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Developmental Biology

ज़ेबराफिश टोल 2 सिस्टम: एक मॉड्यूलर और फ्लेक्सिबल गेटवे-आधारित ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64679
Automatic Translation
1, 1, 1
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

Summary

यह काम मॉड्यूलर टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो जेब्राफिश भ्रूण में ट्रांसजेनिक संरचनाओं को बनाने और इंजेक्ट करने के लिए एक गेटवे-आधारित क्लोनिंग विधि है।

Abstract

भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) संरचनात्मक दोषों और संज्ञानात्मक हानि के एक अत्यधिक परिवर्तनशील सेट की विशेषता है जो प्रसवपूर्व इथेनॉल जोखिम के कारण उत्पन्न होते हैं। एफएएसडी की जटिल विकृति के कारण, पशु मॉडल इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की हमारी वर्तमान समझ के लिए महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। जेब्राफिश और मनुष्यों के बीच आनुवंशिकी और विकास दोनों के संरक्षण के उच्च स्तर के कारण इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की जांच करने के लिए ज़ेबराफ़िश एक शक्तिशाली मॉडल साबित हुआ है। एक मॉडल प्रणाली के रूप में, ज़ेबराफिश में कई विशेषताएं होती हैं जो उन्हें विकास ता्मक अध्ययनों के लिए आदर्श बनाती हैं, जिसमें बड़ी संख्या में बाहरी निषेचित भ्रूण शामिल हैं जो आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य और पारभासी हैं। यह शोधकर्ताओं को कई आनुवंशिक संदर्भों में इथेनॉल एक्सपोजर के समय और खुराक को ठीक से नियंत्रित करने की अनुमति देता है। ज़ेबराफ़िश में उपलब्ध एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक उपकरण ट्रांसजेनेसिस है। हालांकि, ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करना और ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना जटिल और कठिन हो सकती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, ज़ेब्राफिश शोधकर्ताओं ने ट्रांसपोसन-आधारित टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम की स्थापना की है। यह मॉड्यूलर सिस्टम पूर्ण टोल 2 ट्रांसपोसन-आधारित ट्रांसजेनिक संरचनाओं की त्वरित असेंबली के लिए एक मल्टीसाइट गेटवे क्लोनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यहां, हम लचीले टोल 2 सिस्टम टूलबॉक्स और जेब्राफिश ट्रांसजेनेसिस और इथेनॉल अध्ययन में उनके उपयोग के लिए तैयार ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Introduction

प्रसवपूर्व इथेनॉल एक्सपोजर संरचनात्मक घाटे और संज्ञानात्मक हानि की निरंतरता को जन्म देता है जिसे भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) 1,2,3,4 कहा जाता है। कई कारकों के बीच जटिल संबंध मनुष्यों में एफएएसडी के एटियलजि का अध्ययन और समझना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस चुनौती को हल करने के लिए, विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल का उपयोग किया गया है। इन मॉडलों में उपलब्ध जैविक और प्रयोगात्मक उपकरण इथेनॉल टेराटोजेनिकता के यांत्रिक आधार की हमारी समझ को विकसित करने में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं, और इन मॉडल प्रणालियों के परिणाम उल्लेखनीय रूप से मानव इथेनॉल अध्ययन 5,6 में पाए जाने वाले के अनुरूप हैं। इनमें से, ज़ेब्राफिश इथेनॉल टेराटोजेनेसिस 7,8 का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है, जो उनके बाहरी निषेचन, उच्च उर्वरता, आनुवंशिक पथगम्यता और पारभासी भ्रूण के कारण है। ये ताकत ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों का उपयोग करके एफएएसडी के वास्तविक समय लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए जेब्राफिश को आदर्श बनाने के लिए गठबंधन करती है।

ट्रांसजेनिक ज़ेबराफिश का बड़े पैमाने पर भ्रूण के विकास के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गयाहै। हालांकि, ट्रांसजेनिक संरचनाओं और बाद में ट्रांसजेनिक लाइनों का निर्माण करना अत्यधिक कठिन हो सकता है। एक मानक ट्रांसजीन को ट्रांसजीन और पॉली ए सिग्नल या "पूंछ" को चलाने के लिए एक सक्रिय प्रमोटर तत्व की आवश्यकता होती है, सभी सामान्य वेक्टर रखरखाव के लिए एक स्थिर जीवाणु वेक्टर में। बहु-घटक ट्रांसजेनिक निर्माण की पारंपरिक पीढ़ी को कई समय लेने वाले उप-क्लोनिंग चरण10 की आवश्यकता होती है। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण, जैसे गिब्सन असेंबली, उप-क्लोनिंग से जुड़े कुछ मुद्दों को दरकिनार कर सकते हैं। हालांकि, प्रत्येक अद्वितीय ट्रांसजेनिक निर्माण10 की पीढ़ी के लिए अद्वितीय प्राइमरों को डिजाइन और परीक्षण किया जाना चाहिए। ट्रांसजीन निर्माण से परे, जीनोमिक एकीकरण, जर्मलाइन ट्रांसमिशन, और उचित ट्रांसजीन एकीकरण के लिए स्क्रीनिंग भी मुश्किल रही है। यहां, हम ट्रांसपोसन-आधारित टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम (Tol2Kit) 10,11 का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉड्यूलर सिस्टम मल्टीसाइट गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करता है ताकि "एंट्री" और "गंतव्य" वैक्टर के लगातार विस्तारित पुस्तकालय से कई ट्रांसजेनिक संरचनाओं को जल्दी से उत्पन्न किया जा सके। एकीकृत टोल 2 ट्रांसपोसेबल तत्व ट्रांसजेनेसिस की दर को बहुत बढ़ाते हैं, जिससे कई ट्रांसजेन के तेजी से निर्माण और जीनोमिक एकीकरण की अनुमति मिलती है। इस प्रणाली का उपयोग करके, हम दिखाते हैं कि एफएएसडी अंतर्निहित ऊतक-विशिष्ट संरचनात्मक दोषों का अध्ययन करने के लिए एंडोडर्म ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइन की पीढ़ी का उपयोग कैसे किया जा सकता है। अंततः, इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि मॉड्यूलर सेटअप और ट्रांसजेनिक संरचनाओं का निर्माण ज़ेब्राफिश-आधारित एफएएसडी अनुसंधान में बहुत सहायता करेगा।

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Protocol

इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सभी ज़ेब्राफिश भ्रूण स्थापित आईएसीयूसी प्रोटोकॉल12 का पालन करते हुए उठाए गए और पैदा किए गए। इन प्रोटोकॉल को लुइसविले विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: इस अध्ययन में जंगली प्रकार के ज़ेब्राफिश स्ट्रेन, एबी, और बीएमपी 4एसटी 72;एसएमएडी 5बी 1100 डबल म्यूटेंट लाइन का उपयोग किया गया था। इस प्रक्रिया में उपयोग किया जाने वाला सभी पानी बाँझ रिवर्स ऑस्मोसिस पानी था। कॉन्फोकल छवियों को लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत लिया गया था। एंडोडर्म माप इमेजजे में माप उपकरण का उपयोग करके किए गए थे। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किए गए थे।

1. समाधान और मीडिया बनाना

  1. बैक्टीरियल मीडिया: निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलबी शोरबा या आगर को भंग करें, और आटोक्लेव। 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में मीडिया डालने से पहले, या तो एम्पीसिलीन (50 μg / mL), कनामाइसिन (50 μg / mL), या एक एम्पीसिलीन / क्लोरैम्फेनिकॉल संयोजन (क्रमशः 50 μg / mL और 30 μg / mL) जोड़ें।
  2. 20x भ्रूण मीडिया स्टॉक बनाने के लिए, निम्नलिखित को 1 लीटर पानी में घोलें: NaCl का 17.5 ग्राम, KCl का 0.75 ग्राम, CaCl2 का2.9ग्राम, K 2 HPO4 का 0.41 ग्राम, Na2HPO 4 का0.142 ग्राम, और MgSO 4.7H2O का4.9 ग्राम। और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बनने वाले सफेद अवक्षेप को अनदेखा करें; इससे मीडिया पर कोई असर नहीं पड़ेगा।
  3. 19 लीटर पानी में, NaHCO3 के 1.2 g को भंग करें और कार्यशील भ्रूण मीडिया समाधान उत्पन्न करने के लिए 20x भ्रूण मीडिया स्टॉक का 1 L जोड़ें, और इस समाधान को 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  4. 2% फिनोल लाल घोल के लिए, 1 एमएल आरएनएस-मुक्त पानी में 20 मिलीग्राम फिनोल लाल सोडियम नमक घोलें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

2. भ्रूण इंजेक्शन मोल्ड

  1. अगारोस इंजेक्शन प्लेट बनाने के लिए, भ्रूण मीडिया में अगारोस को उबालने के लिए गर्म करके 3% की अंतिम एकाग्रता तक घोलें।
  2. 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में 50 एमएल अगारोस डालें, और जबकि अगारोस अभी भी तरल है, मोल्ड के नीचे बुलबुला गठन को रोकने के लिए धीरे से इंजेक्शन मोल्ड को अगारोस में रखें।
  3. अगारोस प्लेटों को ठंडा होने दें। एक बार जब अगारोस ठोस हो जाता है, तो इंजेक्शन मोल्ड को हटा दें, और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. इंजेक्शन पिपेट

  1. 1.0 मिमी (ओडी) केशिकाओं को सुइयों में एक फिलामेंट युक्त करें, जिसमें सोलनॉइड सेट 2.5 और हीटिंग तत्व 14.6 पर सेट होता है।
    नोट: कोई भी गर्म पुलर काम करेगा यदि यह केशिकाओं को दो सुइयों में साफ और समान रूप से खींचता है, लेकिन इंजेक्शन सुइयों को लगातार इंजेक्शन परिणामों के लिए ज़ेब्राफिश भ्रूण को इंजेक्ट करने के 1 सप्ताह के भीतर खींचने की आवश्यकता होती है।
    1. केशिका को पुलर में रखें, प्रत्येक छोर पर क्लैंप को कसें, और फिर हीटिंग तत्व को सक्रिय करें।
    2. दो इंजेक्शन सुइयों को बनाने के लिए केशिकाओं को खींचें।
    3. पुलर से केशिकाओं को हटा दें, और उन्हें मॉडलिंग मिट्टी की एक पट्टी के साथ एक खाली पेट्री डिश में स्टोर करें जो सुई धारक के रूप में कार्य करता है।

4. ट्रांसपोसेस एमआरएनए तैयारी

  1. 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित को मिलाकर नोटी प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ के साथ ट्रांसपोसेज युक्त टोल 2किट प्लास्मिड को रैखिक करें: ट्रांसपोसेज प्लास्मिड का 10 μL (150 ng / μL), प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ प्रतिक्रिया बफर का 1.5 μL, नोटी एंडोन्यूक्लिज़ का 0.3 μL।
  2. RNase-मुक्त पानी के साथ प्रतिक्रिया को 20 μL तक भरें, और फिर रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और पचाएं।
  3. पाचन प्रतिक्रिया में 0.5 M EDTA (pH 8.0) का 1 μL, 5 M NH4OAC का 2 μL और 100% ETOH का 80 μL जोड़कर ट्रांसपोसेज पाचन को रोकें, और फिर रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और ठंडा करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और आरएनएस-मुक्त पानी में डीएनए गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर (एनजी /1एल) में रैखिक प्लास्मिड एकाग्रता का निर्धारण करें, पहले एक आरएनएस-मुक्त पानी खाली के 2 μL को चलाकर और फिर रैखिक प्लास्मिड के 2 μL को चलाकर।
    नोट: प्लास्मिड सांद्रता आमतौर पर 100-200 एनजी /
  6. 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित घटकों को मिलाकर एसपी 6 एमआरएनए उत्पादन सेट करें: 2x NTP / CAP का 10 μL, 10x प्रतिक्रिया बफर का 2 μL, रैखिक डीएनए टेम्पलेट का 0.1-1 μg, और SP6 एंजाइम मिश्रण का 2 μL।
  7. RNase-मुक्त पानी के साथ प्रतिक्रिया को 20 μL तक भरें, और फिर 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  8. 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, DNase का 1 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 37 °C पर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. एसपी 6 प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, प्रतिक्रिया ट्यूब में 30 μL LiCl वर्षा समाधान जोड़ें, और फिर रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और ठंडा करें।
  10. एमआरएनए को पेलेट करने के लिए 20 मिनट के लिए 14,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एमआरएनए गोली को 1 एमएल 80% ईटीओएच (आरएनएस-मुक्त पानी से पतला) के साथ धोएं।
  11. एमआरएनए को पेलेट करने के लिए 20 मिनट के लिए 14,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। गोली को हवा में सूखने दें।
  12. एमआरएनए गोली को 20 μL RNase-मुक्त पानी में पुन: चार्ज करें, चरण 4.5 में वर्णित फ्लोरोमीटर का उपयोग करके नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर (ng/μL) में एमआरएनए सांद्रता निर्धारित करें (कम से कम 100 ng/μL होना चाहिए), एकल उपयोग के लिए प्रति ट्यूब एमआरएनए का 100 ng एलिकोट करें, और -80 °C पर स्टोर करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि एमआरएनए अवक्रमित नहीं है, 1,950 बीपीएस पर एकल बैंड की पुष्टि करने के लिए डीएनए वैद्युतकणसंचलन जेल पर 2 μL mRNA को जल्दी से चलाया जा सकता है।

5. ट्रांसजेनेसिस के लिए एंट्री वैक्टर बनाने के लिए मल्टीसाइट गेटवे क्लोनिंग

नोट: इस प्रोटोकॉल को क्वान एट अल.10 से संशोधित किया गया है, जिसमें एलआर प्रतिक्रिया को आधे एलआर प्रतिक्रिया के रूप में लिखा गया है और 5 μL की कुल मात्रा के साथ लिखा गया है। नए प्रवेश तत्वों को उत्पन्न करने के लिए, 5 ', मध्य और 3' दाता वैक्टर का उपयोग करके बीपी प्रतिक्रियाओं को10,13 का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

  1. प्रतिक्रिया करने के लिए, p5E, pME, और p3E में से प्रत्येक में 10 fmol और गंतव्य वेक्टर (pDest) के 20 fmol इकट्ठा करें।
    नोट: मल्टीसाइट एलआर पुनर्संयोजन चार अलग-अलग प्लास्मिड वैक्टर का उपयोग करता है: एक 5 'एंट्री वेक्टर (पी 5 ई), एक मध्य प्रवेश वेक्टर (पीएमई), एक 3 ' एंट्री वेक्टर (पी 3 ई), और एक गंतव्य वेक्टर (पीटेस्ट), एक अद्वितीय ट्रांसजेनिक निर्माण उत्पन्न करने के लिए टोल 2 दोहराव जेब्राफिश भ्रूण में इंजेक्ट होने के लिए तैयार है।
    1. प्लास्मिड स्रोत से आधार जोड़े में सभी चार वैक्टर के आकार की पहचान करें (तालिका 1, Tol2Kit Wiki पृष्ठ14 या Addgene11; सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: नए वैक्टर के लिए, वाणिज्यिक अनुक्रमण कंपनियों के माध्यम से पूर्ण प्लास्मिड अनुक्रमण बीपीएस में सटीक प्लास्मिड आकार प्रदान कर सकता है।
    2. चरण 4.5 में वर्णित फ्लोरोमीटर का उपयोग करके नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर (एनजी / μL) में सभी चार वैक्टर की एकाग्रता निर्धारित करें।
    3. डीएनए के वजन को 660 ग्राम / मोल और प्लास्मिड आकार (बीपीएस में) के रूप में उपयोग करते हुए, प्लास्मिड के कुल नैनोग्राम (एनजी) की गणना करें जो या तो 10 एफएमओएल (प्रवेश वैक्टर) या 20 एफएमओएल (गंतव्य वेक्टर) तक पहुंचने के लिए आवश्यक है।
      Equation 1
      नोट: कोलोराडो विश्वविद्यालय, एंशुट्ज़ मेडिकल कैंपस में मोसिमन लैब ने एलआर प्रतिक्रिया15 में आवश्यक प्लास्मिड की मात्रा (एनजी में) और वैक्टर की मात्रा (एएल में) की गणना करने के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध स्प्रेडशीट उत्पन्न की है।
  2. नीचे वर्णित निर्माण, sox17: EGFPCAAX उत्पन्न करने के लिए, निम्नलिखित वैक्टर का उपयोग करें: एक p5E वेक्टर जिसमें ज़ेब्राफिश सॉक्स 17 प्रमोटर होता है, जो आकार 16 में6,918 बीपी है; एक पीएमई वेक्टर जिसमें प्रीनिलेटेड ईजीएफपी होता है, जो आकार10 में 3,345 बीपी है; एक पी 3 ई वेक्टर जिसमें एसवी 40 लेट पॉली ए सिग्नल अनुक्रम होता है, जो आकार10 में 2,838 बीपी है; और pDest, जो आकार10 में 5,883 बीपी है।
  3. चरण 5.1.2 में निर्धारित प्लास्मिड एकाग्रता और प्रत्येक वेक्टर (चरण 5.1.3) के लिए नैनोग्राम (एनजी) में मात्रा का उपयोग करके, प्रत्येक प्लास्मिड के कुल माइक्रोलीटर (μL) की गणना करें, जो या तो 10 fmol (प्रवेश वैक्टर) या 20 fmol (गंतव्य वेक्टर) तक पहुंचने के लिए आवश्यक है, और फिर इसे 5 μL अर्ध-LR प्रतिक्रियाओं में उपयोग के लिए दो से विभाजित करें (नीचे सूचीबद्ध सभी मान तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं)।
    Equation 2
    1. p5E-sox17 के 10 fmol उत्पन्न करने के लिए, 45.66 ng (140.3 ng/μL की सांद्रता पर) का उपयोग करें और बाँझ पानी के साथ 4 के कारक से पतला करके 0.65 μL प्राप्त करें।
    2. 10 fmol pME-EGFPCAAX उत्पन्न करने के लिए, 22.08 ng (213.5 ng/ μL की सांद्रता पर) का उपयोग करें और बाँझ पानी के साथ 10 के कारक से पतला करके 0.52 μL प्राप्त करें।
    3. p3E-poly A के 10 fmol उत्पन्न करने के लिए, 15.73 ng (276.1 ng/μL की सांद्रता पर) का उपयोग करें और बाँझ पानी को 20 के कारक से पतला करके 0.57 μL प्राप्त करें।
    4. गंतव्य वेक्टर के 20 fmol के लिए, pDest के 77.66 ng (307.3 ng / μL की सांद्रता पर) का उपयोग करें और बाँझ पानी के साथ 5 के कारक से पतला करके 1.63 μL प्राप्त करें।
  4. 5 μL आधा-LR प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, 0.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चरण 5.3 में निर्धारित p5E, pME, p3E और pDest के वॉल्यूम को संयोजित करें, और फिर 4 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा तक पहुंचने के लिए बाँझ पानी जोड़ें।
  5. उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए एलआर एंजाइम 1 मिनट के लिए 2x मिलाता है, और फिर प्रतिक्रिया में 1 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. रात भर (16+ घंटा) 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. एलआर प्रतिक्रिया को प्रोटीन के (2 μg / μL) के 0.5 μL जोड़कर रोकें, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
  8. प्लास्मिड को जोड़कर पिघली हुई, रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में 3-4 μL प्लास्मिड को बदलें और कोशिकाओं को 25-30 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें।
  9. जब कोशिकाएं बर्फ पर बैठती हैं, तो कमरे के तापमान पर दो एलबी-एम्पीसिलीन एगर प्लेटों को गर्म करें।
  10. ठीक 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं को गर्मी-झटका।
  11. गर्मी के झटके के बाद, कोशिकाओं में एंटीबायोटिक मुक्त, समृद्ध तरल मीडिया के 250 μL जोड़ें, और 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ इनक्यूबेट करें।
  12. एक एम्पीसिलीन प्लेट पर 300 μL बैक्टीरिया फैलाएं, और रात भर 37 ° C पर इनक्यूबेट करें।
  13. अगली सुबह, दो फेनोटाइप्स, स्पष्ट और अपारदर्शी की उपस्थिति के लिए कॉलोनियों को स्क्रीन करें, एक समय में एक स्पष्ट कॉलोनियों (जैसा कि क्वान एट अल .10 में वर्णित है) चुनें, तरल संस्कृति को टीका लगाएं, और फिर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
    नोट: स्पष्ट कॉलोनियों में लगभग हमेशा सही एलआर कॉलोनी (>85% समय) होती है।
  14. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके, प्रत्येक तरल संस्कृति पर एक प्लास्मिड तैयारी करें, और ट्रांसजेनिक निर्माण के उचित आकार की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक प्लास्मिड को नैदानिक रूप से पचाएं, जो इंगित करता है कि एलआर गेटवे प्रतिक्रिया ने ठीक से काम किया है।
  15. प्लास्मिड के 0.5-1 μL का उपयोग करके चरण 5.4-5.12 में वर्णित मानक जीवाणु परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग करके सही ट्रांसजेनिक संरचनाओं को फिर से बदलें, और केवल 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  16. कॉलोनियों को फिर से लकीरें, और पुष्टि करें कि प्रत्येक में चरण 5.14 के अनुसार एलआर ट्रांसजेनिक निर्माण है।
  17. चरण 4.5 में वर्णित प्लास्मिड एकाग्रता का निर्धारण करें (भ्रूण इंजेक्शन के लिए कम से कम 150 एनजी /

6. भ्रूण में ट्रांसजीन का इंजेक्शन

  1. बर्फ पर एकल-उपयोग ट्रांसपोसेस एमआरएनए नमूने और टोल 2 ट्रांसजेनिक निर्माण को पिघलाएं और कमरे के तापमान पर एक अगारोस इंजेक्शन प्लेट को पूर्व-चेतावनी दें।
  2. बर्फ पर निम्नलिखित को मिलाएं: प्लास्मिड के 150 एनजी, ट्रांसपोसेस एमआरएनए के 100 एनजी, और 2% फिनोल लाल (0.3 μL)। फिर, मात्रा को 3 μL तक बनाने के लिए आरएनए-मुक्त पानी जोड़ें।
  3. ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके एक सेल-स्टेज भ्रूण को इंजेक्शन प्लेट (चरण 2 में वर्णित) में स्थानांतरित करें जो पूरी तरह से एगर को कवर करने वाले ईएम से भरा है, और फिर धीरे से इंजेक्शन प्लेट के प्रति स्लॉट लगभग 50-75 भ्रूण दबाएं।
  4. एक केशिका इंजेक्शन सुई के खुले छोर पर एमआरएनए / प्लास्मिड / फिनोल लाल मिश्रण जोड़ें, इंजेक्शन रिग आर्मेचर में केशिका सुई रखें, और इंजेक्शन रिग चालू करें।
    नोट: इंजेक्शन रिग सक्रिय होने पर भ्रूण में एमआरएनए / प्लास्मिड / फिनोल लाल मिश्रण की वांछित मात्रा (चरण 6.5 में वर्णित) को पल्स करने के लिए हवा जैसी संपीड़ित गैस का उपयोग करता है।
  5. इंजेक्शन प्लेट के ईएम में केशिका सुई को कम करें, और इंजेक्शन रिग द्वारा केवल थोड़ी मात्रा में एमआरएनए / प्लास्मिड / फिनोल लाल मिश्रण को पंप करने की अनुमति देने के लिए बल का उपयोग करके टिप को तोड़ें।
  6. भ्रूण के कोशिका शरीर में एमआरएनए / प्लास्मिड / फिनोल लाल मिश्रण के एक छोटे 3 एनएल बोलस के साथ भ्रूण इंजेक्ट करें।
    नोट: एक 3 एनएल बोलस एमआरएनए / प्लास्मिड / फिनोल लाल मिश्रण की एक मात्रा है जिस पर सात बोलस सैद्धांतिक रूप से भ्रूण की मध्य रेखा में समान रूप से फिट हो सकते हैं।
  7. भ्रूण को इंजेक्ट करने के बाद, उन्हें धीरे से स्लॉट से बाहर निकालकर इंजेक्शन प्लेट से हटा दें और उन्हें ताजा ईएम (लगभग 40 एमएल) के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और फिर भ्रूण को विकसित करने की अनुमति देने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

7. ट्रांसजेनिक सम्मिलन के लिए भ्रूण की स्क्रीनिंग

  1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए, उचित विकास चरण चुनें जब फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन को व्यक्त किया जाना चाहिए, और फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करें।
    नोट: ये भ्रूण अपनी अभिव्यक्ति में मोज़ेक होंगे और ट्रांसजेनिक निर्माण के जीनोमिक सम्मिलन को दिखाएंगे।
  2. फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक मार्कर (जैसा कि चरण 7.1 में वर्णित है) के लिए स्क्रीनिंग द्वारा गैर-फ्लोरोसेंट ट्रांसजेन के लिए स्क्रीन, जैसे जीन सीएमएलसी 2 के लिए कार्डियक-विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित जीएफपी या सीरस्टालिन के लेंस-विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित एमचेरी, जो अलग-अलग गंतव्य वैक्टर में निहित हैं।
  3. ट्रांसजेनिक सम्मिलन के लिए सकारात्मक भ्रूण को वयस्क ज़ेबराफिश चरणों में पूरी तरह से विकसित होने की अनुमति दें।
  4. एक बार संभावित ट्रांसजेनिक मछली प्रजनन आयु तक पहुंचने के बाद, उन्हें जंगली प्रकार के ज़ेब्राफिश में प्रजनन करके जर्मलाइन ट्रांसमिशन और ट्रांसजेन अभिव्यक्ति दोनों के लिए व्यक्तिगत रूप से स्क्रीन करें।
  5. वे वयस्क जिनके भ्रूण सामान्य रूप से विकसित होते हैं और सबसे मजबूत और सबसे उपयुक्त ट्रांसजीन अभिव्यक्ति देते हैं, उन्हें भविष्य के काम और विश्लेषण के लिए अद्वितीय ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइनों के रूप में रखा जाता है।
    नोट: ट्रांसजेनिक संरचनाओं के जीनोमिक सम्मिलन के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें जो केवल ट्रांसजेनिक निर्माण को बढ़ाते हैं और जंगली प्रकार के डीएनए को नहीं।

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Representative Results

ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए, हमने टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम का उपयोग किया। तीन प्रवेश वैक्टर, जिनमें पी 5 ई शामिल है, जिसमें जीन प्रमोटर / एन्हांसर तत्व, पीएमई, जो जीन को प्रमोटर / एन्हांसर तत्वों द्वारा व्यक्त किया जाता है, और पी 3 ई, जो कम से कम, पॉलीए पूंछ रखता है, का उपयोग मल्टीसाइट गेटवे एलआर क्लोनिंग के माध्यम से ट्रांसजेनिक निर्माण उत्पन्न करने के लिए किया गया था। गंतव्य वेक्टर, pDest, ज़ेब्राफिश भ्रूण में ट्रांसजेनिक निर्माण के जीनोमिक सम्मिलन के लिए Tol2 दोहराव प्रदान करता है और इसमें जीवाणु विकास के लिए सभी आवश्यक आनुवंशिक जानकारी होती है (चित्रा 1 ए)। इस पांडुलिपि के प्रयोजनों के लिए, हमने एक SOX17: EGFPCAAX ट्रांसजेनिक निर्माण बनाया और इंजेक्ट किया। एंडोडर्म मार्कर के प्रमोटर, एसओएक्स 17, का उपयोग ज़ेबराफिश के विकासशील एंडोडर्म में झिल्ली-टैग किए गए ईजीएफपी को चलाने के लिए किया गया था। ट्रांसजेनिक संरचनाओं के लिए जो गैर-फ्लोरोफोरप्रोटीन को व्यक्त करते हैं, एक सबसे बड़ा वेक्टर जिसमें एक फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक मार्कर होता है जैसे कि सीएमएलसी 2: ईजीएफपी का उपयोग जीनोमिक सम्मिलन में सहायता के लिए किया जा सकता है (चित्रा 1 ए)।

उपरोक्त प्रोटोकॉल (तालिका 2) में वर्णित मूल्यों का उपयोग करते हुए, सोक्स 17: ईजीएफपीसीएएक्स ट्रांसजेनिक निर्माण उत्पन्न किया गया था, और इस निर्माण के 4 μL को रासायनिक रूप से सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं में बदल दिया गया था। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के बाद, आगर प्लेट में लगभग 250 कॉलोनियां थीं (एलआर प्रतिक्रियाएं आमतौर पर हमारी प्रयोगशाला में प्रति प्लेट औसतन 150-300 कॉलोनियां)। इन कॉलोनियों की स्क्रीनिंग अपारदर्शिता के आधार पर की गई थी। हमारे हाथों में, स्पष्ट कॉलोनियों में सही sox17: EGFPCAAX उत्पाद >85% समय था, जबकि अपारदर्शी उपनिवेशों में कभी भी सही पुनर्संयोजन उत्पाद नहीं था (चित्रा 1 बी, एरोहेड बनाम तीर)। कई कॉलोनियों से प्लास्मिड को अलग करने के बाद, पुनः संयोजक उत्पादों का प्रतिबंध पाचन प्रतिबंध एंजाइम, एनसीओआई के साथ किया गया था। दो अलग-अलग स्पष्ट कॉलोनियों और एक अपारदर्शी कॉलोनी को पचाया गया था। दोनों स्पष्ट कॉलोनियों में 9,544 बीपी (पाचन नियंत्रण के रूप में लोड किए गए बिना पचे प्लास्मिड) के सही आकार पर एक एकल बैंड था, जबकि अपारदर्शी कॉलोनी में कोई बैंड नहीं था (चित्रा 2 ए)। इन सकारात्मक sox17: EGFPCAAX संरचनाओं को फिर से स्थानांतरित किया गया था, बाद की कॉलोनियों को फिर से लकीरें दी गई थीं, उन कॉलोनियों में प्लास्मिड होने की पुष्टि की गई थी, और -80 डिग्री सेल्सियस बैक्टीरियल फ्रीजर स्टॉक उत्पन्न किए गए थे। सोक्स 17: ईजीएफपीसीएएएक्स प्लास्मिड और कैप्ड-ट्रांसपोसेस एमआरएनए दोनों की सांद्रता निर्धारित की गई थी ताकि वे दोनों इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जा सकें (चित्रा 2 बी)।

भ्रूण को एक सेल-चरण भ्रूण को पूर्व-गर्म भ्रूण इंजेक्शन मोल्ड (चित्रा 3 ए-सी) में रखकर इंजेक्शन के लिए तैयार किया गया था। एक बार इंजेक्शन मोल्ड में रखे जाने के बाद, सोक्स 17: ईजीएफपीसीएएक्स एमआरएनए युक्त इंजेक्शन सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 3 डी, ई) पर एक माइक्रोपिपेट धारक में रखा गया था। भ्रूण को 100 एनजी ट्रांसपोसेस एमआरएनए, 150 एनजी एसओएक्स 17: ईजीएफपीसीएएक्स प्लास्मिड और फिनोल रेड (इंजेक्शन ट्रैकिंग डाई) के साथ इंजेक्ट किया गया था। एक 3 एनएल बोलस (प्रोटोकॉल, चरण 6.6 में वर्णित आकार द्वारा निर्धारित) को कोशिका शरीर में इंजेक्ट किया गया था और एकीकरण के सर्वोत्तम अवसर के लिए भ्रूण की जर्दी में नहीं (चित्रा 3 एफ)10)।

इंजेक्शन के बाद, भ्रूण को इंजेक्शन मोल्ड से हटा दिया गया और 24 घंटे के लिए विकसित करने की अनुमति दी गई। निषेचन (एचपीएफ) के 24 घंटे बाद, भ्रूण को ईजीएफपीसीएएक्स के एंडोडर्म अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई थी। मोज़ेक एंडोडर्म ईजीएफपीसीएएक्स अभिव्यक्ति इंजेक्शन भ्रूण के ~ 75% में देखी गई थी (चित्रा 4 ए, ए')। गैर-फ्लोरोसेंट ट्रांसजेन जैसे Gal4 या CreERT2 के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण को स्क्रीन करने के लिए, एक गंतव्य वेक्टर जिसमें ट्रांसजेनिक मार्कर (यानी, cmlc2: EGFP) (चित्रा 1A) का उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 4B, B')। वयस्क ज़ेब्राफिश जिसमें सोक्स 17: ईजीएफपीसीएएक्स के जर्मलाइन ट्रांसजेनेसिस थे, ने एंडोडर्म के साथ फ्लोरोसेंट भ्रूण उत्पन्न किया, जिसे पूरी तरह से ईजीएफपीसीएएक्स (चित्रा 4 सी) के साथ लेबल किया गया था।

नव निर्मित सॉक्स 17: ईजीएफपीसीएएक्स ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करके, हम एंडोडर्मल पाउच के गठन पर इथेनॉल के प्रभाव का सीधे आकलन करने में सक्षम थे। पाउच प्रोट्रूशियंस हैं जो एंडोडर्म के पार्श्व किनारे पर बनते हैं और चेहरे के कंकाल और कईअंग प्रणालियों के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमने पहले दिखाया है कि हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग को अवरुद्ध करने से पाउच18 का हाइपोप्लासिया होता है। अब हम दिखाते हैं कि 10-18 एचपीएफ से बीएमपी उत्परिवर्ती के इथेनॉल उपचार का थैली के आकार पर सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। पाउच 1-5 से प्रत्येक थैली की पृष्ठीय-उदर लंबाई (ज़ेबराफिश में छह पाउच हैं, लेकिन छठे को अभी तक विकास के चरण में पूरी तरह से नहीं बनाया गया था) को नियंत्रण और इथेनॉल-उपचारित जंगली-प्रकार बीएमपी उत्परिवर्ती भ्रूण (चित्रा 5 ए) में मापा गया था। इथेनॉल एक्सपोजर के कारण सामान्य विकास प्रभावों के नियंत्रण के रूप में, पूरे एंडोडर्म की पूर्ववर्ती-पीछे की लंबाई को मापा गया था (चित्रा 5 ए)। एंडोडर्म की समग्र लंबाई जीनोटाइप या उपचार (चित्रा 5 बी) से प्रभावित नहीं थी। हालांकि, पाउच 1 और 3 ने अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित जंगली प्रकार के भ्रूणों के बीच थैली की लंबाई में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, लेकिन अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित बीएमपी उत्परिवर्ती के बीच लंबाई में महत्वपूर्ण कमी आई (चित्रा 5 सी; दो-तरफा एनोवा; थैली 1: एफ (1,54) = 10.39, पी = 0.0021; थैली 3: एफ (1,54) = 12.70, पी = 0.0008)। पाउच 2 ने क्रमशः अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित जंगली-प्रकार और बीएमपी उत्परिवर्ती समूहों के बीच थैली के आकार में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई (चित्रा 5 सी; दो-तरफा एनोवा; F(1,54) = 18.94, p < 0.0001)।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसजीन निर्माण के लिए एलआर गेटवे प्रतिक्रिया। (ए) मॉड्यूलर चार-भाग एलआर गेटवे क्लोनिंग प्रतिक्रिया का योजनाबद्ध। एलआर क्लोनेस भ्रूण इंजेक्शन के लिए तैयार एक नए ट्रांसजेनिक उत्पाद को उत्पन्न करने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट प्रतिक्रिया में तीन प्रवेश वैक्टर, पी 5 ई, पीएमई और पी 3 ई, और गंतव्य वेक्टर, पीडीस्ट को फिर से जोड़ता है। गैर-फ्लोरोसेंट ट्रांसजेन की स्क्रीनिंग के लिए, पीडीस्ट वैक्टर में वैकल्पिक ट्रांसजेनिक मार्कर (सीएमएलसी 2: ईजीएफपी, एक उदाहरण के रूप में) हो सकते हैं। (बी) उदाहरण एलआर पुनर्संयोजन उत्पादों के परिवर्तन से प्राप्त जीवाणु उपनिवेश। स्पष्ट कॉलोनियों में एक सही एलआर पुनर्संयोजन उत्पाद >85% समय (तीर) होता है, जबकि अपारदर्शी कॉलोनियों में कभी भी सही पुनर्संयोजन उत्पाद (तीर) नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्लास्मिड डीएनए और ट्रांसपोसेस एमआरएनए का विश्लेषण( ए) एलआर पुनर्संयोजन उत्पादों के परिवर्तन से तीन कॉलोनियों का नैदानिक पाचन। एकल अपारदर्शी कॉलोनी में स्क्रीन करने के लिए कोई प्लास्मिड नहीं था, जबकि दो स्पष्ट कॉलोनियों में 9,544 बीपी (अनकट बनाम कट) पर एक एकल बैंड था। (B) ट्रांसपोसेस एमआरएनए 1,950 bp पर. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ज़ेबराफिश भ्रूण इंजेक्शन सेटअप। (A) एक इंजेक्शन मोल्ड को ईएम (3% v/v) में पतला तरल अगारोस में रखा जाता है। (बी) एक बार जमने के बाद, मोल्ड को अगारोस प्लेट से हटा दिया जाता है। (सी) भ्रूण इंजेक्शन मोल्डों में व्यवस्थित होते हैं। (D, E) फिनोल लाल मिश्रण को इंजेक्शन सुई में पाइप किया जाता है, जिसे माइक्रोमैनिपुलेटर में माइक्रोपिपेट धारक में रखा जाता है। (एफ) एक 3 एनएल बोलस को एक-सेल चरण में भ्रूण के सेल बॉडी में इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: ट्रांसजेनिक निर्माण के साथ इंजेक्ट किए गए ज़ेबराफिश की स्क्रीनिंग । (A, A') 24 hpf पर चित्रित भ्रूण की कॉन्फोकल छवि SOX17: EGFPCAAX ट्रांसजीन की मोज़ेक अभिव्यक्ति दिखाती है। (बी, बी') 24 एचपीएफ पर विकासशील हृदय में सीएमएलसी 2: ईजीएफपी की ट्रांसजेनिक मार्कर अभिव्यक्ति। भ्रूण के पार्श्व दृश्य, बाईं ओर पूर्वकाल और शीर्ष पर पृष्ठीय। (सी) ट्रांसजीन-ले जाने वाले वयस्क ज़ेबराफिश से उत्पन्न भ्रूण की कॉन्फोकल छवि। संपूर्ण एंडोडर्म ईजीएफपीसीएएक्स व्यक्त कर रहा है। भ्रूण का पार्श्व दृश्य, बाईं ओर पूर्वकाल और शीर्ष पर उदर के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: इथेनॉल-उपचारित जंगली प्रकार और बीएमपी उत्परिवर्ती भ्रूण में थैली माप। (ए) योजनाबद्ध एंडोडर्म की समग्र लंबाई और पाउच की लंबाई के माप को दर्शाता है। (बी) समग्र पूर्ववर्ती-पश्चवर्ती एंडोडर्म लंबाई के माप अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित जंगली-प्रकार और बीएमपी उत्परिवर्ती भ्रूण के बीच कोई अंतर नहीं दिखाते हैं। (C) पृष्ठीय-उदर थैली की लंबाई के माप से संकेत मिलता है कि पाउच 1 और 3 अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित जंगली प्रकार के भ्रूणों के बीच थैली की लंबाई में वृद्धि दिखाते हैं, लेकिन अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित बीएमपी उत्परिवर्ती (दो-तरफ़ा एनोवा; थैली 1: F(1,54) = 10.39, p = 0.0021; थैली 3: F(1,54) = 12.70, p के बीच लंबाई में कमी आती है। = 0.0008)। पाउच 2 अनुपचारित और इथेनॉल-उपचारित जंगली-प्रकार और बीएमपी उत्परिवर्ती समूहों (दो-तरफा एनोवा) के बीच लंबाई में वृद्धि दिखाता है। F(1,54) = 18.94, p < 0.0001)। पाउच 4 और 5 के बीच थैली की लंबाई में कोई अंतर नहीं देखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: टोल 2किट घटकों को लवली लैब में रखा गया है। लवली लैब में उपलब्ध प्रत्येक प्रविष्टि और गंतव्य वेक्टर, उनके विवरण और उनकी उत्पत्ति की प्रयोगशाला। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: एलआर पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया में प्रत्येक वेक्टर की मात्रा और संयोजन की गणना। प्रत्येक वेक्टर की मात्रा की गणना आकार (बीपी में) और प्रत्येक घटक के लिए आवश्यक एफएमओएल से की गई थी: प्रत्येक प्रविष्टि वेक्टर का 10 एफएमओएल और गंतव्य वेक्टर का 20 एफएमओएल। प्लास्मिड एकाग्रता से, प्रत्येक वेक्टर को एलआर प्रतिक्रिया में 1 μL या उससे कम जोड़ने के लिए बाँझ पानी में पतला किया जाता है। बाँझ पानी को वेक्टर पूल में 4 μL के बराबर जोड़ा जाता है, 1 μL LR प्रतिक्रिया मिश्रण प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है, और इसे रात भर 25 ° C पर इनक्यूबेट किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जेब्राफिश विकास औररोग राज्यों पर इथेनॉल जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। ज़ेबराफिश बड़ी संख्या में पारभासी, बाहरी रूप से निषेचित, आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य भ्रूण का उत्पादन करती है, जो कई पर्यावरणीय संदर्भों में एक साथ कई ट्रांसजीन-लेबल ऊतकों और सेलप्रकारों की लाइव इमेजिंग की अनुमति देती है। ये ताकत, मनुष्यों के साथ मजबूत विकासात्मक आनुवंशिक संरक्षण के साथ मिलकर, जेब्राफिश को इथेनॉल 7,8 के प्रभाव की इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली बनाती है। यहां, हमने ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने और इंजेक्ट करने और भविष्य के इथेनॉल अध्ययनों के लिए ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों की स्थापना के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया।

ट्रांसजेनिक ज़ेबराफ़िश उत्पन्न करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं। हालांकि, ट्रांसजेनिक संरचनाओं और ट्रांसजेनिक लाइनों दोनों को उत्पन्न करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। जबकि पारंपरिक उप-क्लोनिंग तकनीक, बीएसी क्लोनिंग, या पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण जैसे गिब्सन असेंबली ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं, उनके पास कम थ्रूपुट है और उनकेनिर्माण में बहुमुखी प्रतिभा की कमी है। इसके अलावा, इन रणनीतियों को बनाए गए प्रत्येक ट्रांसजेनिक निर्माण के लिए फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता है। उप-क्लोनिंग के लिए कई पाचन और बंधाव की आवश्यकता होती है, यह मानते हुए कि आवश्यक सभी प्रतिबंध साइटें मौजूद और अद्वितीय हैं। बीएसी क्लोनिंग के लिए कई बीएसी क्लोनों के अनुक्रमण और परीक्षण की आवश्यकता होती है। गिब्सन असेंबली के लिए, प्रत्येक ट्रांसजेनिक निर्माण के लिए नए पीसीआर प्राइमर डिजाइन किए जाने हैं। इसके अलावा, या तो अनकट या रैखिक डीएनए के इंजेक्शन से कम जर्मलाइन ट्रांसमिशन21,22,23 होता है।

टोल 2किट एक मॉड्यूलर प्रणाली है जो टोल 2 दोहराव के साथ पूर्ण ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करती है, जो ट्रांसपोसेस एमआरएनए के साथ संयुक्त होने पर ट्रांसजेनेसिस और जर्मलाइन ट्रांसमिशन 10,11,24,25 को बढ़ाती है। क्वान लैब और कोल लैब10,11 से दर्जनों प्रवेश और गंतव्य वैक्टर उपलब्ध हैं। इसके अलावा, टोल 2किट का उपयोग करने वाली ज़ेबराफ़िश प्रयोगशालाओं ने कई और प्रवेश और गंतव्य वैक्टर उत्पन्न और क्यूरेट किए हैं। उपलब्ध वैक्टर की चौड़ाई के एक उदाहरण के रूप में, हमने 70 से अधिक वैक्टर (तालिका 1) को पूल और उपयोग किया है। इन सभी सामुदायिक संसाधनों के साथ, कोई भी एलआर प्रतिक्रिया में पसंद के वैक्टर को जोड़कर हजारों अलग-अलग ट्रांसजेनिक संरचनाओं को जल्दी से उत्पन्न कर सकता है।

इष्टतम एलआर प्रतिक्रियाओं को प्लास्मिड आकार और एकाग्रता की सटीक गणना की आवश्यकता होती है। प्रत्येक वेक्टर के लिए गणना फेम्टोमोल (एफएमओएल) मूल्यों में की जाती है, इसलिए प्रत्येक प्रतिक्रिया को ट्रांसजेनिक निर्माण उत्पन्न करने के लिए उच्च प्लास्मिड मात्रा की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, प्लास्मिड की यह छोटी मात्रा प्रतिक्रिया10 की सफलता के लिए कमजोर पड़ने और उचित पाइपिंग को अत्यधिक महत्वपूर्ण बनाती है। अतिरिक्त कारक जो एलआर प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, वे विभिन्न प्रवेश वैक्टर में सम्मिलित का आकार हैं। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला पी 5 ई-सोक्स 17 तत्व 4 केबी से अधिक है, जिसे यदि समान रूप से बड़े पीएमई और पी 3 ई तत्वों के साथ जोड़ा जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप एक बहुत बड़ा ट्रांसजेनिक वेक्टर होगा। बैक्टीरिया में एक बड़े प्लास्मिड को कल्चर करना मुश्किल हो सकता है, इस प्रकार बैक्टीरिया परिवर्तन से उत्पन्न कॉलोनियों की संख्या कम हो जाती है। इसके परिणामस्वरूप धीमी वृद्धि होगी औरअलग-थलग होने पर प्लास्मिड का स्तर कम हो जाएगा। महत्वपूर्ण रूप से, अत्यधिक सक्षम जीवाणु कोशिकाओं के साथ-साथ पुनर्संयोजन प्लास्मिड के परिवर्तन के दौरान जीवाणु कोशिकाओं की इनक्यूबेशन में वृद्धि, उचित ट्रांसजीन गठन को पकड़ने के लिए पर्याप्त उपनिवेश पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सही एलआर प्रतिक्रिया एंजाइम ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) का उपयोग करना भी एलआर प्रतिक्रिया की सफलता में एक प्रमुख भूमिका निभाता है।

ट्रांसजेनिक निर्माण और जीवाणु परिवर्तनों की पीढ़ी से परे, भ्रूण इंजेक्शन और जीनोम एकीकरण भी मुश्किल हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसपोसेस एमआरएनए की पीढ़ी जीनोमिक एकीकरण10 की आवृत्ति को बहुत बढ़ाती है। भ्रूण को इंजेक्ट करने से कुछ समय पहले खींची गई केशिकाओं को बनाने की आवश्यकता होती है क्योंकि पुरानी सुइयां केशिका कार्रवाई खो सकती हैं (यानी, इंजेक्शन द्रव सुई की नोक पर जाने में विफल रहता है) (चित्रा 3 ई)। सुई की नोक को तोड़ने से केवल ~ 3 एनएल तरल पदार्थ इंजेक्ट करने और सेल शरीर को इंजेक्ट करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। हमारे प्रशिक्षण प्रोटोकॉल में केवल फिनोल लाल इंजेक्शन डाई के साथ सेल बॉडी को इंजेक्ट करना शामिल है जब तक कि सुई को तोड़ना और भ्रूण को इंजेक्ट करना महारत हासिल न हो जाए। कोशिका शरीर को इंजेक्ट करने से जीनोम एकीकरण की दर में काफी वृद्धि होती है10. इन सभी को मिलाकर, हम औसतन 75% या अधिक जीनोम सम्मिलन और मोज़ेक अभिव्यक्ति करते हैं, लेकिन यह निर्माण से निर्माण तक भिन्न हो सकता है।

चूंकि जीनोमिक सम्मिलन यादृच्छिक हो सकता है, मोज़ेक अभिव्यक्ति दिखाने वाला प्रत्येक भ्रूण एक अद्वितीय ट्रांसजेनिक सम्मिलन है और इसके लिए निरंतर स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। यह निरंतर स्क्रीनिंग यह दिखाने के लिए आवश्यक है कि एकीकरण साइट भ्रूण के विकास के लिए हानिकारक नहीं है, कि जर्मलाइन ट्रांसमिशन होता है, और यह कि ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति क्षीण या संभावित रूप से चुप नहीं होती है। एक बार ट्रांसजेनिक लाइन स्थापित हो जाने के बाद, इसे इथेनॉल अध्ययन में कई विश्लेषणों के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है। उन गैर-फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक संरचनाओं के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ट्रांसजेनिक मार्करों में सीएमएलसी 2: जीएफपी और क्रिस्टलीन: आरएफपी शामिल हैं, जो क्रमशः हृदय और रेटिना को लेबल करते हैं, और निरंतर ट्रांसजेनिक स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं। स्क्रीनिंग के लिए ट्रांसजेनिक मार्करों के अलावा, इन दो ट्रांसजेन का उपयोग हृदय और रेटिना विकास पर इथेनॉल के प्रभाव का सीधे अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने एक sox17: EGFPCAAX ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइन उत्पन्न की जिसमें एंडोडर्म-विशिष्ट झिल्ली-टैग किए गए ईजीएफपी निर्माण का स्थिर जर्मलाइन ट्रांसमिशन था। इस लाइन का उपयोग करके, हम इथेनॉल-संवेदनशील बीएमपी उत्परिवर्ती भ्रूण में एंडोडर्मल थैली गठन पर इथेनॉल के प्रभाव को मापने में सक्षम थे। हमने दिखाया कि पाउच 1-3 के आकार लेकिन पाउच 4 और 5 के नहीं और न ही समग्र एंडोडर्म लंबाई इथेनॉल-उपचारित बीएमपी उत्परिवर्ती में प्रभावित हुई थी (चित्र 5)। इस पायलट कार्य से पता चलता है कि बीएमपी-इथेनॉल इंटरैक्शन एंडोडर्म गठन को बाधित करता है, विशेष रूप से थैली गठन के अंतर्निहित सेल व्यवहार। यह काम इथेनॉल अध्ययन के लिए ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों को उत्पन्न करने की उपयोगिता का उदाहरण देता है। नतीजतन, नई ट्रांसजेनिक लाइनें बनाने से एफएएसडी में इथेनॉल-संवेदनशील सेलुलर प्रक्रियाओं और ऊतक घटनाओं की हमारी समझ में काफी वृद्धि होगी।

अंततः, ट्रांसजेनिक ज़ेबराफ़िश, और सामान्य रूप से ज़ेबराफ़िश, एफएएसडी 7,8 के अध्ययन में अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली साबित हुए हैं। Tol2Kit एक अत्यंत बहुमुखी टूलकिट है जो शोधकर्ताओं को ज़ेबराफिश में इंजेक्ट करने के लिए तैयार कई ट्रांसजेनिक संरचनाओं को जल्दी से उत्पन्न करने में सक्षम बनाता है। मॉड्यूलर डिजाइन और नए प्रवेश वैक्टर उत्पन्न करने में आसानी के परिणामस्वरूप किसी भी घटक को फिर से डिजाइन किए बिना ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने में अत्यधिक लचीलापन होता है। कुल मिलाकर, यह टूलकिट एफएएसडी की समझ में सुधार के उद्देश्य से सामान्य रूप से ज़ेब्राफिश अनुसंधान और अनुसंधान दोनों में काफी सुधार करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस लेख में प्रस्तुत शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ / नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज (एनआईएच / एनआईएएए) आर 00एए 023560 से सीबीएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

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References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

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Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

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