Summary
Клинический микрофлюидный чип является важным методом биомедицинского анализа, который упрощает предварительную обработку образцов крови клинического пациента и иммунофлуоресцентно окрашивает циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) in situ на чипе, что позволяет быстро обнаруживать и идентифицировать один ЦОК.
Abstract
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перепись ЦОК имеет жизненно важное значение для определения заболевания пациента, поскольку ЦОК редки и неоднородны. ЦОК отделяются от первичной опухоли, попадают в систему кровообращения и потенциально растут в отдаленных местах, тем самым метастазируя опухоль. Поскольку ЦОК несут информацию, аналогичную первичной опухоли, выделение ЦОК и последующая характеристика могут иметь решающее значение для мониторинга и диагностики рака. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они обеспечивают необходимые элементы с высокой чувствительностью. Микрофлюидные чипы предлагают метод жидкой биопсии, который не вызывает боли у пациентов. В этой работе мы представляем список протоколов для клинических микрофлюидных чипов, универсальной платформы для выделения ЦОК, которые включают в себя набор функций и сервисов, необходимых для разделения, анализа и ранней диагностики ЦОК, тем самым облегчая биомолекулярный анализ и лечение рака. Программа включает в себя подсчет редких опухолевых клеток, предварительную обработку крови клинического пациента, которая включает лизис эритроцитов, а также выделение и распознавание ЦОК in situ на микрофлюидных чипах. Программа позволяет точно подсчитывать опухолевые клетки или CTCs. Кроме того, программа включает в себя инструмент, который включает в себя выделение CTC с помощью универсальных микрофлюидных чипов и иммунофлуоресцентную идентификацию in situ на чипах с последующим биомолекулярным анализом.
Introduction
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перечисление CTC имеет жизненно важное значение, поскольку CTC редки и неоднородны. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они содержат необходимые элементы с высокойчувствительностью1. Редкое количество опухолевых клеток, смешанных с нормальной кровью, очень близко имитирует настоящую кровь пациента, так как 2-3 мл настоящей крови пациента содержат только 1-10 ЦОК. Для решения критической экспериментальной задачи вместо использования большого количества опухолевых клеток, введенных в PBS или смешанных с нормальной кровью, использование редкого количества опухолевых клеток обеспечивает нам низкое количество клеток крови, что ближе к реальности при проведении эксперимента.
Рак является основной причиной смерти в мире2. ЦОК представляют собой опухолевые клетки, выделяющиеся из исходной опухоли, которые циркулируют в системах кровообращения и лимфатического кровообращения3. Когда ЦОК перемещаются в новую среду обитания, они растут как вторая опухоль. Это называется метастазированием и является причиной 90% смертей у онкологических больных4. ЦОК жизненно важны для прогнозирования, ранней диагностики и понимания механизмов развития рака. Однако ЦОК крайне редки и неоднородны в крови пациента 5,6.
Микрофлюидные чипы обеспечивают жидкостную биопсию, которая не проникает в опухоль. Их преимущество заключается в том, что они портативны, недороги и имеют масштабы, соответствующие ячейкам. Выделение ЦОК с микрофлюидными чипами классифицируется в основном на два типа: аффинные, основанные на связывании антиген-антитела 7,8,9 и являющиеся оригинальным и наиболее широко используемым методом выделения ЦОК; и физические чипы, которые используют различия в размерах и деформируемости между опухолевыми клетками и клетками крови 10, 11, 12, 13, 14, 15, не имеют меток и просты в эксплуатации. Преимущество микрофлюидных чипов перед альтернативными методами заключается в том, что физический подход к многоэллипсным микрофильтрам надежно улавливает CTC с высокой эффективностью улавливания. Причина этого заключается в том, что эллипсовые микростолбы организованы в узкие туннели разрывов между линиями. Межлинейные зазоры отличаются от традиционных точечных зазоров, образованных микростолбами, такими как ромбовые микростолбы. Захват CTC на основе волнового чипа сочетает в себе изоляцию на основе физических свойств и изоляцию на основе сходства. Захват на основе волнового чипа включает в себя 30 волнообразных матриц с антителом анти-EpCAM, покрытым круглыми микроштифтами. CTC улавливаются маленькими зазорами, а большие зазоры используются для ускорения скорости потока. Пропущенные CTC должны пройти через небольшие зазоры в следующем массиве и захватываются изоляцией на основе сходства, интегрированной в микросхему16.
Целью протокола является демонстрация подсчета редкого количества опухолевых клеток и клинического анализа ЦОК с помощью микрофлюидных чипов. Протокол описывает этапы выделения ЦОК, способы получения низкого количества опухолевых клеток, клиническое физическое разделение фильтров с малым эллипсом, фильтров с большим эллипсом и трапециевидных фильтров, модификацию сродства и обогащение17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы крови пациентов были предоставлены больницей Лунхуа, аффилированной с Шанхайским медицинским университетом.Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований на людях Третьей больницы Пекинского университета. От пациентов было получено информированное согласие на использование образцов в исследовательских целях.
1. Предварительный эксперимент по проверке эффективности захвата культивируемыми опухолевыми клетками
- Культивирование опухолевых клеток MCF-7, MDA-MB-231 и HeLa для определения эффективности захвата. Разбавляют суспензию опухолевых клеток, подсчитывают количество опухолевых клеток и повторяют до тех пор, пока не будет получено желаемое количество клеток в 1 мл PBS.
- Культивирование клеток в колбе для клеточных культур с начальным количеством клеток ~ 1 x 105 клеток в 1 мл модифицированной среды Игла (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина. Инкубируют во влажной атмосфере при температуре 37 °C с содержаниемСО2 5%.
- Когда клеточные линии вырастут в виде адгезивных монослоев до слияния 95%, отделите их от культуральных чашечек 0,25% раствором трипсина в течение 2 мин, как описано в Chen et al.16.
- Окрасьте опухолевые клетки кальцеином АМ. Поместите 3 мкл кальцеина AM в чашку для закваски и держите чашку в инкубаторе в течение 30 минут. Затем переварите все клетки трипсином.
- Подсчитывают культивируемые опухолевые клетки в PBS с помощью камеры подсчета клеток и разводят до получения 100 опухолевых клеток на 1 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы точно перечислить количество клеток, возьмите 50 мкл полученной клеточной суспензии, чтобы с помощью микроскопа увидеть, сколько в ней опухолевых клеток или нет. Определите объем клеточной суспензии, который необходимо взять для получения 100 опухолевых клеток, в соответствии с фактическим количеством опухолевых клеток в 50 мкл клеточной суспензии.
- Вводят клеточную суспензию, содержащую 100 опухолевых клеток на 1 мл PBS, в микрофлюидный чип с помощью шприца со шприцевым насосом с переменной скоростью потока 0,5 мл/ч, 1 мл/ч, 2 мл/ч, 3 мл/ч, 4 мл/ч и 5 мл/ч. Получите эффективность улавливания для различных скоростей потока и определите оптимальный расход.
- Подсчитайте количество опухолевых клеток, захваченных на чипе и вытекающих из выходного отверстия. Рассчитайте эффективность захвата, как показано ниже:
Эффективность захвата = Количество захваченных ячеек/(Количество захваченных ячеек + количество вытекающих ячеек) × 100% - Повторите процедуру, чтобы получить эффективность захвата для разного количества опухолевых клеток от 10 до 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- Подсчитайте количество опухолевых клеток, захваченных на чипе и вытекающих из выходного отверстия. Рассчитайте эффективность захвата, как показано ниже:
- Протестируйте и подтвердите микрофлюидный чип на наличие редкого количества опухолевых клеток. Введите эти 10 образцов суспензии в микрофлюидные чипы с помощью полой иглы, изготовленной с помощью съемника микропипетки, для аспирации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток, разведенных в 1 мл PBS. Обнаружение и подсчет количества опухолевых клеток для каждого образца после их захвата на чипе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полая игла имеет длину около 3 см и внешний диаметр 1 мм. - Проведите клиническое предэкспериментальное тестирование опухолевых клеток, попавших в нормальные образцы крови.
- Окрасьте опухолевые клетки кальцеином AM, а затем переборите 100 опухолевых клеток в 5 мкл PBS. Поместите эти клетки в 1 мл образца цельной нормальной крови. Введите эти клетки в чип и переборщите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью зеленой иммунофлуоресценции. Выполните перебор in vivo на чипе, как описано выше, и рассчитайте эффективность захвата после захвата.
- Повторите шаг 1.4.1 для девяти дополнительных концентраций номеров опухолевых клеток от 10 до 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Перечислите 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток, как описано в шаге 1.3, без окрашивания, добавьте 1 мл цельной нормальной крови, введите эти образцы в микрофлюидный чип и захватите опухолевые клетки на чипе.
- Пятно на чипе с помощью Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. В 20-30 мкл PBS вносят 3-5 мкл флуоресцентного красителя, а затем шприцем вводят этот раствор на микрофлюидный чип. Перечислите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью синей и зеленой иммунофлуоресценции, чтобы определить эффективность захвата.
- Выполнить модификацию микрофлюидного чипа для захвата анти-EpCAM на основе сродства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку волновой чип сочетает в себе изоляцию, основанную как на сродстве, так и на физических свойствах, модифицируйте чип с помощью агентов.- Модифицируют поверхность чипа 100 мкл 4% (v/v) 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле при комнатной температуре в течение 45 мин. Вводите этот раствор в стружку осторожно и медленно, чтобы он не разрушил внутреннюю структуру чипа, особенно склеивание верхней поверхности и стекла подложки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность стружки модифицирована с помощью меркаптосилана. Взаимодействия, происходящие на чипе, определяются химическими связями. Химические связи устанавливаются для реализации связывания антитела, модифицированного антигеном. Внутри чипа модифицируются различные реагенты для создания химических связей, которые соединяются друг с другом. Последним реагентом, подлежащим модификации, является молекула антиэпителиальной адгезии (anti-EpCAM). Поверхностный антиген опухолевых клеток EpCAM соединяется с анти-EpCAM внутри чипа, чтобы реализовать захват CTCs. - Промыть этанолом 3 раза. Добавьте 100 мкл связующего агента N-y-малеимидобутирилоксисукцинимида эфира (GMBS, 1 мкМ) на чип и дайте ему взаимодействовать в течение 30 минут.
- Стирайте с помощью PBS 3x. С помощью шприца введите 1 мл PBS на чип для промывки.
- Обработайте чип 30-40 мкл 10 мкг/мл нейтравидина при комнатной температуре в течение 30 мин, что приведет к иммобилизации клеток на GMBS, а затем промойте PBS для удаления избытка авидина.
- Модифицируйте чип 3 мкл антибиотинилированного антитела EpCAM в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл PBS с 1% (w/v) BSA. Оставьте это на ночь.
- Модифицируют поверхность чипа 100 мкл 4% (v/v) 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле при комнатной температуре в течение 45 мин. Вводите этот раствор в стружку осторожно и медленно, чтобы он не разрушил внутреннюю структуру чипа, особенно склеивание верхней поверхности и стекла подложки.
2. Клинический эксперимент на чипе для подсчета циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК)
- Предварительную обработку образцов крови пациентов с клиническим раком с помощью раствора лизиса эритроцитов (RBCL) или введение 2-3 мл образца крови непосредственно на микрофлюидный чип с помощью шприца.
- Выполните предварительную обработку, которая занимает около 30 минут. Соберите образцы цельной крови в пробирки с антикоагулянтами. Добавьте 6-9 мл раствора лизиса RBS в 2-3 мл крови. Центрифугу при 111 х г в течение 5-8 мин при комнатной температуре и слейте верхний слой красной прозрачной жидкости.
- Захватите, окрасьте, распознайте и перечислите ячейки на чипе, как описано ниже.
- Захватите клетки на чипе, как описано в шаге 1.Окрасьте чип для CTC, захваченных с помощью Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. CK-FITC является специфическим красителем для опухолевых клеток, а CD45-PE — для белых кровяных телец.
- Добавьте 3 мкл CK-FITC к 20 мкл PBS. Введите его в шприц и закачайте разбавленный CK-FITC на чип. Оставьте на 30 минут. Введите 300 мкл PBS на чип, чтобы промыть чип.
- Добавьте 3 мкл CD45-PE к 20 мкл PBS. Введите его в шприц и закачайте разбавленный CD45-PE на чип. Дать постоять 30 минут. Введите 300 мкл PBS на чип, чтобы промыть чип.
- Идентификация ЦОК с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при 20-кратном или 40-кратном увеличении. ЦОК излучают как синюю, так и зеленую флуоресценцию, а лейкоциты (лейкоциты) излучают как синюю, так и красную флуоресценцию. Определите ЦОК с синей и зеленой флуоресценцией, а лейкоциты с синей и красной флуоресценцией.
- По иммунофлуоресцентным изображениям перечислите количество ЦОК, захваченных на чипе. Перечислите CTC как Hoechst+/CK-FITC+/CD45−, а лейкоциты как Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
- Обогатите захваченные CTC путем промывки PBS через шприц в обратном направлении на микрофлюидный чип для сбора CTC, захваченных на чипе из входного отверстия. Используйте шприц с 1 мл PBS, вводите его из выходного отверстия для обогащения CTCs, захваченных на чипе, в течение 2-3 мин, и собирайте их из входного отверстия. Используйте 1 мл PBS для каждого этапа стирки и повторите 3 раза.
- Окрасьте опухолевые клетки или CTCs, захваченные на микрофлюидном чипе, как описано ниже.
- Окрашивание с помощью кальцеина АМ. Добавьте 5 мкл кальцеина AM к 20 мкл PBS, окрасьте клетки в течение 30 мин, затем центрифугируйте при 111 x g в течение 2 минут при комнатной температуре для получения опухолевых клеток и суспендируйте в 1 мл PBS.
- Для идентификации клеточных ядер необходимо добавить в чип 20 мкл раствора DAPI (10 мкл реагента DAPI в 20 мкл PBS) при оптимальном расходе 1 мл/ч для крупноэллипсовых микрофильтров и 1,5 мл/ч для трапециевидных. Пропустить через 20 мкл исходного раствора антицитокератина (3 мкл антицитокератиновых антител в 20 мкл PBS) для реакции с чипом в течение 30 мин.
- Окрасьте лейкоциты, захваченные на чипе. После того, как CTCs будут захвачены на чипе, добавьте 25 мкл раствора антител к CD45 (5 мкл раствора анти-CD45 в 20 мкл PBS) к чипу и оставьте на 30 минут. Промывают PBS и идентифицируют эпителиальные клетки с синей и зеленой флуоресценцией.
- Выполните иммунофлуоресцентную идентификацию с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано ниже.
- Используйте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец синим лазером. Найдите клетки, излучающие синюю флуоресценцию, которые являются ядрообразными клетками. Используйте одно из следующих увеличений: 10x, 20x или 40x. Найдите чистое поле для опухолевой клетки. Для синего лазерного источника используйте длину волны пластины возбуждения 420-485 нм и длину волны эмиссионной пластины 515 нм.
- Не перемещая образцы, используйте другой лазерный источник. Вращайте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец зеленым лазером. Найдите клетки, излучающие зеленую флуоресценцию, что свидетельствует об опухолевых клетках. Делайте снимки одного и того же поля с тем же увеличением с помощью этого зеленого лазерного источника. Клетки, излучающие как синюю, так и зеленую флуоресценцию, распознаются как опухолевые клетки. Для зеленого лазерного источника используйте длину волны пластины возбуждения 460-550 нм и длину волны эмиссионной пластины 590 нм
- Не перемещая образцы, используйте другой лазерный источник. Вращайте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец красным лазером. Найдите клетки, излучающие красную флуоресценцию. Сделайте снимки одного и того же поля с тем же увеличением с помощью этого красного лазерного источника. Клетки, которые излучают как синюю, так и красную флуоресценцию, распознаются как белые кровяные тельца.
- Сохраните изображение, полученное с помощью каждого из указанных выше источников лазерного излучения. Сделайте несколько снимков одного и того же поля с разными цветными огнями.
- Используйте ультрафиолетовый свет с длиной волны пластины возбуждения 330-400 нм и длиной волны эмиссионной пластины 425 нм. Используйте фиолетовый свет с длиной волны пластины возбуждения 395-415 нм и длиной волны эмиссионной пластины 455 нм.
- Рассчитайте эффективность захвата, как показано на шаге 1.2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вся установка включает в себя шприцевой насос, шприц и микрофлюидный чип. Клеточная суспензия в шприце соединяется со шприцевым насосом, и клеточная суспензия вводится в микрофлюидный чип для захвата клеток. Эффективность захвата для всех используемых микрофлюидных чипов составила около 90% или выше. Для волнового чипа мы спроектировали микроструктуры с различными зазорами. Малые зазоры используются для захвата CTC, а большие зазоры используются для ускорения скорости потока. Клеточная суспензия быстро течет в больших зазорах. Пропущенные CTC, как правило, захватываются небольшими пробелами в последующем массиве16. Для чипов эллипса мы разработали зазоры между линиями вместо зазоров между точками и точками, чтобы сформировать тонкий туннель для улучшения захвата. Таким образом, была достигнута высокая эффективность захвата1. Мы разработали эллипсовую структуру, чтобы избежать краев и углов, чтобы сохранить жизнеспособность. Трапециевидные фильтры имеют два круглых спиральных канала со встроенными трапециевидными и круговыми микростолбовыми барьерами. Для трапециевидных фильтров эффективность улавливания для MCF-7, MDA-MB-231 и HeLa составила 94%, 95% и 93% соответственно18.
На рисунке 1 видно, что все опухолевые клетки были захвачены волновым чипом. Поскольку все опухолевые клетки были сконцентрированы вокруг массива волновых микропостов, это указывает на высокую эффективность захвата этого микрофлюидного чипа, о чем свидетельствует количество захваченных опухолевых клеток. Таким образом, такая установка значительно облегчает захват редких опухолевых клеток; Действительно, чип изготовлен для захвата большого количества опухолевых клеток, а также редкого количества опухолевых клеток. Например, если чип достаточно прочный или воспроизводимый, чтобы захватить 10 000 опухолевых клеток, чипу легко захватить 10-100 клеток. На видео 1 показано, как было получено редкое количество опухолевых клеток для предварительного эксперимента. Полая игла, изготовленная с помощью съемника микропипетки, использовалась для аспирации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток из чашки с разбавленными опухолевыми клетками, окрашенными кальцеином AM в PBS. Клетки поглощались силикагелевой трубкой, соединенной с полой иглой. Опухолевую клетку с зеленым иммунофлуоресценцией отсасывали в полую иглу. Вдувание в полую пробирку приводило к тому, что опухолевая клетка внутри полой иглы выгружалась в микроцентрифужную пробирку1. Это процедура получения редких опухолевых клеток. На рисунке 2 показаны ЦОК пациента с раком желудка, полученные с помощью микрофильтров с малым эллипсом. На рисунке 3 показаны ЦОК пациента с колоректальным раком, полученные с помощью трапециевидных микрофильтров и излучающие как синюю, так и зеленую флуоресценцию. На рисунке 4 показаны опухолевые клетки, выращенные на чипе после захвата, которые готовы к лечению противораковым препаратом. Эти результаты показывают, что микрофильтры с большим эллипсом не оказывают никакого негативного влияния на жизнеспособность клеток.
На рисунке 5 показан клинический иммунофлуоресцентный анализ колоректальных ЦОК, захваченных на микрофлюидном чипе. Они видны в светлом поле и окрашены окрашиванием Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. CTCs были идентифицированы как DAPI+/CK+/CD45−, а лейкоциты были идентифицированы как DAPI+/CK−/CD45+. На рисунке 6 показаны клетки колоректальной опухоли, культивируемые на чипе большого эллипса после захвата. На рисунке 7 показаны клетки колоректальной опухоли, захваченные на микрофильтрах большого эллипса. Клинически ЦОК в крови пациента улавливались волновыми чипами, трапециевидными микрофильтрами и микрофильтрами с большим эллипсом, что указывает на то, что эти три чипа успешно захватывают ЦОК. Потенциально они могут быть применены в продуктах СТК, таких как продукты для выделения ЦОК, с высокой эффективностью.
Рисунок 1: Захват волнового чипа. Все опухолевые клетки MCF-7 были захвачены вокруг массива волнового чипа без каких-либо отсутствующих клеток. Поскольку ни в одной другой области, кроме матрицы, не было никаких опухолевых клеток, это говорит о высокой эффективности захвата чипа. Было захвачено большое количество опухолевых клеток. Таким образом, редкие опухолевые клетки также могут быть легко захвачены. Опухолевые клетки MCF-7 захватывали волновым чипом и (А) окрашивали Хёхстом и (Б) окрашивали кальцеином АМ. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Клинический образец ЦОК, захваченный микрофильтрами с малым эллипсом. Клинические ЦОК пациента с раком желудка, захваченные микрофильтрами с малым эллипсом. ЦОК были идентифицированы в светлом поле и с синей и зеленой флуоресценцией. Синий кружок на рисунке (А) обозначает КТК пациента с раком желудка, захваченный внутри чипа. На сделанных снимках видно, что ни в каких других областях не было других ячеек, что указывает на высокую чистоту захвата для этого чипа. Опухолевые клетки MCF-7 захватывали мелкоэллипсовыми микрофильтрами и наблюдали в (А) светлопольном поле, (Б) окрашивали по Хёхсту и (В) окрашивали КФК-FITC. Масштабная линейка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Клинический образец ЦОК, захваченных трапециевидными микрофильтрами. Клинические ЦОК пациента с колоректальным раком улавливали трапециевидными микрофильтрами. На этих изображениях видно, что было захвачено шесть CTC, что указывает на высокую эффективность захвата на небольшом поле. Кроме того, никаких других ячеек не появилось, что указывает на то, что чистота захвата была чрезвычайно высокой для этого чипа. Опухолевые клетки MCF-7 захватывали трапециевидными микрофильтрами и наблюдали в (А) светлом поле, (Б) окрашивали по методу Хёхста и (В) окрашивали КФК-ФИТК. Масштабная линейка: 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Культура ЦОК, захваченных крупноэллипсовыми микрофильтрами. Опухолевые клетки MCF-7 захватывали большими эллипсовыми микрофильтрами перед массивом больших эллипсовых микропостов. Ни одна опухолевая клетка не прошла через матрицу, что указывает на высокую эффективность захвата для этого чипа. После захвата опухолевые клетки росли в течение 24-48 ч. Это указывает на то, что эффективность улавливания и жизнеспособность были очень высокими для микрофильтров с большим эллипсом. Культивируемые опухолевые клетки MCF-7 захватывали с помощью микрофильтров с большим эллипсом и наблюдали через (A) 0 ч после захвата, (B) через 24 ч после захвата и (C) через 48 ч после захвата. Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример клинического образца, используемого для захвата ЦОК трапециевидными микрофильтрами. Клинические ЦОК пациента с колоректальным раком улавливали трапециевидными микрофильтрами. На этих изображениях видно, что были захвачены два CTC, что указывает на высокую эффективность захвата. Никаких других клеточных нарушений, кроме остатков эритроцитов в чипе, не было. Таким образом, для клинической предварительной обработки захвата ЦОК лучше не использовать лизис эритроцитов. ЦОК колоректального рака улавливали трапециевидными микрофильтрами и наблюдали в (A) светлом поле, (B) окрашивали по Hoechst, (C) окрашивали CK-FITC и (D) видели на объединенных изображениях. Масштабная линейка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Пример культивируемых CTC, захваченных чипом с большим эллипсом. Культуры опухолевых клеток клеток MCF-7 перед массивом микропостов с большим эллипсом и за микрофильтрами с большим эллипсом. Опухолевые клетки, окрашенные кальцеином AM, излучающим зеленую флуоресценцию, росли так, как хотелось, что указывает на то, что жизнеспособность клеток для этого чипа была очень высокой. Всего было 15 массивов, с различными промежутками для каждого массива, организованными микропостами большого эллипса. Опухолевые клетки MCF-7 культивировали на чипе большого эллипса после захвата (А) в одном массиве и (Б) в другом. Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Пример клинического образца, используемого для захвата ЦОК с помощью крупноэллипсовых микрофильтров. Клинические ЦОК от пациента с колоректальным раком улавливали с помощью микрофильтров с большим эллипсом. На снимках видно, что произошло загрязнение эритроцитами. Это указывает на то, что образец крови пациента должен быть разбавлен, а чип должен быть промыт после захвата. ЦОК образцов крови пациентов с клиническим колоректальным раком были захвачены на чипе большого эллипса и видны в (A) светлом поле, (B) окрашены Hoechst и (C) окрашены CK-FITC. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прогноз и ранняя диагностика рака оказывают существенное влияние на лечение рака1. Изоляция ЦОК с помощью микрофлюидных чипов обеспечивает жидкостную биопсию без инвазии. Однако ЦОК крайне редки и неоднородныв крови1, что затрудняет выделение ЦОК. ЦОК обладают свойствами, аналогичными исходным источникам опухоли, из которых они происходят. Таким образом, ЦОК играют жизненно важную роль в метастазировании рака1.
Предложенный протокол позволяет провести полный анализ изоляции СТС с микрофлюидным чипом. Протокол включает в себя все ключевые процедуры, связанные с изоляцией СТС. Например, этот протокол включает в себя анализ эритроцитов, который тщательно записывается и организуется в различные пакеты, получение редких опухолевых клеток, определение оптимальной скорости потока, эффективность захвата, клиническую характеристику и перечисление. Тщательное управление операциями облегчает обработку клинических образцов пациента. Протокол позволяет проводить предварительную обработку и обработку клинических образцов пациентов и предлагает жизненно важные услуги для врачей.
Для выделения ЦОК предварительную обработку редких опухолевых клеток выполнить крайне сложно. Эта трудность была решена путем использования полой иглы, протянутой через съемник иглы, для всасывания 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток по желанию. Затем был подготовлен образец крови пациента, близкий к настоящему, с желаемым количеством опухолевых клеток, смешанных с нормальной кровью, имитируя образец крови пациента. С этими искусственными образцами крови пациентов был проведен эксперимент, близкий к реальному. Этот метод позволил решить сложную задачу, обычно возникающую при изоляции ЦОК для предварительных экспериментов. Такой подход непрост в исполнении, и о нем никогда не сообщалось где-либо еще; Тем не менее, это полезный подход перед проведением реального клинического эксперимента.
Выделение ЦОК микрофлюидными чипами подразделяется на три типа: аффинные, физические и иммуномагнитные. Для изоляции на основе сродства микрофлюидный чип необходимо модифицировать. Специальные процедуры модификации были включены для модификации с помощью anti-EpCAM. ЦОК идентифицировали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. Поскольку многие опухолевые клетки экспрессируют EpCAM, анти-EpCAM является важным антителом для захвата CTCs в крови пациента. Однако анти-EpCAM стоит очень дорого; Таким образом, для решения этой проблемы было разработано множество аптамеров. Мы в основном используем физические микрофлюидные чипы, такие как микрофильтры с малым эллипсом и трапециевидные микрофильтры, для улавливания CTC, поскольку они просты, удобны в эксплуатации и эффективны.
Преимущество этого метода перед альтернативными методами заключается в том, что физический чип крупноэллипсовых микрофильтров надежно улавливает CTC с высокой эффективностью захвата. Причина этого заключается в том, что существуют узкие туннели разрывов между линиями. Волновые чипы захватывают CTC, сочетая изоляцию на основе физических свойств и изоляцию на основе сходства. CTC улавливаются маленькими зазорами, а большие зазоры могут быть использованы для ускорения скорости потока. Пропущенные CTC должны проходить через небольшие пробелы в следующих массивах, а также захватываться изоляцией на основе сходства.
Протокол решил несколько основных проблем в изоляции ЦОК, особенно для клинических экспериментов. Тем не менее, невозможно подробно описать все этапы выделения ЦОК, например, в отношении роли наночастиц и наноструктур и модификации аптамеров. Эти аспекты также играют существенную роль в изоляции СТС. Однако они не являются критичными для решения таких задач, как повышение эффективности улавливания. Вместо этого эти аспекты обогащают изоляцию CTC новым содержанием.
Эта работа концентрируется на клинической изоляции ЦОК с помощью разработанного микрофлюидного чипа. Большинство используемых микрофлюидных чипов в основном имеют физическую основу, например, фильтры с большим эллипсом и фильтры с малым эллипсом. Волновые чипы создаются путем объединениясвойств чипов, основанных как на сходстве, так и на физических свойствах 1. Микроштифты фильтров с большим эллипсом были спроектированы так, чтобы быть короче, чтобы повысить чистоту захвата в этой работе. Фильтры с малым эллипсом также можно улучшить, спроектировав их с различными размерами микропостов для разных массивов. Волновые чипы можно улучшить, добавив больше массивов для улучшения захвата.
Широкоэллипсовые фильтры организованы с длинными эллиптическими микроштифтами, образующими линейные туннели, обеспечивающие высокую эффективность улавливания. Однако ограничением этого захвата является то, что чистота захвата недостаточно высока или высокая чистота захвата нелегко получить. Для волнового чипа небольшие зазоры используются для захвата CTC, а пропущенные CTC захватываются следующими массивами. Большие зазоры используются для ускорения скорости потока и устранения помех от эритроцитов, тем самым улучшая чистоту улавливания; Тем не менее, эффективность улавливания составляет более 90% и является воспроизводимой.
Клиническая валидация имеет большое значение при выделении ЦОК с микрофлюидными чипами. В данной работе представлена клиническая изоляция ЦОК от пациентов с колоректальными заболеваниями с помощью фильтров с большим эллипсом, фильтров с малым эллипсом и волновых чипов. Целью разработанных микрофлюидных чипов является клинический перебор ЦОК. Для существующих методов некоторых других систем или платформ эффективность захвата низкая, или эффективность захвата недостаточно высока для эффективного использования метода в клинических приложениях.
Основываясь на клинических характеристиках этих трех микрофлюидных чипов, которые обладают высокой эффективностью захвата, они потенциально могут быть применены в продуктах CTC, особенно после модификации. Сила нашего протокола в том, что он демонстрирует перечисление редкого количества опухолевых клеток для имитации реальных клинических образцов. Кроме того, методика клинического эксперимента осуществима и практична. Этот метод позволяет отделить ЦОК от цельной крови пациента. Таким образом, метод подходит для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта исследовательская работа была поддержана Аньхойским фондом естественных наук Китая (1908085MF197, 1908085QB66), Национальным фондом естественных наук Китая (21904003), Научно-исследовательским проектом Тяньцзиньской комиссии по образованию (2018KJ154), Провинциальной программой естественнонаучных исследований высших учебных заведений провинции Аньхой (KJ2020A0239) и Шанхайской ключевой лабораторией многомерной обработки информации, Восточно-китайской ключевой лабораторией многомерной информации Обработка, Восточно-Китайский педагогический университет (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
