Summary
Den nuværende protokol kombinerer ex vivo-stimulering og flowcytometri til analyse af polyfunktionelle T-celleprofiler (TPF) i mononukleære celler (PBMC'er) i perifert blod mononukleære celler (PBMC'er) hos japanske encephalitisvirus (JEV)-vaccinerede børn. Detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF'er blev testet for at give en reference til lignende undersøgelser.
Abstract
T-cellemedieret immunitet spiller en vigtig rolle i bekæmpelsen af flavivirusinfektion, enten efter vaccination eller efter naturlig infektion. "Kvaliteten" af en T-celle skal vurderes efter funktion, og højere funktion er forbundet med mere kraftfuld immunbeskyttelse. T-celler, der samtidig kan producere to eller flere cytokiner eller kemokiner på enkeltcelleniveau, kaldes polyfunktionelle T-celler (TPF'er), som medierer immunresponser gennem en række molekylære mekanismer til at udtrykke degranulationsmarkører (CD107a) og udskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2 eller makrofaginflammatorisk protein (MIP)-1α. Der er stigende tegn på, at TPFer tæt forbundet med opretholdelsen af langvarig immunhukommelse og beskyttelse, og at deres øgede andel er en vigtig markør for beskyttende immunitet og er vigtig for effektiv kontrol af virusinfektion og reaktivering. Denne evaluering gælder ikke kun for specifikke immunresponser, men også for vurderingen af krydsreaktive immunresponser. Her, idet man tog den japanske encephalitisvirus (JEV) som et eksempel, blev detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF'erproduceret af mononukleære celler i perifert blod af børn vaccineret mod japansk encephalitis testet for at give en reference til lignende undersøgelser.
Introduction
Japansk encephalitisvirus (JEV) er en vigtig myggebåren virus, der tilhører slægten Flavivirus inden for Flaviviridae-familien 1. Mange lande i Asien og Stillehavsområdet har længe stået over for enorme folkesundhedsudfordringer på grund af den enorme sygdomsbyrde forårsaget af japansk encephalitis (JE), men dette er forbedret dramatisk med den stigende tilgængelighed af forskellige typer vaccinationer2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkaldt af naturlig infektion eller vaccination bidrager til forebyggelse og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemedieret immunitet klassificeres som adaptiv immunitet, og induktion af førstnævnte har altid været betragtet som en nøglestrategi inden for vaccinedesign, omend med relativt begrænset forståelse i de sidste3. T-cellemedieret immunitets rolle med hensyn til at begrænse flavivirusspredning og virusclearance er imidlertid i stigende grad blevet fokuseret på og grundigt undersøgt4. Desuden er T-celleimmunitet ikke kun uundværlig i JEV-specifikke antivirale reaktioner, men spiller også en fremtrædende rolle i krydsbeskyttelse mod sekundær infektion med heterologe flavivirus, hvilket er blevet påvist i tidligere undersøgelser5. Det spekuleres i, at denne effekt kan omgå potentielle antistofmedierede forbedringseffekter i infektion5. Bemærk, at en sådan krydsreaktiv T-celleimmunitet er vigtig, især i mangel af vacciner og antivirale lægemidler mod flavivirus. Selvom mange undersøgelser er blevet udført for at bestemme T-cellernes bidrag i JEV-infektion med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forbliver de respektive afstamninger, der udskiller cytokiner og deres funktionelle diversificering, ubestemte, hvilket betyder, at belysningen af de nøjagtige funktioner af hjælper- og dræber-T-celler hindres.
Omfanget af deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten af T-celleresponser. CD4 + eller CD8 + T-celler, der kompatibelt kan give to eller flere funktioner, herunder cytokinsekretion og degranulering, karakteriseres som polyfunktionelle T-celler (TPF'er) ved specifik stimulering på enkeltcelleniveau8. CD4 + T-celler, der producerer enkelte eller flere cytokiner, kan have forskellige virkninger og immunhukommelser. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mere tilbøjelige til at danne et langsigtet effektivt beskyttelsesrespons end IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan bruges som en vigtig parameter til evaluering af vaccinationseffekten. Hyppigheden af IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler øges hos patienter med langvarig ikke-progression af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos patienter med AIDS-progression er mere tilbøjelige til at producere IFN-γ alene på grund af den fremmende virkning af IL-2 på T-celleproliferation10. Desuden viste det sig, at en delmængde af IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ overlevede langsigtet in vivo og synergistisk fremmede drabsfunktionen11. Selvom CD8 + T-celler er mere tilbøjelige til at udvise cytotoksisk aktivitet, er nogle CD4 + T-celler også udstyret med cytotoksisk aktivitet som et indirekte detekteret udtryk for overflade CD107a molekyler12. Derudover udtrykker visse T-celleundergrupper kemokin-MIP-1α, som ofte udskilles af monocytter for at deltage i T-cellemedieret neutrofil rekruttering13. På samme måde kan CD8+ TPFs også bruges til at karakterisere alsidigheden af ovenstående markører. Undersøgelser har vist, at prime-boost-strategien effektivt kan fremkalde en længere periode med TPF-beskyttende virkninger13, hvilket kan forbedre beskyttelsen fremkaldt af vaccination. Et centralt træk ved at undersøge immunsystemet er hukommelses-T-cellernes evne til at lette stærkere, hurtigere og mere effektive reaktioner på sekundære virale udfordringer end naive T-celler. Effektorhukommelses-T-celler (TEM) og centrale hukommelses-T-celler (TCM) er vigtige T-celleundergrupper, der ofte differentieres ved den sammensatte ekspression af CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har tendens til at lokalisere i sekundært lymfoidt væv, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA-) lokaliserer i lymfoid og perifert væv 15,16. TEM giver øjeblikkeligt, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opretholder responsen ved at proliferere i de sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. I betragtning af at hukommelsesceller kan formidle specifikke og effektive tilbagekaldelsesresponser på vira, opstår der spørgsmål om bidraget fra denne delmængde af polyfunktioner.
Med udviklingen af flowcytometriteknologi er det blevet almindeligt samtidig at detektere markører for mere end 10 klynger, fænotyper og differentieringsantigener, hvilket er gavnligt for mere rigeligt at kommentere de funktionelle immunologiske træk på individuelle T-celler for at reducere fejlfortolkning og vanskeligheder med at forstå T-cellefænotyper. Denne undersøgelse brugte ex vivo-stimulering og flowcytometri til at analysere TPF-profiler i mononukleære celler (PBMC'er i perifert blod) hos JEV-vaccinerede børn. Ved anvendelse af denne tilgang vil forståelsen af kort- og langsigtet JEV-specifik og endda krydsreaktiv T-celleimmunitet induceret af vaccination blive udvidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkendelse af denne undersøgelse blev opnået af den etiske komité for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: 2020-k-85). Frivillige blev rekrutteret fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver blev taget fra tilsyneladende raske børn (2 år), der tidligere havde modtaget en prime og boostet vaccination med levende svækket JE SA14-14-2-vaccine i mindre end et halvt år (JE-vaccinerede børn, n = 5) og uvaccinerede børn (6 måneder, n = 5). Informeret samtykke fra forsøgspersoner blev frafaldet, da kun de resterende prøver, efter at være blevet klinisk testet, blev brugt i denne undersøgelse. For at beskytte de frivilliges privatliv blev alle data fuldt anonymiseret og afidentificeret.
1. Isolering af PBMC'er fra perifert venøst blod
- Indsaml perifere venøse blodprøver (2 ml) fra JE-vaccinerede og uvaccinerede børn i EDTA-K 2-antikoagulerede rør (se Materialetabel) ved hjælp af standard venipunkturteknikken18.
- Tilsæt 2 ml fosfatbufferet saltvand (1x PBS) for at fortynde det perifere blod.
BEMÆRK: Processen håndteres så hurtigt som muligt for at opretholde maksimal overlevelsesevne. - Der tilsættes 4 ml af densitetsgradientmediet (se Materialetabel) til et 15 ml centrifugerør, og overfør langsomt det fortyndede blod til det øverste lag af separationsmediet.
BEMÆRK: Bland ikke blodet med separationsmediet, og ødelæg ikke kontaktfladen dannet af de to væsker; Ellers opnås adskillelseseffekten ikke. - Centrifuge ved 800 × g i 20 minutter ved stuetemperatur. Overhold de signifikante lag efter centrifugering.
- Overfør PBMC'erne (mellemlaget) til et andet 15 ml centrifugerør, og vask PBMC'erne med 10 ml RPMI-1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, se Materialetabel).
- Centrifuge ved 800 × g i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten forsigtigt med en pipette.
- Resuspend PBMC'erne med 1 ml RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS og tæl cellerne med en trypan blue-baseret automatiseret tæller (se Materialetabel).
2. Stimulering af PBMC'er af inaktiverede JEV-partikler til inducering af cytokinekspression
- Indstil to undergrupper af JEV-stimulerings- og kontrolgrupperne i henholdsvis JE-vaccinerede og uvaccinerede prøver.
- Juster antallet af PBMC'er til 2 × 10 6 celler / ml med RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS, og frø PBMC'erne i 24-brøndsplader (2 × 106 celler / 1 ml medium pr. Brønd); pode tre brønde til hver gruppe.
- Stimulere PBMC'erne i JEV-stimuleringsgruppen med koncentrerede inaktiverede JEV-partikler 5 (2 × 105 PFU) i 16 timer ved 37 °C i nærvær af monoklonale antistoffer CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) og CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) og monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Til overfladefarvning skal du bruge BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (se Materialetabel).
BEMÆRK: JEV blev inaktiveret ved UV-bestråling som beskrevet tidligere19. - Stimulere kontrolgruppens PBMC'er uden koncentrerede viruspartikler i 16 timer ved 37 °C i nærværelse af monoklonale antistoffer CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) og CD49d (1 μg/ml, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) og monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Plet overfladen med BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).
3. Ex vivo intracellulær farvning
- Cellesuspensionen opsamles fra hver gruppe i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, centrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes med en pipette.
- Resuspender cellerne i 1 ml 1x PBS, tilsæt fikserbart levedygtighedsfarvestof (1 μL / ml, 1: 1.000, se Materialetabel) til cellesuspensionen, og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Centrifuge ved 500 × g (ved stuetemperatur) i 5 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellerne i 1 ml 1x PBS. Centrifuge ved 500 × g (ved stuetemperatur) i 5 min. Kassér supernatanten omhyggeligt.
- Udfør celleoverflademarkørfarvning.
- Resuspender cellerne i 100 μL 1x PBS, og tilsæt 2 μL af hvert overflademarkørantistof (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO, fortyndingsfaktor: 1:50, se Materialetabel) til cellesuspensionen i hvert rør.
BEMÆRK: Farvefluorescerende antistoffarvningsprotokol er vist i tabel 1. - Rørene inkuberes (trin 3.4.1) i 30 minutter ved stuetemperatur, og de beskyttes mod lys. Centrifuge ved 500 × g i 5 minutter og fjern supernatanten.
BEMÆRK: Antistoffet af BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO kan erstattes med BUV737-anti-CCR7 og BV480-anti-CD45RA som annotation af hukommelses-T-cellerne.
- Resuspender cellerne i 100 μL 1x PBS, og tilsæt 2 μL af hvert overflademarkørantistof (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO, fortyndingsfaktor: 1:50, se Materialetabel) til cellesuspensionen i hvert rør.
- Resuspend cellerne i 1 ml 1x PBS. Centrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten omhyggeligt.
- Udfør fiksering og membranbrud.
- Resuspender cellerne med 500 μL membranbrydende fikseringsopløsning (se Materialetabel) og fastgør cellerne i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur. Centrifuge ved 500 × g i 5 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellerne i 1 ml 1x PBS. Centrifuge i 5 minutter ved 500 × g ved stuetemperatur og fjern supernatanten forsigtigt.
- Udfør intracellulær cytokinfarvning.
- Resuspender cellerne i 100 μL 1x PBS, og tilsæt 2 μL af hvert cytokinantistof (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 og APC-anti-MIP-1α, fortyndingsfaktor: 1:50, se Materialetabel) til cellesuspensionen i hvert rør.
BEMÆRK: Mængder og oplysninger om fluorophorkonjugerede antistoffer er vist i tabel 1. - Rørene inkuberes (trin 3.8.1) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Centrifuge ved 500 × g i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Resuspender cellerne i 100 μL 1x PBS, og tilsæt 2 μL af hvert cytokinantistof (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 og APC-anti-MIP-1α, fortyndingsfaktor: 1:50, se Materialetabel) til cellesuspensionen i hvert rør.
- Resuspend cellerne i 1 ml 1x PBS. Centrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, og fjern supernatanten forsigtigt. Tilsæt 500 μL 1x PBS for at resuspendere cellerne.
4. Opsætning af flowcytometri
- PBMC-prøven isoleres alene efter de procedurer, der er beskrevet i trin 1 som kontrolprøven. Cellesuspensionen opdeles i 12 lige store dele i 1,5 ml mikrocentrifugerør (100 μL/rør) som nævnt nedenfor.
- Opsæt ufarvet, APC-Cy7-levende / dødfikserbar farvet, BV650-anti-CD3 enkeltfarvet, BUV395-anti-CD4 enkeltfarvet, BV421-anti-CD8 enkeltfarvet, BUV737-anti-CD27 enkeltfarvet, BV480-anti-CD45RO farvet, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ farvet, PE-anti-TNF-α enkeltfarvede, BV785-anti-IL-2 enkeltfarvede og APC-anti-MIP-1α enkeltfarvede prøver.
- Tilføj celleoverflademarkører og intracellulær cytokinfarvning som beskrevet i trin 3. For hver enkeltfarvningsprøve skal du kun tilføje en af fluorophorerne fra farvningstrinnet. Tilsæt 500 μL 1x PBS for at resuspendere cellerne og hvirvelstrømmen med lav hastighed.
- Brug en ufarvet prøve til at justere fremadgående spredning (FSC), sidespredning (SSC) og forskellige fluorescerende farvespændinger.
BEMÆRK: For denne undersøgelse blev følgende spændinger indstillet. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V og BV785: 725 V. - Ved hjælp af enkeltfarvningsprøverne justeres flowcytometrikompensationen for at eliminere forureningssignalerne mellem de forskellige fluorophorer.
BEMÆRK: Kompensationsparametrene er vist i tabel 2.
5. Gating-strategi og dataanalyse
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev de centrale hukommelses-T-celler (TCM af CD8+ eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA- og effektorhukommelses-T-cellerne (TEM) af CD8+ eller CD4+ T-celler som CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA- defineret henholdsvis16.
- Tegn en polygonport gennem FSC-området (FSC-A)/SSC-området (SSC-A) prikplot for at vælge den intakte lymfocytpopulation, mens affaldet ekskluderes (figur 1A).
- Tegn en rektangulær port gennem FSC-A/FSC-width (FSC-W) prikplottet for at markere de enkelte celler (figur 1B).
- Tegn en rektangulær port gennem det levende/døde/SSC-A prikplot for at vælge de levende celler (figur 1C).
- Tegn en rektangulær port gennem CD3/SSC-A-punktplottet for at identificere CD3+ T-cellerne (figur 1D).
- Tegn en quad-port gennem CD4/CD8-prikplottet for at identificere CD4+ - eller CD8+ T-cellerne (figur 1E).
- Tegn en quad-port gennem CD45RO/CD27-punktplottet for at opdele CD4+- eller CD8+ T-cellerne i TCM (CD27+ CD45RO+) og TEM (CD27- CD45RO+) (figur 1F-I).
- Tegn portene til CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 og MIP-1α fra TCM eller TEM for CD8+ eller CD4+ T-cellerne for at bestemme hyppigheden af forskellige responsmønstre.
- Læg prøverne på cytometrien sekventielt. Brug en stopport20 til at erhverve 1 × 106 lymfocytter.
BEMÆRK: Den enkelte bruger kan indsamle mere end 1 × 106 celler. Dette tal var et kompromis mellem den tid, det tog, og indsamlingen af nok celler til at give meningsfulde resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser den gating-strategi, der bruges til at opdele TCM- eller TEM for CD8+ eller CD4+ T-celler fra en repræsentativ JEV-stimuleringsgruppe af JE-vaccinerede børn. FSC-A/SSC-A dot-plottet bruges til at identificere lymfocytter, og FSC-A/FSC-W dot plottet bruges til at identificere enkeltceller. Levedygtige celler vælges på levende / død / SSC-A prikplot. CD3/SSC-A-punktplottet bruges til at identificere CD3+ T-cellerne. Plottet CD4/CD8 bruges til at identificere henholdsvis CD3+ CD4+ og CD3+ CD8+ T-cellerne. TCM (CD27+ CD45RO+) og TEM (CD27- CD45RO+) af CD8+ eller CD4+ T-celler vælges separat på cd45RO/CD27-punktplottet. Celler med fænotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ og MIP-1α+ fra CD8+ T CM (figur 1F), CD8+ T EM (figur 1G), CD4+ T CM (figur 1H) og CD4+ T EM (figur 1I) vælges separat ved at tegne den tilsvarende rektangulære port.
Den polyfunktionelle karakterisering af central- og effektorhukommelse CD4+ og CD8+ T-celleresponser (herunder degranulering, cytokiner og kemokiner) til JEV hos JE-vaccinerede og uvaccinerede børn er vist i tabel 3. Disse resultater indikerer, at øgede niveauer af CD107a, IFN-γ, TNF-α og IL-2 blev påvist i CD8+ TCM-cellerne hos de vaccinerede børn efter JEV-stimulering sammenlignet med dem hos uvaccinerede børn. Niveauet af MIP-1α var ikke forskelligt mellem de to grupper. TEM-celler menes at udøve antivirale virkninger direkte ved restimulering med JEV. Højere niveauer af CD107a og IFN-γ blev påvist i CD8 + T EM-cellerne i den vaccinerede gruppe under JEV-stimulering sammenlignet med den uvaccinerede gruppe. TNF-α, IL-2 og MIP-1α var imidlertid ikke signifikant forhøjet i disse positive celler.
JEV-antigenet inducerede med succes højere niveauer af CD107a, IFN-γ, TNF-α og MIP-1α i CD4 + TCM-cellerne i den vaccinerede gruppe sammenlignet med den uvaccinerede gruppe. Andelen af IL-2+ celler var imidlertid ikke forskellig mellem de to grupper under JEV-stimulering. Andelen af delmængderne CD107a+, IFN-γ+ og TNF-α+ af CD4+ TEM-celler i den vaccinerede gruppe var højere i nærværelse af JEV end i den uvaccinerede gruppe.
Figur 1: Illustration af gating-strategien til identifikation af TCM- eller TEM for CD8+- eller CD4+ T-celler og deres delmængder. (A) Lymfocytter blev identificeret ved hjælp af FSC-A/SSC-A dot plottet. (B) Enkeltceller blev identificeret ved hjælp af FSC-A/FSC-W-prikplottet. (C) Levende celler blev identificeret ved hjælp af det levende/døde/SSC-A prikplot. (D) CD3+ T-celler blev identificeret ved hjælp af CD3/SSC-A-prikplottet. (E) CD3 + CD4 + T og CD3 + CD8 + T celler blev identificeret ved hjælp af CD4 / CD8 dot plot. (F) CD8+ TCM med fænotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ og MIP-1α+ blev opdelt separat. (G) CD8+ TEM med de fem fænotyper blev opdelt separat. (H) CD4+ TCM med de fem fænotyper blev opdelt separat. (I) CD4 + TEM med de fem fænotyper blev opdelt separat. Tallene på hvert panel repræsenterer procentdelen af celler i portene. Farvekodningen repræsenterer hyppigheden af forekomsten af cellerne, hvor rød er den højeste frekvens og blå er den laveste. Forkortelser: SSC-A = side scatter-area; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; FSC-W = fremadgående spredningsbredde. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof mål | Konjugeret fluorophore | Dosering | Klon | Isotype | Excitation laser linje | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| C3 | BV650 | 2 μL | SK7 | Mus IgG1, κ | Violet | 407 | 650 |
| Cd4 | BUV395 | 2 μL | SK3 | Mus IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| Cd8 | BV421 | 2 μL | SK1 | Mus IgG1, κ | Violet | 407 | 421 |
| Cd27 | BUV737 | 2 μL | L128 | Mus IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 μL | Uchl1 | Mus IgG2a, κ | Violet | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 μL | 3D12 | Rotte IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 μL | HI100 | Mus IgG2b, κ | Violet | 436 | 478 |
| Cd107a | BV605 | 2 μL | H4A3 | Mus IgG1, κ | Violet | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 | 2 μL | MQ1-17H12 | Rotte IgG2a, κ | Violet | 407 | 786 |
| IFN-γ | Faktaboks | 2 μL | 4S. B3 | Mus IgG1, κ | Blå | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 μL | MAb11 | Mus IgG1, κ | Gul-grøn | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 μL | 11A3 | Mus IgG2a, κ | Rød | 650 | 660 |
| Zombie NIR | APC-Cy7 | 1 μL | - | - | Rød | 650 | 779 |
Tabel 1: Farvefluorescerende antistoffarvningsprotokol til flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende violet; BUV = strålende ultraviolet; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Kompensationsreference for flowcytometri (%) | ||||||||||||
| Faktaboks | APC | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| Faktaboks | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabel 2: Parametrene for kompensation for flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende violet; BUV = strålende ultraviolet; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Gruppe af TPF | Polyfunktionel karakterisering (%) | |||||||
| Stimulus | Cd107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T-celler | T CM | Vaccineret | JEV | 1.50±0,48 | 1.60±0,69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0,31±0,13 | 0,28±0,13 | 0,37±0,20 | 0.02±0.05 | |||
| Uvaccinerede | JEV | 0,38±0,19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0,23±0,14 | 0.08±0.11 | |||
| P-værdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| T EM | Vaccineret | JEV | 1.47±0,58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0,33±0,31 | 0,24±0,17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0,39±0,15 | 0,16±0,18 | 0,23±0,256 | 0.09±0.21 | |||
| Uvaccinerede | JEV | 0,41±0,25 | 0.14±0.09 | 0,15±0,11 | 0.20±0.07 | 0,15±0,13 | ||
| Ctrl | 0,34±0,13 | 0,21±0,15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| P-værdi* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T-celler | T CM | Vaccineret | JEV | 1.55±0,43 | 1.16±0.24 | 0,57±0,25 | 0,29±0,18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| Uvaccinerede | JEV | 0.28±0.08 | 0,21±0,08 | 0.17±0.03 | 0,21±0,16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0,31±0,13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| P-værdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| T EM | Vaccineret | JEV | 1.54±0,58 | 1.33±0.15 | 0,89±0,25 | 0,37±0,22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0,46±0,49 | 0.35±0.30 | 0,13±0,08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| Uvaccinerede | JEV | 0.27±0.09 | 0,23±0,10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0,14±0,06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0,24±0,14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| P-værdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Mann-Whitney U-test, PBMC'er fra vaccineret individ stimuleret af JEV vs. PBMC'er fra uvaccinerede personer stimuleret af JEV blev kun vist. | ||||||||
Tabel 3: Polyfunktionel karakterisering af TCM og TEM af CD4 + eller CD8 + T-celleresponser på JEV. Vaccineret, n = 5; uvaccineret, n = 5. Resultaterne udtrykkes som middel ± SD. P < 0,05 indikerede en signifikant forskel. * PBMC'er fra vaccinerede personer stimuleret af JEV versus PBMC'er fra uvaccinerede personer, der kun stimuleres af JEV, vises. Forkortelser: TPFs = polyfunktionelle T-celler; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = tumornekrosefaktor-α; IL-2 = interleukin-2; MIP-1α = makrofag inflammatorisk protein-1α; TCM = centrale hukommelse T-celler; TEM = effektor hukommelse T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol repræsenterer en gennemførlig flowcytometribaseret detektionsmetode for TPF-profiler i PBMC'erne hos børn, der er vaccineret med JEV-vaccinen SA14-14-2. Denne undersøgelse brugte venøst blod PBMC'er fra både vaccinerede og uvaccinerede børn som forskningsmaterialer. Med stimulering af PBMC'er med JEV-antigenet kan de forstærkede antigenspecifikke TPF'erkarakteriseres ved flerfarvet flowcytometriantistoffarvning. Sammenlignet med den konventionelle enzymbundne immunospot-assaymetode er flowcytometriens enestående fordel at præsentere de funktionelle egenskaber ved PBMC'er på enkeltcelleniveau så forskelligt som muligt, hvilket reducerer antallet af PBMC'er, der kræves til påvisning, hvilket er særligt velegnet til børn.
En klar vaccinationshistorie, opretholdt cellelevedygtighed, stimulatorens T-celleimmunogenicitet og kompatible farvematchningsstrategier er kritiske trin i denne protokol. Kina har indarbejdet vaccinationen af JEV SA14-14-2 i det nationale udvidede immuniseringsprogram siden 2008 og har inkluderet vaccinationshistorien i samlet forvaltning, som er blevet tilgængelig for tilgængeligheden af vaccinehistorien3. De PBMC'er, der blev undersøgt i denne protokol, blev eksperimentelt holdt på is for at opretholde maksimal cellelevedygtighed. Brugen af specifikke stimuli har tidligere vist sig at være effektiv 4,5,21,22. Farvetilpasningsstrategien er den vigtigste begrænsning i denne metode, og anvendeligheden af denne strategi er blevet præsenteret i den kontinuerlige forfining før testen og instrumentparametermatchning. Derudover gav denne protokol to muligheder for at kommentere hukommelses-T-cellerne. Gennem ovenstående konfiguration og optimering af de eksperimentelle parametre kan det være muligt at måle specifik og endda krydsreaktiv immunitet ved at vurdere omfanget og hyppigheden af TPF-responser på vaccination ved flowcytometri. De fem repræsentative indikatorer til karakterisering af TPF'erer imidlertid en begrænsning af denne undersøgelse; de nuværende almindelige funktionelle molekyler (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 og MIP-1α) kan udvides til at detektere spektret for mere fuldstændigt at karakterisere alsidigheden af TPFs baseret på den præsenterede protokol.
JEV-infektion betragtes som en vaccinationsforebyggelig sygdom, hvor vaccinationsfremkaldede hukommelses-T-celleresponser kan være kritiske for at opretholde langvarig immunbeskyttelse, især da antistofresponser aftager over tid4. Som den vigtigste totipotente beskyttende komponent i hukommelses-T-celler bør TPFs foreslås som et rutinemæssigt testpunkt til evaluering af vaccineeffektivitet og omvendt styre design og udvikling af målrettede T-cellevacciner. Faktisk bliver T-celleimmunitetens rolle i flavivirusinfektionskontrol i stigende grad værdsat, og det kan endda omgå antistoffernes rolle på godt og ondt5. Afklaringen af TPF-profilen vil utvivlsomt yderligere indsnævre repertoiret af antigene epitoper, hvilket nødvendigvis vil reducere omkostningerne ved vacciner ved at forbedre målretningen. De synergistiske virkninger af CD4 + og CD8 + T-celler supplerer hinanden og er utvivlsomt mere fremtrædende på TPF'er. Det foreslås derfor, at undersøgelser af T PF fokuserer på (1) profilforskelle mellem lang- og kortsigtedeT-PF'er; 2) identifikation af HLA-begrænsede T PF-epitoper og (3) udforskning og forskning af mere polyfunktionelle subpopulationer.
Identifikation af TPF-celler i immunkontrol af virusinfektion var blevet rapporteret23,24,25. Beskrivelsen af den komplette detektionsstrategi og proces for TPFs har imidlertid ikke været velorganiseret. Desuden gælder denne metodes farveskema for flere flowcytometermodeller. Markørerne kan også justeres for at registrere andre funktionelle undergrupper baseret på denne farvetilpasning.
Denne undersøgelse gav en T PF-detektionsstrategi ved at kombinere ex vivo-specifik stimulering og flowcytometri for at analysere TPF-delmængdeprofiler i PBMC'erne hos JEV-vaccinemodtagere. De isolerede PBMC'er blev først stimuleret med JEV-antigenet og derefter farvet med de tilsvarende fluorescerende mærkede antistoffer, og JEV-specifikke CD4 + og CD8 + hukommelse TPF'erblev karakteriseret ved flowcytometri. Baseret på dette resultat kan T PF-frekvenserne for dobbelt-, tredobbelt-, firdobbelt- og femdobbeltfunktioner beregnes yderligere for at beskrive TPF'er mere detaljeret ogmere omfattende. Rutinemæssige venøse blodvolumener (2 ml) hos børn har vist sig at være tilstrækkelige til TPF-undersøgelser. Derfor forventes detektionsmetoderne for virusspecifikke TPF'erat blive brugt til at undersøge målinger af T-cellemedieret adaptiv immunitet forbundet med vaccination eller infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
R.W. blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. blev støttet af CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
