Summary
O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.
Abstract
A imunidade mediada por células T desempenha um papel importante no controle da infecção por flavivírus, seja após a vacinação ou após a infecção natural. A "qualidade" de uma célula T precisa ser avaliada por função, e uma função mais alta está associada a uma proteção imunológica mais poderosa. As células T que podem produzir simultaneamente duas ou mais citocinas ou quimiocinas no nível de célula única são chamadas de células T polifuncionais (TPFs), que medeiam respostas imunes através de uma variedade de mecanismos moleculares para expressar marcadores de degranulação (CD107a) e secretar interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 ou proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1α. Há evidências crescentes de que asT PFestão intimamente relacionadas à manutenção da memória e proteção imunológica a longo prazo e que sua proporção aumentada é um importante marcador de imunidade protetora e é importante no controle efetivo da infecção viral e reativação. Esta avaliação aplica-se não só a respostas imunitárias específicas, mas também à avaliação de respostas imunitárias reativas cruzadas. Aqui, tomando o vírus da encefalite japonesa (JEV) como exemplo, o método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFespecíficos do JEV produzidos por células mononucleares do sangue periférico de crianças vacinadas contra a encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.
Introduction
O vírus da encefalite japonesa (JEV) é um importante vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae1. Muitos países da Ásia-Pacífico há muito enfrentam enormes desafios de saúde pública devido à enorme carga de doenças causadas pela encefalite japonesa (JE), mas isso melhorou drasticamente com a crescente disponibilidade de vários tipos de vacinas2. As respostas imunes protetoras adaptativas evocadas pela infecção natural ou vacinação contribuem para a prevenção e regulação antiviral. A imunidade humoral e a imunidade mediada por células são classificadas como imunidade adaptativa, e a indução da primeira sempre foi considerada uma estratégia-chave no desenho da vacina, embora com compreensão relativamente limitada no passado3. No entanto, o papel da imunidade mediada por células T na limitação da disseminação e depuração do flavivírus tem sido cada vez mais focado e extensivamente estudado4. Além disso, a imunidade das células T não é apenas indispensável nas respostas antivirais específicas do JEV, mas também desempenha um papel proeminente na proteção cruzada contra infecção secundária por flavivírus heterólogos, o que foi demonstrado em estudos anteriores5. Especula-se que esse efeito possa ignorar potenciais efeitos de realce mediados por anticorpos na infecção5. É importante ressaltar que essa imunidade de células T reativas cruzadas é importante, especialmente na ausência de vacinas e medicamentos antivirais contra flavivírus. Embora muitos estudos tenham sido realizados para determinar a contribuição das células T na infecção por JEV em relação às células T CD4+ e CD8+ 6,7, as respectivas linhagens secretoras de citocinas e sua diversificação funcional permanecem indeterminadas, o que significa que a elucidação das funções exatas das células T auxiliares e assassinas é dificultada.
A escala de suas defesas antivirais determina a qualidade das respostas das células T. As células T CD4+ ou CD8+ que podem conferir de forma compatível duas ou mais funções, incluindo secreção e degranulação de citocinas, são caracterizadas como células T polifuncionais (TPFs) após estimulação específica no nível de célula única8. As células T CD4+ que produzem citocinas únicas ou múltiplas podem ter vários efeitos e memórias imunológicas. Por exemplo, as células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ são mais propensas a formar uma resposta protetora eficaz a longo prazo do que as células T IL-2+ CD4+ 9, que podem ser usadas como um parâmetro importante na avaliação do efeito da vacinação. A frequência de IL-2+ IFN-γ+ células T CD4+ está aumentada em pacientes com não progressão a longo prazo da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), enquanto as células T CD4+ em pacientes com progressão da AIDS estão mais inclinadas a produzir IFN-γ isoladamente devido ao efeito promotor da IL-2 na proliferação de células T10. Além disso, um subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ demonstrou sobreviver a longo prazo in vivo e promover sinergicamente a função de morte11. Embora as células T CD8+ sejam mais propensas a exibir atividade citotóxica, algumas células T CD4+ também estão equipadas com atividade citotóxica como uma expressão indiretamente detectada de moléculas CD107a de superfície12. Além disso, certos subconjuntos de células T expressam a quimiocina MIP-1α, que é frequentemente secretada pelos monócitos para participar do recrutamento de neutrófilos mediados por células T13. Da mesma forma, o CD8+ TPFs também pode ser usado para caracterizar a versatilidade dos marcadores acima. Estudos têm demonstrado que a estratégia prime-boost pode efetivamente induzir um período prolongado de efeitos protetores da TPF 13, o que pode aumentar a proteção provocada pela vacinação. Uma característica central no exame do sistema imunológico é a capacidade das células T de memória de facilitar respostas mais fortes, rápidas e eficazes a desafios virais secundários do que as células T ingênuas. As células T de memória efetora (T EM) e as células T de memória central (TCM) são subconjuntos importantes de células T que são frequentemente diferenciados pela expressão composta de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. O TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) tende a se localizar nos tecidos linfoides secundários, enquanto o TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) localiza-se nos tecidos linfoides e periféricos 15,16. O TEM fornece defesa imediata, mas não sustentada, enquanto o TCM sustenta a resposta proliferando nos órgãos linfoides secundários e gerando novos efetores17. Assim, dado que as células de memória podem mediar respostas de recordação específicas e eficientes aos vírus, surgem questões sobre a contribuição desse subconjunto de polifunções.
Com o desenvolvimento da tecnologia de citometria de fluxo, tornou-se comum detectar simultaneamente marcadores de mais de 10 clusters, fenótipos e antígenos de diferenciação, o que é benéfico para anotar mais abundantemente as características imunológicas funcionais em células T individuais para reduzir a má interpretação e as dificuldades na compreensão dos fenótipos de células T. Este estudo utilizou estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis de TPF em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com JEV. Aplicando essa abordagem, a compreensão da imunidade de células T específica de JEV de curto e longo prazo e até mesmo cruzada reativa induzida pela vacinação será expandida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A aprovação ética para o presente estudo foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). Os voluntários foram recrutados no Hospital Infantil de Pequim, na Universidade Médica da Capital. Amostras de sangue venoso periférico foram obtidas de crianças aparentemente saudáveis (2 anos de idade) que já haviam recebido uma vacinação primária e reforçada com a vacina JE SA14-14-2 viva atenuada por menos de meio ano (crianças vacinadas com JE, n = 5) e crianças não vacinadas (6 meses de idade, n = 5). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas as amostras residuais, após serem testadas clinicamente, foram utilizadas neste estudo. Para proteger a privacidade dos voluntários, todos os dados foram totalmente anonimizados e desidentificados.
1. Isolamento de CMPB do sangue venoso periférico
- Coletar amostras de sangue venoso periférico (2 mL) de crianças vacinadas com JE e não vacinadas em tubos EDTA-K 2-anticoagulados (ver Tabela de Materiais) pela técnica padrão de punção venosa18.
- Adicione 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) para diluir o sangue periférico.
NOTA: O processo é tratado o mais rapidamente possível para manter a máxima capacidade de sobrevivência. - Adicionar 4 ml do meio gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) a um tubo de centrífuga de 15 ml e transferir lentamente o sangue diluído para a camada superior do meio de separação.
NOTA: Não misture o sangue com o meio de separação nem destrua a superfície de contacto formada pelos dois líquidos; caso contrário, o efeito de separação não será alcançado. - Centrífuga a 800 × g durante 20 min à temperatura ambiente. Observe as camadas significativas após a centrifugação.
- Transfira os PBMCs (a camada intermediária) para outro tubo de centrífuga de 15 mL e lave os PBMCs com 10 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, ver Tabela de Materiais).
- Centrifugar a 800 × g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
- Ressuspeite os PBMCs com 1 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e conte as células com um contador automatizado à base de azul de tripano (ver Tabela de Materiais).
2. Estimulação de PBMCs por partículas de JEV inativadas para induzir a expressão de citocinas
- Definir dois subgrupos dos grupos de estimulação e controle do JEV nas amostras vacinadas e não vacinadas com JE, respectivamente.
- Ajustar o número de PBMCs para 2 × 10 6 células/mL com meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, e semear os PBMCs em placas de 24 poços (2 × 106 células/1 mL de meio por poço); inocular três poços para cada grupo.
- Estimular os PBMCs do grupo de estimulação JEV com partículas concentradas inativadas de JEV 5 (2 × 105 PFU) por 16 h a 37 °C na presença de anticorpos monoclonais CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Para coloração superficial, use BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O JEV foi inativado por irradiação UV conforme descrito anteriormente19. - Estimular os PBMCs do grupo controle sem partículas virais concentradas por 16 h a 37 °C na presença de anticorpos monoclonais CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Coloração da superfície com BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000).
3. Coloração intracelular ex vivo
- Recolher a suspensão celular de cada grupo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta.
- Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS, adicione corante de viabilidade fixável (1 μL/mL, 1:1.000, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular e incube por 10 min à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 × g (à temperatura ambiente) durante 5 min e remover o sobrenadante.
- Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrífuga a 500 × g (à temperatura ambiente) durante 5 min. Descarte o sobrenadante com cuidado.
- Realizar coloração do marcador de superfície celular.
- Ressuspeite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de marcadores de superfície (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
NOTA: O protocolo de coloração de anticorpos fluorescentes coloridos é mostrado na Tabela 1. - Incubar os tubos (passo 3.4.1) durante 30 minutos à temperatura ambiente e protegê-los da luz. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
NOTA: O anticorpo de BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO pode ser substituído por BUV737-anti-CCR7 e BV480-anti-CD45RA como a anotação das células T de memória.
- Ressuspeite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de marcadores de superfície (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
- Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrífuga a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado.
- Realizar fixação e quebra de membrana.
- Ressuspeite as células com 500 μL de solução fixadora que quebra a membrana (ver Tabela de Materiais) e fixe as células durante 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
- Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrifugar durante 5 min a 500 × g à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante.
- Realizar coloração intracelular de citocinas.
- Ressuscite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de citocina (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 e APC-anti-MIP-1α, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
NOTA: Os volumes e informações sobre anticorpos conjugados com fluoróforo são mostrados na Tabela 1. - Incubar os tubos (passo 3.8.1) durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
- Ressuscite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de citocina (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 e APC-anti-MIP-1α, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
- Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 500 μL de 1x PBS para ressuspender as células.
4. Configuração da citometria de fluxo
- Isole a amostra PBMC sozinha seguindo os procedimentos descritos na etapa 1 como a amostra de controle. Divida a suspensão celular em 12 partes iguais em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (100 μL/tubo), conforme mencionado abaixo.
- Configure amostras não coradas, APC-Cy7-live/dead fixable tained, BV650-anti-CD3 single-stained, BUV395-anti-CD4 single-stained, BV421-anti-CD8 single-stained, BUV737-anti-CD27 single-stained, BV480-anti-CD45RO corado, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ corado, PE-anti-TNF-α single-stained, BV785-anti-IL-2 single-stapped e APC-anti-MIP-1α single-stained.
- Adicione os marcadores da superfície celular e a coloração intracelular das citocinas, conforme descrito na etapa 3. Para cada amostra de coloração única, adicione apenas um dos fluoróforos da etapa de coloração. Adicione 500 μL de 1x PBS para ressuspender as células e o vórtice com baixa velocidade.
- Usando uma amostra não corada, ajuste a dispersão frontal (FSC), a dispersão lateral (SSC) e diferentes tensões de corante fluorescente.
NOTA: Para o presente estudo, foram definidas as seguintes tensões. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V e BV785: 725 V. - Usando as amostras de coloração única, ajuste a compensação da citometria de fluxo para eliminar os sinais de contaminação entre os diferentes fluoróforos.
NOTA: Os parâmetros de compensação são mostrados na Tabela 2.
5. Estratégia de bloqueio e análise de dados
NOTA: No presente estudo, para esta análise, as células T de memória central (TCM de células T CD8+ ou CD4+ como CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA- e as células T efetoras de memória (TEM) de células T CD8+ ou CD4+ como CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA- foram definidas, respectivamente16.
- Desenhe uma porta de polígono através do gráfico de pontos FSC-area (FSC-A)/SSC-area (SSC-A) para selecionar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos (Figura 1A).
- Desenhe uma porta retangular através do gráfico de pontos FSC-A/FSC-width (FSC-W) para selecionar as células individuais (Figura 1B).
- Desenhe um portão retangular através do gráfico de pontos live/dead/SSC-A para selecionar as células ativas (Figura 1C).
- Desenhe uma porta retangular através do gráfico de pontos CD3/SSC-A para identificar as células T CD3+ (Figura 1D).
- Desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD4/CD8 para identificar as células T CD4+ ou CD8+ (Figura 1E).
- Desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD45RO/CD27 para subdividir as células T CD4+ ou CD8+ em TCM (CD27+ CD45RO+) e TEM (CD27- CD45RO+) (Figura 1F-I).
- Desenhe as portas de CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 e MIP-1α do TCM ou TEM das células T CD8+ ou CD4+ para determinar a frequência de diferentes padrões de resposta, respectivamente.
- Carregue as amostras na citometria sequencialmente. Use um portãode parada 20 para adquirir 1 × 106 linfócitos.
Observação : O usuário individual pode coletar mais de 1 × 106 células. Esse número foi um compromisso entre o tempo gasto e a coleta de células suficientes para fornecer resultados significativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 mostra a estratégia de gating utilizada para dividir o TCM ou TEM de células T CD8+ ou CD4+ de um grupo representativo de estimulação JEV de crianças vacinadas com JE. O gráfico de pontos FSC-A/SSC-A é usado para identificar linfócitos, e o gráfico de pontos FSC-A/FSC-W é usado para identificar células individuais. As células viáveis são selecionadas no gráfico de pontos vivo/morto/SSC-A. O gráfico de pontos CD3/SSC-A é usado para identificar as células T CD3+. O gráfico de pontos CD4/CD8 é usado para identificar as células T CD3+ CD4+ e CD3+ CD8+, respectivamente. O TCM (CD27+ CD45RO+) e o TEM (CD27- CD45RO+) das células T CD8+ ou CD4+ são selecionados separadamente no gráfico de pontos CD45RO/CD27. Células com o fenótipo de CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ e MIP-1α+ de CD8+ T CM (Figura 1F), CD8+ T EM (Figura 1G), CD4+ TCM (Figura 1H) e CD4+ TEM (Figura 1I) são selecionadas separadamente desenhando a porta retangular correspondente.
A caracterização polifuncional das respostas das células T CD4+ e CD8+ de memória central e efetora (incluindo degranulação, citocinas e quimiocinas) ao JEV em crianças vacinadas com JE e não vacinadas é mostrada na Tabela 3. Esses resultados indicam que níveis aumentados de CD107a, IFN-γ, TNF-α e IL-2 foram detectados nas células CD8+ da MTC das crianças vacinadas após a estimulação JEV em comparação com as de crianças não vacinadas. O nível de PImáx-1α não diferiu entre os dois grupos. Acredita-se que as células EM T exerçam efeitos antivirais diretamente após a reestimulação com JEV. Níveis mais elevados de CD107a e IFN-γ foram detectados nas célulasEM T CD8+ do grupo vacinado sob estimulação JEV em comparação com o grupo não vacinado. No entanto, TNF-α, IL-2 e MIP-1α não foram significativamente elevados nessas células positivas.
O antígeno JEV induziu com sucesso níveis mais elevados de CD107a, IFN-γ, TNF-α e MIP-1α nas células TCM CD4+ do grupo vacinado em comparação com o grupo não vacinado. No entanto, a proporção de células IL-2+ não diferiu entre os dois grupos sob estimulação JEV. A proporção dos subconjuntos CD107a+, IFN-γ+ e TNF-α+ de célulasT EM CD4+ no grupo vacinado foi maior na presença de JEV do que no grupo não vacinado.
Figura 1: Ilustração da estratégia de gating para identificar o TCM ou TEM das células T CD8+ ou CD4+ e seus subconjuntos. (A) Os linfócitos foram identificados usando o gráfico de pontos FSC-A/SSC-A. (B) Células únicas foram identificadas usando o gráfico de pontos FSC-A/FSC-W. (C) As células vivas foram identificadas por meio do gráfico de pontos vivo/morto/SSC-A. (D) As células T CD3+ foram identificadas por meio do gráfico de pontos CD3/SSC-A. (E) As células T CD3+ CD4+ e CD3+ CD8+ T foram identificadas pelo gráfico de pontos CD4/CD8. (F)T CM CD8+ com o fenótipo de CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ e PImáx-1α+ foram subdivididos separadamente. (G) TEM CD8+ com os cinco fenótipos foram subdivididos separadamente. (H) OsCM T CD4+ com os cinco fenótipos foram subdivididos separadamente. (I) OEM T CD4+ com os cinco fenótipos foi subdividido separadamente. Os números em cada painel representam a porcentagem de células nas portas. O código de cores representa a frequência de ocorrência das células, onde o vermelho é a frequência mais alta e o azul é o mais baixo. Abreviaturas: SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-A = área de dispersão para a frente; FSC-W = largura de dispersão para a frente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo de anticorpos | Fluoróforo conjugado | Dosagem | Clone | Isotipo | Linha de laser de excitação | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| CD3 | BV650 | 2 μL | SK7 | Mouse IgG1, κ | Violeta | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 μL | SK3 | Mouse IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 | 2 μL | SK1 | Mouse IgG1, κ | Violeta | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 μL | L128 | Mouse IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 μL | UCHL1 | Mouse IgG2a, κ | Violeta | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 μL | 3D12 | Rato IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 μL | HI100 | Mouse IgG2b, κ | Violeta | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 μL | H4A3 | Mouse IgG1, κ | Violeta | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 | 2 μL | MQ1-17H12 | Rato IgG2a, κ | Violeta | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 μL | 4S. B3 | Mouse IgG1, κ | Azul | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 μL | MAb11 | Mouse IgG1, κ | Amarelo-Verde | 496, 564 | 578 |
| PImáx-1α | APC | 2 μL | 11A3 | Mouse IgG2a, κ | Vermelho | 650 | 660 |
| NIR zumbi | APC-Cy7 | 1 μL | - | - | Vermelho | 650 | 779 |
Tabela 1: O protocolo de coloração de anticorpos fluorescentes coloridos para análises citométricas de fluxo. Abreviaturas: BV = violeta brilhante; BUV = ultravioleta brilhante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| Referência de compensação da citometria de fluxo (%) | ||||||||||||
| FITC | APC | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabela 2: Os parâmetros de compensação para análises citométricas de fluxo. Abreviaturas: BV = violeta brilhante; BUV = ultravioleta brilhante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| Grupo de TPF | Caracterização polifuncional (%) | |||||||
| Estímulo | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | PImáx-1α | |||
| Células T CD8+ | TCM | Vacinado | JEV | 1,50±0,48 | 1,60±0,69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0,16±0,11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0,31±0,13 | 0,28±0,13 | 0,37±0,20 | 0,02±0,05 | |||
| Não vacinado | JEV | 0,38±0,19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0,16±0,04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0,08±0,11 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Vacinado | JEV | 1,47±0,58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0,33±0,31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0,39±0,15 | 0.16±0.18 | 0,23±0,256 | 0,09±0,21 | |||
| Não vacinado | JEV | 0,41±0,25 | 0.14±0.09 | 0,15±0,11 | 0.20±0.07 | 0,15±0,13 | ||
| Ctrl | 0,34±0,13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0,19±0,19 | 0,01±0,02 | |||
| Valor de p* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| Células T CD4+ | TCM | Vacinado | JEV | 1,55±0,43 | 1.16±0.24 | 0,57±0,25 | 0,29±0,18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0,26±0,20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| Não vacinado | JEV | 0,28±0,08 | 0,21±0,08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0,31±0,13 | 0,26±0,06 | 0,14±0,04 | 0,25±0,13 | 0.04±0.04 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Vacinado | JEV | 1,54±0,58 | 1,33±0,15 | 0,89±0,25 | 0,37±0,22 | 0,21±0,05 | |
| Ctrl | 0,46±0,49 | 0,35±0,30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| Não vacinado | JEV | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0,30±0,15 | 0,23±0,03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0,24±0,14 | 0.19±0.20 | 0,25±0,08 | 0,05±0,07 | |||
| Valor de p* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Teste U de Mann-Whitney, PBMCs de indivíduo vacinado estimulado por JEV vs. PBMCs de indivíduos não vacinados estimulados por JEV foram mostrados apenas. | ||||||||
Tabela 3: Caracterização polifuncional do TCM e TEM das respostas das células T CD4+ ou CD8+ ao JEV. Vacinados, n = 5; não vacinados, n = 5. Os resultados são expressos como média ± DP. P < 0,05 indicaram diferença significativa. * PBMCs de indivíduos vacinados estimulados por JEV versus PBMCs de indivíduos não vacinados estimulados apenas por JEV são mostrados. Abreviaturas: TPFs = células T polifuncionais; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = fator de necrose tumoral-α; IL-2 = interleucina-2; PImáx-1α = proteína inflamatória dos macrófagos-1α; TCM = células T da memória central; TEM = células T da memória do efetor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo representa um método viável de detecção baseado em citometria de fluxo para perfis de TPF nos PBMCs de crianças vacinadas com a vacina JEV SA14-14-2. Este estudo utilizou como material de pesquisa os PBMCs de sangue venoso de crianças vacinadas e não vacinadas. Com a estimulação de PBMCs com o antígeno JEV,esses PFsT específicos de antígeno amplificados podem ser caracterizados pela coloração de anticorpos de citometria de fluxo multicolorida. Em comparação com o método convencional de ensaio de imunospot enzimático, a vantagem notável da citometria de fluxo é apresentar as características funcionais dos PBMCs no nível de célula única da forma mais diversificada possível, reduzindo o número de PBMCs necessários para a detecção, o que é especialmente adequado para crianças.
Uma história vacinal clara, a viabilidade celular mantida, a imunogenicidade das células T do estimulador e estratégias compatíveis de correspondência de cores são etapas críticas neste protocolo. A China incorporou a vacinação do JEV SA14-14-2 no programa nacional de imunização expandido desde 2008 e incluiu o histórico de vacinação no manejo unificado, que se tornou disponível para a acessibilidade do históricovacinal 3. Os PBMCs examinados neste protocolo foram mantidos experimentalmente no gelo para manter a máxima viabilidade celular. O uso de estímulos específicos já demonstrou ser amplamente eficaz 4,5,21,22. A estratégia de correspondência de cores é a principal restrição neste método, e a usabilidade dessa estratégia tem sido apresentada no refinamento contínuo pré-teste e na correspondência de parâmetros do instrumento. Além disso, esse protocolo fornecia duas opções para anotar as células T da memória. Através da configuração acima e otimização dos parâmetros experimentais, pode ser possível medir a imunidade específica e até mesmo cruzada reativa, avaliando a escala e a frequênciadas respostas da PF T à vacinação por citometria de fluxo. No entanto, os cinco indicadores representativos para caracterizar aPFT são uma limitação deste estudo; as moléculas funcionais atualmente comuns (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 e MIP-1α) podem ser expandidas para detectar o espectro, a fim de caracterizar mais plenamente a versatilidadedos PF Tcom base no protocolo apresentado.
A infecção por JEV é considerada uma doença evitável por vacinação, na qual as respostas das células T de memória evocadas pela vacinação podem ser críticas na manutenção de uma proteção imunológica duradoura, especialmente à medida que as respostas de anticorpos diminuem ao longo do tempo4. Como o principal componente protetor totipotente em células T de memória, aT PFs deve ser sugerida como um item de teste de rotina para avaliação da eficácia da vacina e, inversamente, orientar o projeto e o desenvolvimento de vacinas de células T direcionadas. De fato, o papel da imunidade das células T no controle da infecção por flavivírus está se tornando cada vez mais apreciado, e pode até mesmo ignorar o papel dos anticorpos para melhor ou pior5. O esclarecimento do perfil de TPF irá, sem dúvida, estreitar ainda mais o repertório de epítopos antigênicos, o que certamente reduzirá o custo das vacinas, melhorando a segmentação. Os efeitos sinérgicos das células T CD4+ e CD8+ complementam-se e são, sem dúvida, mais proeminentes nos TPF. Portanto, propõe-seque os estudossobre PF t enfoquem (1) diferenças de perfil entre asPFt de longo e curto prazo; (2) a identificação de epítopos de TPF restritos ao HLA; e (3) a exploração e pesquisa de subpopulações mais polifuncionais.
A identificação de células TPF no controle imunológico da infecção viral foi relatada23,24,25. No entanto, a descrição da estratégia e do processo completo de detecção daPFT não foi bem organizada. Além disso, o esquema de cores deste método se aplica a vários modelos de citômetros de fluxo. Os marcadores também podem ser ajustados para detectar outros subgrupos funcionais com base nessa correspondência de cores.
Este estudo forneceu uma estratégia de detecção de T PF combinando estimulação específica ex vivo e citometria de fluxo para analisar os perfis de subconjuntos de TPF nos PBMCs de receptores da vacina JEV. Os PBMCs isolados foram primeiramente estimulados com o antígeno JEV e, em seguida, corados com os anticorpos marcados fluorescentemente correspondentes, e os TPFCD4+ e CD8+ específicos do JEV foram caracterizados por citometria de fluxo. Com base nesse resultado, as frequências de TPF de funções duplas, triplas, quádruplas e quíntuplas podem ser calculadas para descrever asPFT s de forma mais detalhada e abrangente. Os volumes sanguíneos venosos de rotina (2 mL) em crianças demonstraram ser suficientes para os estudosde T PF. Portanto, espera-se que os métodos de detecção de TPFespecíficos do vírus sejam usados para explorar medidas de imunidade adaptativa mediada por células T associadas à vacinação ou infecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
R.W. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim da China (7222059). A ZD.X. foi apoiada pelo Fundo de Inovação CAMS para as Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
