Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Клиническая микрофлюидная чип-платформа для выделения универсальных циркулирующих опухолевых клеток
Summary October 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Клинический микрофлюидный чип является важным методом биомедицинского анализа, который упрощает предварительную обработку образцов крови клинического пациента и иммунофлуоресцентно окрашивает циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) in situ на чипе, что позволяет быстро обнаруживать и идентифицировать один ЦОК.
Transcript
В этом протоколе описан метод подсчета эритроцитарных опухолевых клеток и клинического выделения ЦОК. Для начала культивируют опухолевые клетки MCF-7, MDA-MB-231 и HeLa в колбе для клеточных культур в количестве от 10 до пятой в одном миллиметре DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицина. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.
Когда клеточные линии вырастут в виде адгезивных монослоев до 95%-ного слияния, отделите их от чашки для культивирования 0,25%-ным раствором трипсина на две минуты. Окрасьте опухолевые клетки, добавив три микролитра Calcein AM, и поместите чашку в инкубатор на 30 минут. В конце инкубации переварите все клетки трипсином.
Подсчитывают культивируемые опухолевые клетки в PBS с помощью клеточной счетной камеры и разводят до получения 100 опухолевых клеток на один миллилитр PBS. Далее разбавленную клеточную суспензию вводят в микрофлюидный чип с помощью шприца со шприцевым насосом с переменной скоростью потока. Получите эффективность улавливания для различных скоростей потока и определите оптимальный расход.
Подсчитайте количество опухолевых клеток, захваченных на чипе и вытекающих из выходного отверстия. Рассчитайте эффективность захвата по приведенной формуле. Повторите процедуру, чтобы получить эффективность захвата для разного количества опухолевых клеток, от 10 до 100.
Протестируйте и подтвердите микрофлюидный чип на наличие редкого количества опухолевых клеток. Введите эти 10 образцов суспензии в микрофлюидные чипы с помощью полой иглы, изготовленной из микропипетки, для аспирации разбавленных опухолевых клеток. Обнаружение и подсчет количества опухолевых клеток для каждого образца после их захвата на чипе.
Затем окрасьте опухолевые клетки кальцеином AM и перечислите 100 опухолевых клеток в пяти микролитрах PBS. Поместите эти клетки в один миллилитр цельного нормального образца крови. Введите эти клетки в чип и переборщите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью зеленой иммунофлуоресценции.
Выполните перечисление in vivo, как описано, и рассчитайте эффективность захвата после захвата. Перечислите от одной до 10 опухолевых клеток без окрашивания. Поместите эти клетки в один миллилитр цельной нормальной крови.
Введите эти образцы в микрофлюидный чип и захватите опухолевые клетки. Добавьте три-пять микролитров флуоресцентного красителя в 20-30 микролитров PBS и введите этот раствор на чип с помощью шприца. Перечислите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с синей и зеленой иммунофлуоресценцией, чтобы определить эффективность захвата.
Затем модифицируют поверхность чипа 100 микролитрами 4%3-меркаптопропилтриметоксисилана и этанола при комнатной температуре в течение 45 минут для аффинного захвата молекулы антиэпителиальной клеточной адгезии. По окончании инкубации трижды промойте чипс этиловым спиртом. Затем добавьте 100 микролитров связующего агента GMBS и дайте ему взаимодействовать в течение 30 минут.
В конце инкубации с помощью шприца трижды промыть чип одним миллилитром ПБС. Обработайте чип 30-40 микролитрами 10 микрограммов на миллилитр нейтравидина при комнатной температуре в течение 30 минут, что приведет к иммобилизации клеток на GMBS, а затем промойте PBS, чтобы удалить избыток авидина. Модифицируйте чип тремя микролитрами антитела к молекуле адгезии эпителиальных клеток и инкубируйте в течение ночи.
Все опухолевые клетки были захвачены вокруг массива волнового чипа без каких-либо отсутствующих клеток, что указывает на высокую эффективность захвата микрофлюидного чипа. Здесь показаны опухолевые клетки, окрашенные препаратами Hoechst и Calcein AM. Здесь показаны ЦОК пациента с раком желудка, полученные с помощью небольших эллипсовых микрофильтров.
Кроме того, показаны ЦОК пациента с колоректальным раком, захваченные с помощью трапециевидных микрофильтров и излучающие как синюю, так и зеленую флуоресценцию. Высокая эффективность и жизнеспособность улавливания наблюдались у опухолевых клеток, захваченных с помощью больших эллипсовых микрофильтров. Клинический иммунофлуоресцентный анализ колоректальных ЦОК, зафиксированных на микрофлюидном чипе, определил ЦОК как DAPI-положительные, КФК-положительные, CD45-отрицательные, а лейкоциты как DAPI-положительные, CK-отрицательные, CD45-положительные.
Здесь показаны клетки колоректальных опухолей, культивируемые на чипе большого эллипса после захвата, и клетки колоректальных опухолей, захваченные на микрофильтрах большого эллипса. Этот метод модификации аптамером обеспечивает новый подход к обогащению изоляции ЦОК.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
