Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64679
Automatic Translation
1, 1, 1
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

Summary

В этой работе описывается протокол модульной системы трансгенеза Tol2, метода клонирования на основе шлюза для создания и введения трансгенных конструкций в эмбрионы рыбок данио.

Abstract

Расстройства алкогольного спектра плода (FASD) характеризуются сильно варьирующимся набором структурных дефектов и когнитивных нарушений, которые возникают из-за пренатального воздействия этанола. Из-за сложной патологии ФАСН животные модели оказались критически важными для нашего нынешнего понимания дефектов развития, вызванных этанолом. Рыбки данио-рерио оказались мощной моделью для изучения дефектов развития, вызванных этанолом, из-за высокой степени сохранения как генетики, так и развития между рыбками данио-рерио и людьми. Как модельная система, рыбки данио-рерио обладают многими атрибутами, которые делают их идеальными для исследований развития, включая большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, которые генетически поддаются обработке и полупрозрачны. Это позволяет исследователям точно контролировать время и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах. Одним из важных генетических инструментов, доступных у рыбок данио, является трансгенез. Однако создание трансгенных конструкций и установление трансгенных линий может быть сложным и трудным. Чтобы решить эту проблему, исследователи рыбок данио-рерио создали систему трансгенеза Tol2 на основе транспозонов. Эта модульная система использует многосайтовый подход клонирования шлюза для быстрой сборки полных трансгенных конструкций на основе транспозонов Tol2. Здесь мы описываем гибкий набор инструментов системы Tol2 и протокол для создания трансгенных конструкций, готовых к трансгенезу рыбок данио, и их использования в исследованиях этанола.

Introduction

Пренатальное воздействие этанола приводит к континууму структурных дефицитов и когнитивных нарушений, называемых расстройствами алкогольного спектра плода (FASD)1,2,3,4. Сложные взаимосвязи между несколькими факторами затрудняют изучение и понимание этиологии ФАСН у людей. Для решения этой проблемы были использованы самые разные модели животных. Биологические и экспериментальные инструменты, доступные в этих моделях, оказались решающими в развитии нашего понимания механистической основы тератогенности этанола, и результаты этих модельных систем удивительно согласуются с тем, что было обнаружено в исследованиях этанола на людях 5,6. Среди них рыбки данио-рерио стали мощной моделью для изучения тератогенезаэтанола 7,8, отчасти из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической обрабатываемости и полупрозрачных эмбрионов. Эти сильные стороны в совокупности делают рыбок данио-рерио идеальными для исследований ФАСН в реальном времени с использованием трансгенных линий рыбок данио.

Трансгенные рыбки данио-рерио широко используются для изучения многочисленных аспектов эмбрионального развития9. Однако создание трансгенных конструкций и последующих трансгенных линий может быть чрезвычайно трудным. Стандартный трансген требует активного промоторного элемента для управления трансгеном и поли-А-сигнала или «хвоста», и все это в стабильном бактериальном векторе для общего поддержания вектора. Традиционная генерация многокомпонентной трансгенной конструкции требует нескольких трудоемких этапов субклонирования10. Подходы, основанные на ПЦР, такие как сборка Гибсона, могут обойти некоторые проблемы, связанные с субклонированием. Тем не менее, уникальные праймеры должны быть разработаны и испытаны для генерации каждой уникальной трансгенной конструкции10. Помимо конструирования трансгенов, геномная интеграция, передача зародышевой линии и скрининг на надлежащую интеграцию трансгенов также были затруднены. Здесь мы описываем протокол использования системы трансгенеза Tol2 на основе транспозонов (Tol2Kit)10,11. Эта модульная система использует многосайтовое клонирование шлюза для быстрого создания нескольких трансгенных конструкций из постоянно расширяющейся библиотеки векторов «входа» и «назначения». Интегрированные переносимые элементы Tol2 значительно увеличивают скорость трансгенеза, обеспечивая быстрое построение и геномную интеграцию нескольких трансгенов. Используя эту систему, мы показываем, как генерация трансгенной линии эндодермы данио-рерио может быть использована для изучения тканеспецифических структурных дефектов, лежащих в основе FASD. В конечном счете, в этом протоколе мы показываем, что модульная установка и построение трансгенных конструкций значительно помогут исследованиям ФАСН на основе рыбок данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эмбрионы рыбок данио, используемые в этой процедуре, были выращены и разведены в соответствии с установленными протоколами IACUC12. Эти протоколы были одобрены Университетом Луисвилля.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались штамм рыбок данио-рерио дикого типа, AB, и двойная мутантная линия bmp4st72; smad5b1100 . Вся вода, используемая в этой процедуре, была стерильной водой обратного осмоса. Конфокальные изображения были получены под лазерно-сканирующим конфокальным микроскопом. Измерения энтодермы были сделаны с помощью инструмента измерения в ImageJ. Все статистические анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения.

1. Создание решений и медиа

  1. Бактериальная среда: растворите бульон или агар LB в соответствии с инструкциями производителя и автоклав. Перед заливкой среды в чашки Петри диаметром 100 мм добавляют ампициллин (50 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) или комбинацию ампициллина/хлорамфеникола (50 мкг/мл и 30 мкг/мл соответственно).
  2. Чтобы получить 20-кратный запас эмбриональных сред, растворите в 1 л воды: 17,5 г NaCl, 0,75 г KCl, 2,9 г CaCl2, 0,41 г K 2 HPO 4, 0,142 г Na 2 HPO 4 и 4,9 г MgSO4·7H2O. Фильтруйте исходный раствор с помощью вакуумной фильтрующей системы0,22 мкм, и хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не обращайте внимания на образующийся белый осадок; Это не повлияет на СМИ.
  3. В 19 л воды растворяют 1,2 г NaHCO3 и добавляют 1 л 20-кратного запаса эмбриональной среды для получения рабочего раствора среды эмбриона и поддерживают этот раствор при 28 °C.
  4. Для получения 2% раствора фенолового красителя растворите 20 мг фенольной красной натриевой соли в 1 мл воды, не содержащей РНКазы, и храните при комнатной температуре.

2. Формы для литья эмбрионов под давлением

  1. Чтобы сделать пластину для инъекций агарозы, растворите агарозу в среде эмбриона до конечной концентрации 3% путем нагревания до кипения.
  2. Налейте 50 мл агарозы в чашки Петри диаметром 100 мм и, пока агароза еще жидкая, аккуратно поместите форму для литья под давлением в агарозу, чтобы предотвратить образование пузырьков под формой.
  3. Дайте агарозным пластинкам остыть. Как только агароза затвердеет, снимите форму для литья под давлением и храните при температуре 4 °C до использования.

3. Инъекционные пипетки

  1. Протяните капилляры диаметром 1,0 мм (OD), содержащие нить, в иглы с помощью вертикального съемника пипетки с соленоидом, установленным на 2,5, и нагревательным элементом, установленным на 14,6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой съемник с подогревом будет работать, если он чисто и равномерно втягивает капилляры в две иглы, но иглы для инъекций необходимо вытащить в течение 1 недели после инъекции эмбрионов рыбок данио-рерио для получения стабильных результатов инъекции.
    1. Поместите капилляр в съемник, затяните зажим на каждом конце, а затем активируйте нагревательный элемент.
    2. Потяните за капилляры, чтобы создать две инъекционные иглы.
    3. Извлеките капилляры из съемника и храните их в пустой чашке Петри с полоской пластилина, которая действует как держатель иглы.

4. Транспозазная подготовка мРНК

  1. Линеаризируют плазмиду, содержащую транспозазу Tol2Kit, с рестрикционной эндонуклеазой NotI, комбинируя в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл: 10 мкл транспозазной плазмиды (150 нг/мкл), 1,5 мкл рестрикционного реакционного буфера эндонуклеазы, 0,3 мкл эндонуклеазы NotI.
  2. Залейте реакцию до 20 мкл водой, не содержащей РНКазы, а затем смешайте и переварите при 37 °C в течение ночи.
  3. Остановите транспозазное расщепление, добавив 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 2 мкл 5 М NH4OAc и 80 мкл 100% EtOH в реакцию пищеварения, а затем смешайте и охладите при -20 ° C в течение ночи.
  4. Центрифугируют раствор при 14 000x g в течение 20 мин при 4 °C, а затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу ДНК в воде, не содержащей РНКазы.
  5. Определите концентрацию линейной плазмиды в нанограммах на микролитр (нг / мкл) с помощью флуорометра, сначала запустив 2 мкл чистой воды, не содержащей РНКазы, а затем запустив 2 мкл линеаризованной плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации плазмид обычно колеблются в пределах 100-200 нг/мкл
  6. Настройте производство мРНК SP6, объединив следующие компоненты по порядку в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл: 10 мкл 2x NTP/CAP, 2 мкл 10-кратного реакционного буфера, 0,1-1 мкг линейной матрицы ДНК и 2 мкл смеси ферментов SP6.
  7. Залейте реакцию до 20 мкл водой, не содержащей РНКазы, а затем перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч.
  8. После инкубации в течение 2 ч добавляют 1 мкл ДНКазы, хорошо перемешивают и инкубируют еще 15 мин при 37 °C.
  9. Чтобы остановить реакцию SP6, добавьте 30 мкл осажденного раствора LiCl в реакционную пробирку, а затем перемешайте и охладите при -20 ° C в течение ночи.
  10. Центрифугируют раствор при 14 000 x g в течение 20 мин при 4 ° C, чтобы гранулировать мРНК, а затем аспирируют надосадочную жидкость и промывают гранулы мРНК 1 мл 80% EtOH (разбавленной водой, не содержащей РНКазы).
  11. Центрифугируют раствор при 14 000 x g в течение 20 мин при 4 ° C для гранулирования мРНК, а затем аспирируют надосадочную жидкость. Дайте гранулам высохнуть на воздухе.
  12. Ресуспендировать гранулу мРНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы, определить концентрацию мРНК в нанограммах на микролитр (нг/мкл) с помощью флуорометра, как описано на шаге 4.5 (должно быть не менее 100 нг/мкл), аликвотировать 100 нг мРНК на пробирку для одноразового использования и хранить при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что мРНК не разлагается, 2 мкл мРНК можно быстро запустить на геле для электрофореза ДНК, чтобы подтвердить одну полосу со скоростью 1,950 бит / с.

5. Клонирование Multisite Gateway для создания векторов входа для трансгенеза

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол модифицирован из Kwan et al.10, при этом реакция LR записана как реакция полуLR и имеет общий объем 5 мкл. Для генерации новых входных элементов необходимо использовать реакции АД с использованием 5', средних и 3'-донорных векторов10,13.

  1. Чтобы выполнить реакцию, соберите по 10 фмолей p5E, pME и p3E и 20 фмоль целевого вектора (pDest).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мультисайтальная рекомбинация LR использует четыре различных плазмидных вектора: 5'-вектор входа (p5E), средний вектор входа (pME), 3'-вектор входа (p3E) и вектор назначения (pDest) для создания уникальной трансгенной конструкции, окруженной повторами Tol2, готовыми к введению эмбрионам рыбок данио.
    1. Определите размер всех четырех векторов в парах оснований из источника плазмиды (Таблица 1, Tol2Kit Wiki стр.14 или Addgene11; см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для новых векторов полное секвенирование плазмиды с помощью коммерческих компаний, занимающихся секвенированием, может обеспечить точный размер плазмиды в битах / с .
    2. Определите концентрацию всех четырех векторов в нанограммах на микролитр (нг/мкл) с помощью флуорометра, как описано на шаге 4.5.
    3. Используя вес ДНК 660 г/моль и размер плазмиды (в битах / с), рассчитайте общее количество нанограммов (нг) плазмиды, необходимое для достижения либо 10 фмоль (входные векторы), либо 20 фмоль (целевой вектор).
      Equation 1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лаборатория Мосимана в Университете Колорадо, медицинский кампус Аншутц, создала свободно доступную электронную таблицу для расчета необходимого количества плазмиды (в нг) и объема (в мкл) векторов, необходимых в реакцииLR 15.
  2. Чтобы сгенерировать описанную ниже конструкцию sox17:EGFPCAAX, используйте следующие векторы: вектор p5E, содержащий промотор sox17 рыбок данио, который составляет 6,918.н. в размере16; вектор pME, содержащий пренилированный EGFP, который составляет 3,345.н. в размере10; вектор p3E, содержащий сигнальную последовательность позднего поли А SV40, которая составляет 2,838.н. в размере10; и pDest, который составляет 5,883.н. в размере10.
  3. Используя концентрацию плазмиды, определенную на шаге 5.1.2, и количество в нанограммах (нг) для каждого вектора (этап 5.1.3), вычислите общее количество микролитров (мкл) каждой плазмиды, необходимое для достижения либо 10 фмоль (входные векторы), либо 20 фмоль (целевой вектор), а затем разделите это на два для использования в 5 мкл полу-LR-реакциях (все значения, перечисленные ниже, перечислены в таблице 2).
    Equation 2
    1. Чтобы получить 10 фмоль p5E-sox17, используйте 45,66 нг (при концентрации 140,3 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 4 раза, чтобы получить 0,65 мкл.
    2. Чтобы получить 10 фмоль pME-EGFPCAAX, используйте 22,08 нг (при концентрации 213,5 нг / мкл) и разбавьте стерильной водой в 10 раз, чтобы получить 0,52 мкл.
    3. Чтобы получить 10 фмоль p3E-поли А, используйте 15,73 нг (при концентрации 276,1 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 20 раз, чтобы получить 0,57 мкл.
    4. Для 20 фмоль целевого вектора используйте 77,66 нг pDest (при концентрации 307,3 нг/мкл) и разбавьте стерильной водой в 5 раз, чтобы получить 1,63 мкл.
  4. Чтобы начать реакцию полу-LR объемом 5 мкл, объедините объемы p5E, pME, p3E и pDest, определенные на шаге 5.3, в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл, а затем добавьте стерильную воду для достижения общего объема реакции 4 мкл.
  5. Энергично перемешивайте смесь ферментов LR 2 раза в течение 1 минуты каждая, чтобы обеспечить правильное перемешивание, а затем добавьте 1 мкл в реакцию и тщательно перемешайте.
  6. Инкубировать при 25 °C в течение ночи (16+ ч).
  7. Остановите реакцию LR, добавив 0,5 мкл протеиназы K (2 мкг/мкл), инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин, а затем охладите до комнатной температуры.
  8. Превратите 3-4 мкл плазмиды в размороженные, химически компетентные клетки, добавив плазмиду и оставив клетки на льду в течение 25-30 минут.
  9. Пока клетки сидят на льду, нагрейте две пластины с ампициллиновым агаром LB до комнатной температуры.
  10. Термический шок клеток на водяной бане при температуре 42 °C в течение 30 секунд.
  11. После теплового шока добавьте в клетки 250 мкл жидкой среды, не содержащей антибиотиков, и инкубируйте при встряхивании при 37 ° C в течение 1,5 ч.
  12. Распределите 300 мкл бактерий на одной пластине ампициллина и инкубируйте при 37 ° C в течение ночи.
  13. На следующее утро проверьте колонии на наличие двух фенотипов, прозрачного и непрозрачного, соберите прозрачные колонии (как описано в Kwan et al.10) по одному, инокулируйте жидкую культуру, а затем встряхните при 37 ° C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачные колонии почти всегда содержат правильную колонию LR (>85% времени).
  14. Используя коммерческий набор в соответствии с инструкциями производителя, выполните подготовку плазмиды на каждой жидкой культуре и диагностическое переваривание каждой плазмиды, чтобы подтвердить соответствующий размер трансгенной конструкции, что указывает на то, что реакция шлюза LR работала должным образом.
  15. Повторно трансформируют правильные трансгенные конструкции с использованием стандартного протокола бактериальной трансформации, как описано на этапах 5.4-5.12, используя 0,5-1 мкл плазмиды, и инкубируют только при 37 °C в течение 1 часа.
  16. Повторно проведите полосы колоний и убедитесь, что каждая из них имеет трансгенную конструкцию LR, как показано на шаге 5.14.
  17. Определите концентрацию плазмиды, как описано на шаге 4.5 (для инъекции эмбриона необходимо не менее 150 нг/мкл).

6. Введение трансгена эмбрионам

  1. Разморозьте одноразовый образец мРНК транспозазы и трансгенную конструкцию Tol2 на льду и предварительно предупредите пластину для инъекций агарозы до комнатной температуры.
  2. Смешайте на льду: 150 нг плазмиды, 100 нг мРНК транспозазы и 2% фенол красный (0,3 мкл). Затем добавьте воду, не содержащую РНК, чтобы увеличить объем до 3 мкл.
  3. Перенесите эмбрионы на одной клеточной стадии с помощью пипеток для переноса на инъекционную пластину (описанную на этапе 2), заполненную ЭМ, полностью покрывающую агар, а затем осторожно прижмите примерно 50-75 эмбрионов в прорезь инъекционной пластины.
  4. Добавьте смесь мРНК/плазмиды/фенольного краса к открытому концу иглы для капиллярной инъекции, поместите капиллярную иглу в арматуру установки для инъекций и включите установку для инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка для впрыска использует сжатый газ, такой как воздух, для импульсного импульса желаемого объема (описанного на шаге 6.5) смеси мРНК/плазмид/фенол-красавица в эмбрион при активации.
  5. Опустите капиллярную иглу в ЭМ инъекционной пластины и сломайте наконечник с помощью щипцов, чтобы позволить откачать только небольшое количество смеси мРНК / плазмиды / фенола с помощью инъекционной установки.
  6. Вводят эмбрионам небольшой болюс 3 нл смеси мРНК/плазмид/фенол красный в тело клетки эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Болюс 3 нл представляет собой объем смеси мРНК / плазмиды / фенола, при котором семь болюсов теоретически могут одинаково поместиться по средней линии эмбриона.
  7. Когда закончите инъекцию эмбрионов, удалите их из инъекционной пластины, осторожно вытащив их из прорези и перенеся пипеткой в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим ЭМ (примерно 40 мл), а затем инкубируйте при 28,5 ° C, чтобы эмбрионы могли развиваться.

7. Скрининг эмбрионов для трансгенной вставки

  1. Для экспрессии флуоресцентных белков выберите соответствующую стадию развития, когда флуоресцентный трансген должен быть экспрессирован, и проведите скрининг на наличие флуоресценции под флуоресцентным препарирующим микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эмбрионы будут мозаичными в своей экспрессии и покажут геномную вставку трансгенной конструкции.
  2. Скрининг на наличие нефлуоресцентных трансгенов путем скрининга флуоресцентного трансгенного маркера (как описано на шаге 7.1), такого как GFP, управляемый кардиоспецифическим промотором гена cmlc2 , или mCherry, управляемый хрусталиком-специфическим промотором αcyrstallin, которые содержатся в различных векторах назначения.
  3. Позвольте эмбрионам, положительным для трансгенной вставки, полностью развиться до стадии взрослых рыбок данио.
  4. Как только потенциальные трансгенные рыбы достигнут возраста размножения, проверьте их индивидуально как на передачу зародышевой линии, так и на экспрессивность трансгенов, скрещивая их с рыбками данио-рерио дикого типа.
  5. Те взрослые особи, чьи эмбрионы развиваются нормально и дают самую сильную и наиболее подходящую экспрессию трансгенов, сохраняются в качестве уникальных трансгенных линий рыбок данио-рерио для будущей работы и анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативного подхода к скринингу геномной вставки трансгенных конструкций разработайте праймеры ПЦР, которые амплифицируют только трансгенную конструкцию, а не ДНК дикого типа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для генерации трансгенных конструкций мы использовали систему трансгенеза Tol2. Три входных вектора, в том числе p5E, который содержит элементы промотора/энхансера гена, pME, который удерживает ген, экспрессируемый элементами промотора/энхансера, и p3E, который, как минимум, удерживает хвост полиА, были использованы для создания трансгенной конструкции с помощью клонирования LR с несколькими сайтами. Вектор назначения, pDest, обеспечивает повторы Tol2 для геномной вставки трансгенной конструкции в эмбрионы рыбок данио-рерио и содержит всю необходимую генетическую информацию для роста бактерий (рис. 1A). Для целей этой рукописи мы создали и ввели трансгенную конструкцию sox17:EGFPCAAX . Промотор маркера энтодермы, sox17, использовался для управления EGFP, помеченным мембраной, в развивающейся энтодерме рыбок данио. Для трансгенных конструкций, экспрессирующих нефлуорофорные белки, вектор pDest, содержащий флуоресцентный трансгенный маркер, такой как cmlc2: EGFP , может быть использован для помощи в геномной вставке (рис. 1A).

Используя значения, описанные в протоколе выше (таблица 2), была сгенерирована трансгенная конструкция sox17:EGFPCAAX , и 4 мкл этой конструкции были преобразованы в химически компетентные клетки Escherichia coli . После инкубации при 37 ° C в течение ночи агаровая пластина содержала около 250 колоний (LR-реакции обычно составляют в среднем 150-300 колоний на пластину в нашей лаборатории). Скрининг этих колоний проводился на основе непрозрачности. В наших руках колонии, которые были чистыми, имели правильный продукт sox17: EGFPCAAX >85% времени, тогда как непрозрачные колонии никогда не содержали правильного продукта рекомбинации (рис. 1B, наконечник стрелки против стрелки). После выделения плазмиды из нескольких колоний рестрикционное расщепление рекомбинантных продуктов проводили с помощью фермента рестрикции NcoI. Две разные прозрачные колонии и одна непрозрачная колония были переварены. Обе прозрачные колонии имели одну полосу правильного размера 9,544.н. (непереваренные плазмиды, загруженные в качестве контроля переваривания), в то время как непрозрачная колония вообще не имела полос (рис. 2А). Эти положительные конструкции sox17: EGFPCAAX были ретрансформированы, последующие колонии были повторно прожилки, было подтверждено, что эти колонии имеют плазмиду, и были получены запасы бактериальной морозильной камеры с температурой -80 °C. Были определены концентрации как плазмиды sox17:EGFPCAAX , так и мРНК кэппед-транспозазы, чтобы их можно было использовать для инъекций (рис. 2B).

Эмбрионы готовили к инъекции путем помещения эмбрионов на одной клеточной стадии в предварительно разогретую форму для инъекций эмбрионов (рис. 3A-C). После помещения в форму для литья под давлением инъекционная игла, содержащая мРНК sox17: EGFPCAAX, была помещена в держатель микропипетки на микроманипуляторе (рис. 3D, E). Эмбрионам вводили 100 нг мРНК транспозазы, 150 нг плазмиды sox17:EGFPCAAX и фенол красный (краситель для отслеживания инъекций). Болюс 3 нл (определяемый размером, как описано в протоколе, шаг 6.6) вводили в тело клетки, а не в желток эмбриона для наилучших шансов на интеграцию (рис. 3F)10.

После инъекции эмбрионы были извлечены из формы для литья под давлением и им дали развиваться в течение 24 часов. Через 24 часа после оплодотворения эмбрионы были проверены на экспрессию EGFPCAAX в энтодерме. Мозаичная экспрессия энтодермы EGFPCAAX наблюдалась у ~ 75% инъецированных эмбрионов (рис. 4A, A'). Для скрининга эмбрионов, которым вводят нефлуоресцентные трансгены, такие как Gal4 или CreERT2, можно использовать вектор назначения, который также содержит трансгенный маркер (т.е. cmlc2: EGFP) (рис. 1A) (рис. 4B, B'). Взрослые рыбки данио, у которых был трансгенез зародышевой линии sox17: EGFPCAAX, генерировали флуоресцентные эмбрионы с энтодермой, полностью меченной EGFPCAAX (рис. 4C).

Используя недавно созданную трансгенную линию sox17:EGFPCAAX, мы смогли напрямую оценить влияние этанола на формирование энтодермальных мешочков. Мешочки представляют собой выступы, которые образуются на боковом крае энтодермы и важны для формирования лицевого скелета и нескольких систем органов17. Ранее мы показали, что блокирование передачи сигналов костного морфогенетического белка (Bmp) приводит к гипоплазии мешочков18. Теперь мы показываем, что обработка этанолом мутантов Bmp из 10-18 hpf оказывает тонкое, но значительное влияние на размер пакета. Дорсально-вентральная длина каждого мешочка из мешочков 1-5 (у рыбок данио-рерио шесть мешочков, но шестой еще не полностью сформировался на изображенной стадии развития) измеряли в контрольных и обработанных этанолом эмбрионах мутантов Bmp дикого типа (рис. 5А). В качестве контроля общего воздействия роста из-за воздействия этанола была измерена передне-задняя длина всей энтодермы (рис. 5А). Общая длина энтодермы не зависела от генотипа или лечения (рис. 5B). Тем не менее, мешочки 1 и 3 показали значительное увеличение длины мешочка между необработанными и обработанными этанолом эмбрионами дикого типа, но значительное уменьшение длины между необработанными и обработанными этанолом мутантами Bmp (рис. 5C; двусторонний ANOVA; мешок 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; мешочек 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Мешочек 2 показал значительное увеличение размера мешочка между необработанной и обработанной этанолом группами мутантов дикого типа и Bmp соответственно (рис. 5C; двусторонний ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).

Figure 1
Рисунок 1: Реакция шлюза LR для построения трансгена. (A) Схема модульной реакции клонирования шлюза LR, состоящей из четырех частей. LR Clonase рекомбинирует три вектора входа, p5E, pME, и p3E, и вектор назначения, pDest, в высокоспецифичной реакции для получения нового трансгенного продукта, готового к инъекции эмбриона. Для скрининга нефлуоресцентных трансгенов векторы pDest могут содержать необязательные трансгенные маркеры (например, cmlc2: EGFP). (B) Пример бактериальных колоний, полученных в результате трансформации продуктов рекомбинации LR. Прозрачные колонии содержали правильный продукт рекомбинации LR >85% времени (наконечник стрелки), тогда как непрозрачные колонии никогда не содержали правильного продукта рекомбинации (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ плазмидной ДНК и мРНК транспозазы . (A) Диагностическое переваривание трех колоний в результате трансформации продуктов рекомбинации LR. Одна непрозрачная колония не содержала плазмиды для скрининга, в то время как две прозрачные колонии содержали одну полосу при 9,544.н. (неразрезанная или разрезанная). (B) Транспозазная мРНК при 1,950.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Установка для инъекции эмбрионов рыбок данио. (A) Пресс-форма для литья под давлением помещается в жидкую агарозу, разбавленную ЭМ (3% об. / об.). (B) После затвердевания форма вынимается из агарозной пластины. (C) Эмбрионы располагаются в пресс-формах для литья под давлением. (Д,Е) Смесь мРНК/плазмиды/фенольного красного пипетки вводится в инъекционную иглу, которая помещается в держатель микропипетки в микроманипуляторе. (F) Болюс 3 нл вводится в тело клетки эмбриона на одноклеточной стадии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Скрининг рыбок данио, которым вводят трансгенную конструкцию. (А, А') Конфокальное изображение эмбриона, изображенное при 24 hpf, показывает мозаичную экспрессию трансгена sox17:EGFPCAAX. (Б,Б') Экспрессия трансгенных маркеров cmlc2:EGFP в развивающемся сердце при 24 hpf. Боковые виды эмбрионов, спереди слева и дорсально вверху. (C) Конфокальное изображение эмбриона, полученного от взрослой рыбки данио-рерио, несущей трансген. Вся энтодерма экспрессирует EGFPCAAX. Вид эмбриона сбоку, спереди слева и вентрально вверху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Мешочные измерения у обработанных этанолом эмбрионов дикого типа и мутантов Bmp. (A) Схема, показывающая измерение общей длины энтодермы и длины мешочков. (B) Измерения общей длины передне-задней энтодермы не показывают различий между необработанными и обработанными этанолом эмбрионами дикого типа и мутантными эмбрионами Bmp. (C) Измерения длины дорсально-вентрального мешочка показывают, что мешочки 1 и 3 показывают увеличение длины мешочка между необработанными и обработанными этанолом эмбрионами дикого типа, но уменьшается в длине между необработанными и обработанными этанолом мутантами Bmp (двусторонний ANOVA; мешок 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; мешочек 3: F(1,54) = 12,70 , p = 0,0008). Мешочек 2 показывает увеличение длины между необработанными и обработанными этанолом группами дикого типа и мутантными группами Bmp (двусторонняя ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Никаких различий в длине мешочка между мешочками 4 и 5 не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Компоненты Tol2Kit, размещенные в Lovely Lab. Все входные и целевые векторы, доступные в Lovely Lab, их описания и их лаборатория происхождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Расчет количества и согласования каждого вектора в реакции рекомбинации LR. Количество каждого вектора рассчитывалось исходя из размера (в.н.) и фмоля, необходимого для каждого компонента: 10 фмоль каждого входного вектора и 20 фмоль целевого вектора. Исходя из концентрации плазмиды, каждый вектор разводят в стерильной воде для добавления 1 мкл или менее в реакцию LR. Стерильную воду добавляют в векторный пул до 4 мкл, в реакцию добавляют 1 мкл реакционной смеси LR и инкубируют при 25 ° C в течение ночи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рыбки данио-рерио идеально подходят для изучения влияния воздействия этанола на развитие и болезненные состояния 7,8. Рыбки данио-рерио производят большое количество полупрозрачных, оплодотворенных, генетически обрабатываемых эмбрионов, что позволяет одновременно визуализировать в реальном времени несколько тканей и типов клеток, меченных трансгенами, в различных контекстах окружающей среды19,20. Эти сильные стороны в сочетании с сильным генетическим сохранением развития у людей делают рыбок данио-рерио мощной модельной системой для визуализации воздействия этанола 7,8. Здесь мы описали протокол модульного подхода к созданию и введению трансгенных конструкций и созданию трансгенных линий рыбок данио-рерио для будущих исследований этанола.

Было разработано множество различных подходов к созданию трансгенных рыбок данио. Однако создание как трансгенных конструкций, так и трансгенных линий может быть сложной задачей. В то время как традиционные методы субклонирования, клонирование BAC или подходы на основе ПЦР, такие как сборка Гибсона, позволяют создавать трансгенные конструкции, они имеют низкую пропускную способность и не обладают универсальностью в своей конструкции10. Кроме того, эти стратегии должны быть переработаны для каждой созданной трансгенной конструкции. Субклонирование требует многократного переваривания и перевязки, предполагая, что все необходимые сайты рестрикции присутствуют и уникальны. Клонирование BAC требует секвенирования и тестирования нескольких клонов BAC. Для сборки Gibson новые праймеры ПЦР должны быть разработаны для каждой трансгенной конструкции. Кроме того, инъекция неразрезанной или линеаризованной ДНК приводит к низкой передаче зародышевой линии21,22,23.

Tol2Kit представляет собой модульную систему, которая использует клонирование шлюза для создания полных трансгенных конструкций в окружении повторов Tol2, которые в сочетании с мРНК транспозазы значительно увеличивают трансгенез и передачу зародышевой линии 10,11,24,25. Десятки векторов входа и назначения доступны в лаборатории Квана и лаборатории Коула10,11. Кроме того, лаборатории рыбок данио, использующие Tol2Kit, создали и курировали гораздо больше векторов входа и назначения. В качестве примера широты доступных векторов мы объединили и использовали более 70 векторов (таблица 1). Со всеми этими ресурсами сообщества можно быстро генерировать тысячи различных трансгенных конструкций, просто комбинируя векторы выбора в реакции LR.

Оптимальные LR-реакции требуют точных расчетов размера и концентрации плазмиды. Расчеты для каждого вектора выполняются в значениях фемтомол (фмоль), поэтому каждая реакция не требует большого объема плазмиды для создания трансгенной конструкции. Однако это небольшое количество плазмиды делает разведения и правильное пипетирование чрезвычайно важными для успеха реакции10. Дополнительными факторами, которые могут повлиять на реакцию LR, являются размер вставок в различных векторах входа. Например, элемент p5E-sox17 , используемый в этом исследовании, имеет размер более 4 кб, что в сочетании с одинаково большими элементами pME и p3E приведет к очень большому трансгенному вектору. Большую плазмиду в бактериях может быть трудно культивировать, тем самым уменьшая количество колоний, образующихся в результате бактериальной трансформации. Это также приведет к замедлению роста и снижению уровня плазмиды при выделении10. Важно отметить, что наличие высококомпетентных бактериальных клеток, а также увеличение инкубации бактериальных клеток во время трансформации рекомбинационной плазмиды являются ключом к созданию достаточного количества колоний для захвата правильного образования трансгенов. Кроме того, использование правильного реакционного фермента LR (перечисленного в таблице материалов) также играет важную роль в успехе реакции LR.

Помимо создания трансгенной конструкции и бактериальных трансформаций, инъекция эмбриона и интеграция генома также могут быть затруднены. Генерация высококачественной транспозазной мРНК значительно увеличивает частоту геномной интеграции10. Вытянутые капилляры необходимо сделать незадолго до инъекции эмбрионов, так как старые иглы могут потерять капиллярное действие (т.е. инъекционная жидкость не может двигаться к кончику иглы) (рис. 3E). Как сломание кончика иглы, чтобы ввести только ~ 3 нл жидкости, так и введение в тело клетки требуют практики. Наш протокол обучения включает в себя введение в тело клетки только красного красителя для инъекций фенола до тех пор, пока не будут освоены сломанные иглы и инъекционные эмбрионы. Инъекция в тело клетки резко увеличивает скорость интеграции генома10. Комбинируя все это, мы усредняем 75% или более вставки генома и экспрессии мозаики, но это может варьироваться от конструкции к конструкции.

Поскольку геномная вставка может быть случайной, каждый эмбрион, демонстрирующий мозаичную экспрессию, является уникальной трансгенной вставкой и требует постоянного скрининга. Этот непрерывный скрининг необходим, чтобы показать, что сайт интеграции не наносит ущерба развитию эмбриона, что происходит передача зародышевой линии и что экспрессия трансгена не ослабляется и потенциально не подавляется. После того, как трансгенная линия была установлена, ее можно легко использовать для нескольких анализов в исследованиях этанола. Для этих нефлуоресцентных трансгенных конструкций обычно используемые трансгенные маркеры включают cmlc2: GFP и αcrystallin: RFP, которые маркируют сердце и сетчатку соответственно и позволяют продолжать трансгенный скрининг. В дополнение к трансгенным маркерам для скрининга, эти два трансгена могут быть использованы для непосредственного изучения влияния этанола на развитие сердца и сетчатки.

Используя протокол, описанный выше, мы сгенерировали линию трансгенных рыбок данио-рерио sox17:EGFPCAAX , которая имела стабильную передачу по зародышевой линии энтодерм-специфической мембраномеченной конструкции EGFP. Используя эту линию, мы смогли измерить влияние этанола на образование энтодермального мешочка у чувствительных к этанолу эмбрионов с мутацией Bmp. Мы показали, что размеры мешочков 1-3, но не мешочков 4 и 5, а также общая длина энтодермы были затронуты у мутантов Bmp, обработанных этанолом (рис. 5). Эта экспериментальная работа предполагает, что взаимодействие Bmp-этанола нарушает образование энтодермы, в частности, поведение клеток, лежащее в основе формирования мешочка. Эта работа иллюстрирует полезность создания трансгенных линий рыбок данио-рерио для исследований этанола. В результате создание новых трансгенных линий значительно расширит наше понимание чувствительных к этанолу клеточных процессов и тканевых событий при ФАСН.

В конечном счете, трансгенные рыбки данио-рерио и рыбки данио-рерио в целом оказались невероятно мощными в исследовании FASD 7,8. Tol2Kit — это чрезвычайно универсальный инструментарий, который позволяет исследователям быстро генерировать несколько трансгенных конструкций, готовых к введению рыбкам данио. Модульная конструкция и простота генерации новых векторов входа обеспечивают чрезвычайную гибкость в создании трансгенных конструкций без необходимости перепроектирования каких-либо компонентов. В целом, этот инструментарий значительно улучшит как исследования рыбок данио, так и исследования в целом, направленные на улучшение понимания ФАСН.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Исследование, представленное в этой статье, было поддержано грантом Национального института здравоохранения / Национального института по борьбе со злоупотреблением алкоголем (NIH / NIAAA) R00AA023560 для C.B.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 189 Животная модель рыбки данио развитие этанол расстройства алкогольного спектра плода трансгенез многосайтовое клонирование шлюза Tol2Kit
Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. … More

Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter