular. Además, los patrones de tinción de calcofluor cambian con el tiempo; Las regiones menos intensamente teñidas se correlacionan con los futuros sitios de expansión / ramificación celular en el tipo silvestre. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.
Introduction
Las paredes celulares de las plantas experimentan cambios dinámicos durante la expansión y el desarrollo celular 1,2,3. Mantener la integridad de la pared celular es fundamental para la adhesión de las células vegetales durante el crecimiento y el desarrollo, así como para la respuesta a las señales ambientales. Aunque visualizar la dinámica de la pared celular de las células vivas durante un largo período de tiempo es fundamental para comprender cómo se mantiene la adhesión celular durante el desarrollo y la adaptación a los cambios ambientales, los métodos actuales para observar directamente la dinámica de la pared celular siguen siendo un desafío.
Las imágenes de lapso de tiempo de los cambios celulares pueden proporcionar una dinámica informativa del desarrollo de un organismo utilizando un microscopio de fluorescencia de alta resolución 4,5,6,7. Si bien las imágenes 3D de lapso de tiempo tienen un gran potencial para estudiar los cambios dinámicos de la forma celular durante el crecimiento y el desarrollo, la técnica normalmente requiere la transformación de una proteína fluorescente 4,5,6,7. Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, las transformaciones genéticas requieren mucho tiempo o son técnicamente desafiantes. Como alternativa, los tintes fluorescentes que se adhieren a los componentes celulares han estado disponibles durante mucho tiempo. Los colorantes fluorescentes pueden emitir luz fluorescente después de la irradiación con luz de cierta longitud de onda. Ejemplos comunes son Edu, DAPI, PI, FM4-64 y calcofluor blanco 8,9,10. Un inconveniente importante, sin embargo, es que estos colorantes generalmente solo se pueden usar en tejido fijo o para experimentos cortos, en parte debido al daño que causan a la célula 8,9,10.
Con el protocolo presentado aquí, las señales de calcofluor son estables cuando el blanco de calcofluor se mezcla dentro del medio durante los experimentos de lapso de tiempo en el musgo P. patens. Usando este método, se observó el desprendimiento de células en mutantes ggb utilizando imágenes de lapso de tiempo 3D durante un período de 3 días3 (Figura 1). Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para la lista de materiales y equipos y la Tabla 1 para la lista de soluciones que se utilizarán en este protocolo.
1. Preparación de plantas para platos con fondo de cristal.
- Cultivar el tejido protonemal de musgo en medio de agar BCDAT en una placa de Petri de 13 cm bajo luz blanca constante (~50 μmol m-2 s-1) durante 7 días a 25 °C en la cámara de crecimiento.
- Filtrar y esterilizar el calcofluor blanco y conservar a 4 °C hasta su uso. El reactivo es estable durante varios meses.
- Disperse el tejido de musgo de 7 días de edad en un microtubo de 1,5 ml que contenga 20 μL de agua esterilizada. Asegúrese de que el tejido protonemal del musgo esté suficientemente disperso como pequeños trozos en el agua. Para el tipo salvaje (WT), use fórceps para separar los protonemata; para el mutante ggb , use una pipeta P-1000.
- Añadir 10 μL de calcofluor blanco esterilizado en el microtubo de 1,5 ml y dejar el microtubo en posición vertical en la campana durante 2 minutos para la tinción.
- Inmediatamente después de la tinción, mezclar las plantas con 200 μL de BCDATG enfriado, que contenga medio BCDAT suplementado con 0,5% (p/v) de glucosa y 0,4% (p/v) de goma gellan, pipeteando cinco veces con una pipeta P-1000.
NOTA: Asegúrese de que el medio BCDATG se enfríe lo suficiente (justo antes de que el medio se solidifique) para evitar estresar las plantas. - Transfiera la mezcla que contiene las plantas y el medio BCDATG a un plato base de vidrio de 27 mm de diámetro. Asegúrese de que el volumen de BCDATG para mezclar las células no sea superior a 200 μL y que los 200 μL de BCDATG con muestras se distribuyan uniformemente en la superficie del plato de fondo de vidrio de 7 mm para producir una capa delgada de película, de modo que las muestras estén dentro de la distancia de trabajo objetivo durante la obtención de imágenes.
- Después de solidificar durante 2 minutos a temperatura ambiente, cubra la capa delgada con 3 ml de BCDATG enfriado y déjela reposar durante 10 minutos para que se solidifique nuevamente.
NOTA: Asegúrese de que los pasos 1.2-1.5 se realicen en una campana estéril para evitar la contaminación. - En la parte inferior del plato, dibuje nueve líneas en direcciones paralelas y perpendiculares (Figura 2). Marque las filas con caracteres de la a a la h y marque las columnas con números del 1 al 8. Use superior, inferior, derecha, medio e izquierda para marcar las posiciones dentro de cada cuadrado. Por ejemplo, si una planta está en un cuadrado en la segunda fila y la sexta columna y se coloca en la parte superior izquierda del cuadrado, entonces esta planta recibe el nombre de "b6_upper_left".
- Precultive el plato con fondo de vidrio que contiene las plantas bajo luz roja durante 5 días a 25 °C en la cámara de crecimiento, y luego bajo luz blanca durante 1-2 días antes de ser sometido a imágenes de lapso de tiempo todos los días durante un máximo de 3 días. Para WT, precultivo de las plantas en luz roja débil (0,5 μmol m-2 s-1) de lo anterior durante 5 días para inducir la respuesta fototrópica de los protonemata, de modo que las plantas puedan adherirse al fondo de los platos11.
NOTA: La luz roja débil se proporciona al pasar una luz blanca a través de un filtro de plástico acrílico rojo de 3 mm de espesor en cajas a prueba de luz. Para los mutantes ggb, el precultivo en luz roja es opcional, ya que los mutantes ggb no tienen una respuesta fototrópica 3.
2. Imágenes y reconstrucción 3D
- Coloque el plato con fondo de vidrio que contiene plantas en el escenario de un microscopio confocal invertido, con el fondo de vidrio mirando hacia el objetivo. Utilice un microscopio confocal para la visualización de calcofluor con una lente objetivo 20x. Tome imágenes con el láser de 405 nm, el agujero de alfiler a 1.0, la ganancia de HV a 100, el ajuste de fondo de desplazamiento a 0, la potencia del láser al 5% -7%, un tamaño de escaneo de 1,024 x 1,024 y una velocidad de escaneo de 1/2 cuadro / s. Recopile 17-30 secciones ópticas de la serie z con un tamaño de paso de 1,0 μm. Asigne un nombre a las imágenes utilizando el código del paso 1.6, como "b6_upper_left-day0", y guárdelo.
- Seleccione el canal DAPI en Adquisición y marque la casilla Z en Adquisición ND. Para establecer los límites inferior y superior de la pila Z, haga clic en los botones superior e inferior.
- Para reconstruir las imágenes 3D, abra el archivo .nd2 (Figura 3A; consulte Tabla de materiales) y haga clic en el volumen (Figura 3B).
3. Imágenes de las mismas plantas en diferentes puntos de tiempo
- Después de cada imagen, vuelva a colocar el plato base de vidrio en la cámara de crecimiento.
- Repita el paso 2.1 para obtener imágenes y reconstrucción 3D.
NOTA: Para encontrar las mismas plantas, utilice el código mencionado en el paso 1.6 y asigne el nombre "b6_upper_left-día1", o "b6_upper_left-día2", según la edad de las plantas.
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Representative Results
Este método permite la observación de la dinámica de la pared celular durante el desarrollo en mutantes de tipo salvaje y ggb (Figura 1). Los resultados mostraron que las regiones con menos engrosamiento de la pared celular se correlacionan con los sitios de expansión/ramificación celular, lo que permite la predicción de sitios de expansión/ramificación en el tipo salvaje (Figura 1A). La superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb se desgarró durante el desarrollo debido a la expansión celular incontrolada3 (Figura 1B). Además, la señal de tinción de la superficie rota de los mutantes ggb (que es celulosa más vieja) es más fuerte que la superficie celular (que es celulosa más joven) debajo de la superficie de la pared celular rota.
Figura 1: Series temporales 3D de desarrollo de musgo. (A,B) Los cambios dinámicos en las paredes cruzadas se mostraron por tinción de blanco de calcofluor (que tiñe la celulosa) en mutantes WT (A) y ggb (B). Para los mutantes ggb (B), las líneas blancas debajo de cada imagen indican las paredes celulares de la superficie rota en las celdas en expansión, y las líneas naranjas indican las celdas debajo de la superficie de la pared celular en ggb. El Panel B se reproduce con permiso de3. Tenga en cuenta que las diferencias en la señal de blanco de calcofluor se pueden detectar en las posiciones superficiales de las células, y las regiones de tinción menos densas (puntas de flecha) se correlacionan con los sitios de expansión / ramificación celular. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: d = días; WT = tipo salvaje; ggb = geranilgeraniltransferasa-I beta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Marcaje de la ubicación de las plantas. En la parte inferior del plato, se dibujaron nueve líneas cada una en direcciones paralelas y perpendiculares para marcar la ubicación de los cuadrados. Los caracteres de la a a la h se usaron para marcar filas, y los números del 1 al 8 se usaron para marcar columnas. Superior, inferior, derecha, medio e izquierda se utilizaron para marcar posiciones dentro de cada cuadrado. Por ejemplo, si una planta (denotada por un punto verde) estaba ubicada en un cuadrado en la segunda fila y la sexta columna, y colocada en la parte superior izquierda, entonces la planta se llamaba b6_upper_left. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Reconstrucción de imágenes 3D utilizando un archivo nd2 z-stack. (A) Abra un archivo nd2 en el NIS-elements Viewer. Haga clic en LUT (círculo) para ajustar el contraste y el brillo de las imágenes y haga clic en Volumen (cuadrado) para reconstruir la imagen 3D. (B) Imagen 3D reconstruida de A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Lista de soluciones utilizadas en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La reconstrucción 3D de lapso de tiempo, o imágenes 4D, es una herramienta poderosa para observar la dinámica de la morfología celular durante los procesos de desarrollo. En este protocolo, al mezclar el blanco de calcofluor en el medio, se puede observar la dinámica de la morfología celular 3D en el musgo P. patens. Usando este método, observamos que la superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb se desgarra durante el desarrollo3. Además, el engrosamiento reducido de las paredes celulares se correlaciona con los sitios de expansión / ramificación celular en el tipo salvaje, lo que permite la predicción de los sitios de expansión / ramificación. Además, debido a que el blanco de calcofluor se puede usar con otros colorantes, como microesferas, se puede observar información adicional sobre la expansión celular3.
Hay dos razones que podrían explicar cómo el colorante calcofluor puede unirse durante días a las plantas sin afectar / dañar el objetivo molecular. En primer lugar, la baja concentración de trabajo (10 μL en 200 μL de medio BCDATG, o 5%) puede ser lo suficientemente baja como para que el protonemata de musgo no se vea afectado. En segundo lugar, el calcofluor puede teñir la etapa madura de la celulosa, porque la señal de tinción es mucho más fuerte en la parte basal del tipo salvaje (que es tejido más viejo) que en la región apical de la célula apical (que es tejido más joven), y la superficie rota de la pared celular de los mutantes ggb (que es celulosa más vieja) es más fuerte que las células (que es celulosa más joven) debajo de la superficie de la pared celular rota.
Este protocolo se ha utilizado para el tejido de musgo, que es simple en estructura. El protocolo actual también se puede aplicar a otros sistemas con estructuras simples, como pelos radiculares y tricomas en plantas con flores. Sin embargo, queda por ver si la tinción blanca de calcofluor funciona para otros sistemas con más capas celulares, como los tallos. Además, debido a que el blanco de calcofluor se mezcla con el medio, el tejido a teñir debe sumergirse dentro del medio. Por lo tanto, la optimización puede ser necesaria para aplicar este protocolo a otros sistemas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos o financieros.
Acknowledgments
Soucy Patricia y Betty Nunn de la Universidad de Louisville por su ayuda con el microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) y por un Acuerdo de Cooperación de la National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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