Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64679
Automatic Translation
1, 1, 1
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

Abstract

تتميز اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) بمجموعة متغيرة للغاية من العيوب الهيكلية والإعاقات المعرفية التي تنشأ بسبب التعرض للإيثانول قبل الولادة. نظرا لعلم الأمراض المعقد ل FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها لفهمنا الحالي للعيوب التنموية التي يسببها الإيثانول. أثبت الزرد أنه نموذج قوي لفحص العيوب التنموية التي يسببها الإيثانول بسبب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من الوراثة والتنمية بين الزرد والبشر. كنظام نموذجي ، تمتلك أسماك الزرد العديد من السمات التي تجعلها مثالية للدراسات التنموية ، بما في ذلك أعداد كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا والتي تكون شفافة وراثيا. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم بدقة في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات جينية متعددة. إحدى الأدوات الوراثية المهمة المتاحة في الزرد هي الجينات المحورة. ومع ذلك ، فإن توليد تركيبات معدلة وراثيا وإنشاء خطوط محورة وراثيا يمكن أن يكون معقدا وصعبا. لمعالجة هذه المشكلة ، أنشأ باحثو الزرد نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون. يستخدم هذا النظام المعياري نهج استنساخ بوابة متعدد المواقع للتجميع السريع للتركيبات المعدلة وراثيا الكاملة القائمة على Tol2. هنا ، نصف صندوق أدوات نظام Tol2 المرن وبروتوكول لتوليد تركيبات معدلة وراثيا جاهزة لجين الزرد المحورة واستخدامها في دراسات الإيثانول.

Introduction

يؤدي التعرض للإيثانول قبل الولادة إلى سلسلة متصلة من العجز الهيكلي والإعاقات المعرفية تسمى اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) 1،2،3،4. العلاقات المعقدة بين عوامل متعددة تجعل دراسة وفهم مسببات FASD في البشر صعبة. لحل هذا التحدي ، تم استخدام مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية. أثبتت الأدوات البيولوجية والتجريبية المتاحة في هذه النماذج أنها حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الميكانيكي للإيثانول المسخي ، وكانت النتائج من هذه الأنظمة النموذجية متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في دراسات الإيثانول البشرية 5,6. من بين هؤلاء ، برزت أسماك الزرد كنموذج قوي لدراسة تكوين الإيثانولالمسخي 7,8 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الإخصاب الخارجي ، والخصوبة العالية ، وقابلية السحب الوراثي ، والأجنة الشفافة. تتحد نقاط القوة هذه لجعل الزرد مثاليا لدراسات التصوير الحية في الوقت الفعلي ل FASD باستخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا.

تم استخدام الزرد المعدل وراثيا على نطاق واسع لدراسة جوانب متعددة من التطور الجنيني9. ومع ذلك ، فإن إنشاء تركيبات معدلة وراثيا وخطوط معدلة وراثيا لاحقة يمكن أن يكون صعبا للغاية. يتطلب جين التحوير القياسي عنصر محفز نشط لدفع جين التحوير وإشارة بولي أ أو "ذيل" ، كل ذلك في ناقل بكتيري مستقر لصيانة النواقل العامة. يتطلب الجيل التقليدي من بنية محورة وراثية متعددة المكونات خطوات استنساخ فرعية متعددة تستغرقوقتا طويلا 10. ويمكن للنهج القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل، مثل تجميع جيبسون، أن تتحايل على بعض المسائل المرتبطة بالاستنساخ الفرعي. ومع ذلك ، يجب تصميم واختبار الاشعال الفريدة لتوليد كل بنية معدلة وراثيا فريدة10. وبعيدا عن بناء الجينات المحورة، كان التكامل الجينومي، وانتقال الخط الجرثومي، وفحص التكامل السليم لجينات التحوير أمرا صعبا أيضا. هنا ، نصف بروتوكولا لاستخدام نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون (Tol2Kit) 10,11. يستخدم هذا النظام المعياري استنساخ بوابة متعددة المواقع لإنشاء تركيبات متعددة معدلة وراثيا بسرعة من مكتبة دائمة التوسع من متجهات "الدخول" و "الوجهة". تزيد عناصر Tol2 المدمجة القابلة للنقل بشكل كبير من معدل الجينات المحورة ، مما يسمح بالبناء السريع والتكامل الجيني لجينات التحوير المتعددة. باستخدام هذا النظام ، نوضح كيف يمكن استخدام توليد خط الزرد المعدل وراثيا للأديم الباطن لدراسة العيوب الهيكلية الخاصة بالأنسجة الكامنة وراء FASD. في النهاية ، في هذا البروتوكول ، نظهر أن الإعداد المعياري وبناء التركيبات المعدلة وراثيا سيساعد بشكل كبير في أبحاث FASD القائمة على الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تربية وتربية جميع أجنة الزرد المستخدمة في هذا الإجراء وفقا لبروتوكولات IACUC12 المعمول بها. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة لويزفيل.

ملاحظة: تم استخدام سلالة الزرد من النوع البري ، AB ، وخط bmp4st72 ؛ smad5b1100 المزدوج الطافر في هذه الدراسة. كل المياه المستخدمة في هذا الإجراء كانت مياه التناضح العكسي المعقمة. تم التقاط الصور متحدة البؤر تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تم إجراء قياسات الأديم الباطن باستخدام أداة القياس في ImageJ. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام البرامج الإحصائية.

1. صنع الحلول والوسائط

  1. الوسائط البكتيرية: قم بإذابة مرق LB أو أجار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، والأوتوكلاف. قبل صب الوسائط في أطباق بتري 100 مم ، أضف إما الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) ، كاناميسين (50 ميكروغرام / مل) ، أو مزيج الأمبيسلين / الكلورامفينيكول (50 ميكروغرام / مل و 30 ميكروغرام / مل ، على التوالي).
  2. لعمل 20x مخزون وسائط جنينية ، قم بإذابة ما يلي في 1 لتر من الماء: 17.5 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.75 جم من KCl ، 2.9 جم من CaCl 2 ، 0.41 جم من K 2 HPO 4 ، 0.142 جم من Na 2 HPO 4 ، و4.9 جم من MgSO 4 · 7H 2O. قم بتصفية وتعقيم محلول المخزون باستخدامنظام ترشيح فراغ 0.22 ميكرومتر ، ويحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تجاهل الراسب الأبيض الذي يتشكل; هذا لن يؤثر على وسائل الإعلام.
  3. في 19 لترا من الماء ، قم بإذابة 1.2 جم من NaHCO3 وأضف 1 لتر من مخزون وسائط الجنين 20x لتوليد محلول وسائط الجنين العامل ، والحفاظ على هذا المحلول عند 28 درجة مئوية.
  4. للحصول على محلول الفينول الأحمر بنسبة 2٪ ، قم بإذابة 20 مجم من ملح الفينول الأحمر الصوديوم في 1 مل من الماء الخالي من RNase ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة.

2. قوالب حقن الجنين

  1. لعمل صفيحة حقن الأغاروز ، قم بإذابة الأغاروز في وسط الجنين إلى تركيز نهائي قدره 3٪ عن طريق التسخين حتى الغليان.
  2. صب 50 مل من الأغاروز في أطباق بتري 100 مم ، وبينما لا يزال الأغاروز سائلا ، ضع قالب الحقن برفق في الأغاروز لمنع تكوين الفقاعة تحت القالب.
  3. دع ألواح الأغاروز تبرد. بمجرد أن يصبح الأغاروز صلبا ، قم بإزالة قالب الحقن وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

3. ماصات الحقن

  1. اسحب الشعيرات الدموية مقاس 1.0 مم (OD) التي تحتوي على خيوط إلى إبر باستخدام مجتذب ماصة عمودي مع ضبط الملف اللولبي على 2.5 وضبط عنصر التسخين على 14.6.
    ملاحظة: أي مجتذب ساخن سيعمل إذا سحب الشعيرات الدموية إلى إبرتين نظيفين ومتساويين ، ولكن يجب سحب إبر الحقن في غضون 1 أسبوع من حقن أجنة الزرد للحصول على نتائج حقن متسقة.
    1. ضع الشعيرات الدموية في الساحب ، وشد المشبك في كل طرف ، ثم قم بتنشيط عنصر التسخين.
    2. اسحب الشعيرات الدموية لإنشاء إبرتين للحقن.
    3. قم بإزالة الشعيرات الدموية من الساحب ، وقم بتخزينها في طبق بتري فارغ مع شريط من طين النمذجة الذي يعمل كحامل للإبرة.

4. إعداد ترانسبوزاز mRNA

  1. خطي البلازميد Tol2Kit الذي يحتوي على ترانسبوزاز مع نوكلياز داخلي لتقييد NotI من خلال الجمع بين ما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل: 10 ميكرولتر من بلازميد ترانسبوزاز (150 نانوغرام / ميكرولتر) ، 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل نوكلياز التقييد ، 0.3 ميكرولتر من نوكلياز NotI.
  2. املأ التفاعل حتى 20 ميكرولتر بالماء الخالي من RNase ، ثم اخلطه واهضمه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. أوقف هضم الترانسبوزاز بإضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0) ، 2 ميكرولتر من 5 M NH4OAc ، و 80 ميكرولتر من 100٪ EtOH إلى تفاعل الهضم ، ثم اخلطها واتركها تبرد عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  4. قم بطرد المحلول عند 14000× جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الحمض النووي في ماء خال من RNase.
  5. حدد تركيز البلازميد الخطي بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلورومتر عن طريق تشغيل 2 ميكرولتر أولا من فراغ ماء خال من RNase ثم تشغيل 2 ميكرولتر من البلازميد الخطي.
    ملاحظة: تتراوح تركيزات البلازميد عادة بين 100-200 نانوغرام / ميكرولتر
  6. قم بإعداد إنتاج SP6 mRNA من خلال الجمع بين المكونات التالية بالترتيب في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل: 10 ميكرولتر من 2x NTP / CAP ، 2 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، 0.1-1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الخطي ، و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم SP6.
  7. املأ التفاعل حتى 20 ميكرولتر بالماء الخالي من RNase ، ثم اخلطه واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  8. بعد الحضانة لمدة 2 ساعة ، أضف 1 ميكرولتر من DNase ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
  9. لإيقاف تفاعل SP6 ، أضف 30 ميكرولتر من محلول ترسيب LiCl إلى أنبوب التفاعل ، ثم اخلطه واتركه يبرد عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  10. قم بطرد المحلول عند 14000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير mRNA ، ثم استنشاق المادة الطافية وغسل حبيبات mRNA ب 1 مل من 80٪ EtOH (مخفف بالماء الخالي من RNase).
  11. جهاز طرد مركزي المحلول عند 14000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير mRNA ، ثم استنشاق المادة الطافية. اترك الحبيبات تجف في الهواء.
  12. أعد تعليق حبيبات mRNA في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، وحدد تركيز mRNA بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلور كما هو موضح في الخطوة 4.5 (يجب أن يكون 100 نانوغرام / ميكرولتر على الأقل) ، والقسمة 100 نانوغرام من mRNA لكل أنبوب للاستخدام الفردي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: للتأكد من عدم تحلل mRNA ، يمكن تشغيل 2 ميكرولتر من mRNA بسرعة على هلام الرحلان الكهربائي للحمض النووي لتأكيد نطاق واحد عند 1,950 بت في الثانية.

5. استنساخ بوابة متعددة المواقع لإنشاء ناقلات دخول لجينات التحوير

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من Kwan et al.10 ، مع تفاعل LR مكتوب كتفاعل نصف LR وبحجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر. لتوليد عناصر دخول جديدة ، يجب استخدام تفاعلات BP باستخدام ناقلات المانحين 5 'و 3' و 3 '10,13.

  1. لإجراء التفاعل ، اجمع 10 fmol لكل من p5E و pME و p3E و 20 fmol من المتجه الوجهة (pDest).
    ملاحظة: تستخدم إعادة التركيب LR متعددة المواقع أربعة متجهات بلازميدية مختلفة: متجه دخول 5 بوصات (p5E) ، وناقل دخول متوسط (pME) ، ومتجه دخول 3 بوصات (p3E) ، وناقل وجهة (pDest) ، لتوليد بنية معدلة وراثيا فريدة محاطة بتكرارات Tol2 جاهزة للحقن في أجنة الزرد.
    1. حدد حجم جميع المتجهات الأربعة في أزواج القواعد من مصدر البلازميد (الجدول 1 ، Tol2Kit Wiki صفحة14 أو Addgene11 ؛ انظر جدول المواد).
      ملاحظة: بالنسبة للمتجهات الجديدة ، يمكن أن يوفر تسلسل البلازميد الكامل عبر شركات التسلسل التجاري حجم البلازميد الدقيق في بت في الثانية.
    2. أوجد تركيز جميع المتجهات الأربعة بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام/ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلورومتر، كما هو موضح في الخطوة 4.5.
    3. باستخدام وزن الحمض النووي ك 660 جم / مول وحجم البلازميد (في بت في الثانية) ، احسب إجمالي النانوجرام (نانوغرام) من البلازميد اللازم للوصول إما إلى 10 fmol (متجهات الدخول) أو 20 fmol (متجه الوجهة).
      Equation 1
      ملاحظة: أنشأ مختبر Mosimann في جامعة كولورادو ، حرم أنشوتز الطبي ، جدول بيانات متاحا مجانا لحساب كمية البلازميد اللازمة (بالنانوغرام) وحجم (بالميكرولتر) من المتجهات اللازمة في تفاعل LR15.
  2. لإنشاء البنية الموضحة أدناه ، sox17: EGFPCAAX ، استخدم المتجهات التالية: ناقل p5E يحتوي على مروج الزرد sox17 ، وهو 6,918 bp في الحجم16 ؛ ناقل pME يحتوي على EGFP prenylated ، وهو 3,345 bp في الحجم10 ؛ متجه p3E يحتوي على تسلسل إشارة SV40 المتأخر بولي A ، والذي يبلغ حجمه 2,838 نقطة أساس في الحجم10 ؛ و pDest ، وهو 5,883 bp في الحجم10.
  3. باستخدام تركيز البلازميد المحدد في الخطوة 5.1.2 والكمية بالنانوجرام (نانوغرام) لكل متجه (الخطوة 5.1.3) ، احسب إجمالي الميكرولتر (ميكرولتر) لكل بلازميد مطلوب للوصول إما إلى 10 fmol (متجهات الدخول) أو 20 fmol (متجه الوجهة) ، ثم قسم هذا على اثنين للاستخدام في تفاعلات نصف LR 5 ميكرولتر (جميع القيم المذكورة أدناه مدرجة في الجدول 2).
    Equation 2
    1. لتوليد 10 fmol من p5E-sox17 ، استخدم 45.66 نانوغرام (بتركيز 140.3 نانوغرام / ميكرولتر) وخفف بالماء المعقم بعامل 4 للحصول على 0.65 ميكرولتر.
    2. لتوليد 10 fmol من pME-EGFPCAAX ، استخدم 22.08 نانوغرام (بتركيز 213.5 نانوغرام / ميكرولتر) وقم بتخفيفه بالماء المعقم بعامل 10 للحصول على 0.52 ميكرولتر.
    3. لتوليد 10 fmol من p3E-poly A ، استخدم 15.73 نانوغرام (بتركيز 276.1 نانوغرام / ميكرولتر) وقم بتخفيفه بالماء المعقم بعامل 20 للحصول على 0.57 ميكرولتر.
    4. بالنسبة ل 20 fmol من المتجه الوجهة ، استخدم 77.66 ng من pDest (بتركيز 307.3 نانوغرام / ميكرولتر) وخفف بالماء المعقم بمعامل 5 للحصول على 1.63 ميكرولتر.
  4. لإعداد تفاعل نصف LR 5 ميكرولتر ، اجمع بين أحجام p5E و pME و p3E و pDest المحددة في الخطوة 5.3 في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل ، ثم أضف الماء المعقم للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي يبلغ 4 ميكرولتر.
  5. دوامة بقوة يخلط إنزيم LR 2x لمدة دقيقة واحدة لكل منهما لضمان الخلط المناسب ، ثم أضف 1 ميكرولتر إلى التفاعل واخلطه جيدا.
  6. احتضان في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16+ ساعة).
  7. أوقف تفاعل LR بإضافة 0.5 ميكرولتر من البروتيناز K (2 ميكروغرام / ميكرولتر) ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بتحويل 3-4 ميكرولتر من البلازميد إلى خلايا مذابة ومختصة كيميائيا عن طريق إضافة البلازميد وترك الخلايا تجلس على الجليد لمدة 25-30 دقيقة.
  9. بينما تجلس الخلايا على الجليد ، قم بتسخين لوحين من أجار LB-ampicillin إلى درجة حرارة الغرفة.
  10. قم بصدمة الخلايا الحرارية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بالضبط.
  11. بعد الصدمة الحرارية ، أضف 250 ميكرولتر من الوسائط السائلة الغنية الخالية من المضادات الحيوية إلى الخلايا ، واحتضانها بالاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  12. انشر 300 ميكرولتر من البكتيريا على طبق أمبيسلين واحد ، واحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  13. في صباح اليوم التالي ، قم بفحص المستعمرات بحثا عن وجود نمطين ظاهريين ، واضحين وغير شفافين ، واختر المستعمرات الصافية (كما هو موضح في Kwan et al.10) واحدة تلو الأخرى ، وقم بتلقيح الثقافة السائلة ، ثم رجها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تحتوي المستعمرات الواضحة دائما على مستعمرة LR الصحيحة (>85٪ من الوقت).
  14. باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، قم بإجراء تحضير البلازميد على كل مزرعة سائلة، وقم بهضم كل بلازميد تشخيصيا لتأكيد الحجم المناسب للبنية المعدلة وراثيا، مما يشير إلى أن تفاعل بوابة LR قد عمل بشكل صحيح.
  15. إعادة تحويل التركيبات المعدلة وراثيا الصحيحة باستخدام بروتوكول التحول البكتيري القياسي كما هو موضح في الخطوات 5.4-5.12 باستخدام 0.5-1 ميكرولتر من البلازميد ، واحتضانها فقط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  16. أعد خط المستعمرات ، وتأكد من أن لكل منها بنية LR المعدلة وراثيا كما في الخطوة 5.14.
  17. تحديد تركيز البلازميد كما هو موضح في الخطوة 4.5 (يلزم ما لا يقل عن 150 نانوغرام / ميكرولتر لحقن الجنين).

6. حقن الجينات المحورة في الأجنة

  1. قم بإذابة عينة mRNA transposase ذات الاستخدام الواحد وبنية Tol2 المعدلة وراثيا على الجليد وحذر مسبقا من لوحة حقن الأغاروز إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. الجمع بين ما يلي على الجليد: 150 نانوغرام من البلازميد ، 100 نانوغرام من ترانسبوزاز mRNA ، و 2٪ الفينول الأحمر (0.3 ميكرولتر). ثم أضف الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لتعويض الحجم إلى 3 ميكرولتر.
  3. انقل أجنة مرحلة خلية واحدة باستخدام ماصات النقل إلى لوحة الحقن (الموضحة في الخطوة 2) المملوءة ب EM الذي يغطي الأجار بالكامل ، ثم اضغط برفق على ما يقرب من 50-75 جنينا لكل فتحة من لوحة الحقن.
  4. أضف خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر إلى الطرف المفتوح لإبرة الحقن الشعري ، ضع الإبرة الشعرية في حديد التسليح بجهاز الحقن ، وقم بتشغيل جهاز الحقن.
    ملاحظة: يستخدم جهاز الحقن الغاز المضغوط ، مثل الهواء ، لنبض الحجم المطلوب (الموصوف في الخطوة 6.5) من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر في الجنين عند تنشيطه.
  5. اخفض الإبرة الشعرية في EM للوحة الحقن ، وكسر الطرف باستخدام ملقط للسماح بضخ كمية صغيرة فقط من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر بواسطة جهاز الحقن.
  6. حقن الأجنة ببلعة صغيرة 3 nL من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر في جسم خلية الجنين.
    ملاحظة: بلعة 3 nL هي حجم من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر حيث يمكن أن تتناسب سبع بلعات نظريا بالتساوي عبر خط الوسط للجنين.
  7. عند الانتهاء من حقن الأجنة ، قم بإزالتها من لوحة الحقن عن طريق إخراجها برفق من الفتحة ونقل ماصة إلى طبق بتري 100 مم مع EM طازج (حوالي 40 مل) ، ثم احتضانها عند 28.5 درجة مئوية للسماح للأجنة بالنمو.

7. فحص الأجنة لإدخالها في علم الوراثة

  1. للتعبير عن البروتينات الفلورية ، اختر المرحلة التنموية المناسبة عندما يجب التعبير عن جين التحوير الفلوري ، وفحص وجود مضان تحت مجهر تشريح الفلورسنت.
    ملاحظة: ستكون هذه الأجنة فسيفساء في تعبيرها وتظهر إدخالا جينوميا للبنية المعدلة وراثيا.
  2. فحص الجينات المحورة غير الفلورية عن طريق فحص علامة محورة وراثيا فلورية (كما هو موضح في الخطوة 7.1) ، مثل GFP مدفوعا من قبل المروج الخاص بالقلب للجين cmlc2 أو mCherry مدفوعا بواسطة المروج الخاص بالعدسة ل αcyrstallin ، والتي توجد في ناقلات وجهة متميزة.
  3. السماح للأجنة الإيجابية للإدخال المعدل وراثيا بالتطور الكامل إلى مراحل الزرد البالغة.
  4. بمجرد وصول الأسماك المعدلة وراثيا المحتملة إلى سن التكاثر ، قم بفحصها بشكل فردي بحثا عن كل من انتقال الخط الجرثومي والتعبير الجيني عن طريق تربيتها إلى أسماك الزرد من النوع البري.
  5. يتم الاحتفاظ بالبالغين الذين تنمو أجنةهم بشكل طبيعي وتعطي أقوى وأنسب تعبير عن الجينات المحورة كخطوط فريدة من نوعها لأسماك الزرد المعدلة وراثيا للعمل والتحليلات المستقبلية.
    ملاحظة: كنهج بديل لفحص الإدخال الجينومي للتركيبات المعدلة وراثيا ، صمم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تضخم فقط البنية المعدلة وراثيا وليس الحمض النووي من النوع البري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوليد التركيبات المعدلة وراثيا ، استخدمنا نظام التحوير Tol2. تم استخدام ثلاثة ناقلات دخول ، بما في ذلك p5E ، الذي يحمل عناصر المروج / المحسن للجين ، pME ، الذي يحمل الجين المراد التعبير عنه بواسطة عناصر المروج / المحسن ، و p3E الذي يحمل ، على الأقل ، ذيل polyA ، لتوليد البنية المعدلة وراثيا عبر استنساخ LR متعدد المواقع. يوفر ناقل الوجهة ، pDest ، تكرارات Tol2 للإدخال الجيني للبنية المعدلة وراثيا في أجنة الزرد ويحتوي على جميع المعلومات الوراثية الأساسية لنمو البكتيريا (الشكل 1 أ). لأغراض هذه المخطوطة ، أنشأنا وحقننا بنية معدلة وراثيا sox17: EGFPCAAX . تم استخدام مروج علامة الأديم الباطن ، sox17 ، لدفع EGFP الموسوم بالغشاء في الأديم الباطن النامي لسمك الزرد. بالنسبة للتركيبات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات غير الفلورية ، يمكن استخدام ناقل pDest الذي يحتوي على علامة محورة وراثيا فلورية مثل cmlc2: EGFP للمساعدة في الإدخال الجينومي (الشكل 1 أ).

باستخدام القيم الموضحة في البروتوكول أعلاه (الجدول 2) ، تم إنشاء بنية sox17: EGFPCAAX المعدلة وراثيا ، وتم تحويل 4 ميكرولتر من هذا البناء إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية طوال الليل ، احتوت صفيحة أجار على ما يقرب من 250 مستعمرة (عادة ما يبلغ متوسط تفاعلات LR 150-300 مستعمرة لكل صفيحة في مختبرنا). تم إجراء فحص هذه المستعمرات على أساس التعتيم. في أيدينا ، كانت المستعمرات التي كانت واضحة تحتوي على منتج sox17: EGFPCAAX الصحيح >85٪ من الوقت ، في حين أن المستعمرات غير الشفافة لم تحتوي أبدا على منتج إعادة التركيب الصحيح (الشكل 1 ب ، رأس السهم مقابل السهم). بعد عزل البلازميد من عدة مستعمرات ، تم إجراء هضم تقييد المنتجات المؤتلفة باستخدام إنزيم التقييد ، NcoI. تم هضم مستعمرتين واضحتين مختلفتين ومستعمرة واحدة غير شفافة. كان لكل من المستعمرات الصافية شريط واحد بالحجم الصحيح 9544 نقطة أساس (البلازميدات غير المهضومة المحملة كعنصر تحكم في الهضم) ، في حين أن المستعمرة غير الشفافة لم يكن لديها أي نطاقات على الإطلاق (الشكل 2 أ). تم إعادة تحويل هذه التركيبات الإيجابية sox17: EGFPCAAX ، وتم إعادة تخطيط المستعمرات اللاحقة ، وتم تأكيد أن تلك المستعمرات تحتوي على البلازميد ، وتم إنشاء مخزون التجميد البكتيري −80 درجة مئوية. تم تحديد تركيزات كل من بلازميد sox17: EGFPCAAX و mRNA المتصل بالترانسبوزاز بحيث يمكن استخدامهما للحقن (الشكل 2 ب).

تم تحضير الأجنة للحقن عن طريق وضع أجنة في مرحلة خلية واحدة في قالب حقن جنين تم تسخينه مسبقا (الشكل 3A-C). بمجرد وضعها في قالب الحقن ، تم وضع إبرة الحقن التي تحتوي على sox17: EGFPCAAX mRNA في حامل ماصة دقيقة على المناولة الدقيقة (الشكل 3D ، E). تم حقن الأجنة ب 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المرسال ، و 150 نانوغرام من بلازميد sox17: EGFPCAAX ، والفينول الأحمر (صبغة تتبع الحقن). تم حقن بلعة 3 nL (محددة حسب الحجم كما هو موضح في البروتوكول ، الخطوة 6.6) في جسم الخلية وليس في صفار الجنين للحصول على أفضل فرصة للتكامل (الشكل 3F) 10.

بعد الحقن ، تمت إزالة الأجنة من قالب الحقن وسمح لها بالتطور لمدة 24 ساعة. في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، تم فحص الأجنة لتعبير الأديم الباطن ل EGFPCAAX. لوحظ تعبير الأديم الباطن الفسيفسائي EGFPCAAX في ~ 75٪ من الأجنة المحقونة (الشكل 4A ، A'). لفحص الأجنة المحقونة بجينات محورة غير فلورية مثل Gal4 أو CreERT2 ، يمكن استخدام ناقل وجهة يحتوي أيضا على علامة محورة وراثيا (أي cmlc2: EGFP) (الشكل 1 أ) (الشكل 4B ، B). أنتجت أسماك الزرد البالغة التي لديها جينات محورة من الخط الجرثومي ل sox17: EGFPCAAX أجنة فلورية مع الأديم الباطن المسمى بالكامل ب EGFPCAAX (الشكل 4C).

باستخدام خط sox17: EGFPCAAX المعدل وراثيا الذي تم إنشاؤه حديثا ، تمكنا من تقييم تأثير الإيثانول بشكل مباشر على تكوين أكياس الأديم الباطن. الأكياس عبارة عن نتوءات تتشكل على الحافة الجانبية للأديم الباطن وهي مهمة لتشكيل الهيكل العظمي للوجه وأنظمة الأعضاء المتعددة17. لقد أظهرنا سابقا أن حجب إشارات البروتين المورفولوجي العظمي (Bmp) يؤدي إلى نقص تنسج الأكياس18. نظهر الآن أن معالجة الإيثانول لمتحولات Bmp من 10-18 hpf لها تأثير دقيق ولكنه مهم على حجم الحقيبة. تم قياس الطول الظهري البطني لكل كيس من الأكياس 1-5 (يحتوي الزرد على ست أكياس ، لكن السادس لم يتشكل بالكامل بعد في مرحلة النمو المصورة) في الأجنة الطافرة Bmp من النوع البري المعالج بالإيثانول (الشكل 5 أ). كعنصر تحكم في تأثيرات النمو العامة بسبب التعرض للإيثانول ، تم قياس الطول الأمامي الخلفي للأديم الباطن بأكمله (الشكل 5 أ). لم يتأثر الطول الكلي للأديم الباطن بالنمط الجيني أو العلاج (الشكل 5 ب). ومع ذلك ، أظهرت الأكياس 1 و 3 زيادات كبيرة في طول الحقيبة بين الأجنة البرية غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول ولكن انخفاضات كبيرة في الطول بين طفرات Bmp غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول (الشكل 5C ؛ ANOVA ثنائي الاتجاه ؛ الحقيبة 1: F (1،54) = 10.39 ، p = 0.0021 ؛ الحقيبة 3: F (1،54) = 12.70 ، p = 0.0008). أظهرت الحقيبة 2 زيادات كبيرة في حجم الحقيبة بين المجموعات الطافرة من النوع البري غير المعالج والمعالج بالإيثانول و Bmp ، على التوالي (الشكل 5C ؛ ANOVA ثنائي الاتجاه ؛ ANOVA. F (1,54) = 18.94 ، ص < 0.0001).

Figure 1
الشكل 1: تفاعل بوابة LR لبناء الجينات المحورة. (أ) رسم تخطيطي لتفاعل استنساخ بوابة LR المعياري المكون من أربعة أجزاء. يعيد LR Clonase دمج نواقل الدخول الثلاثة ، p5E و pME و p3E ، وناقل الوجهة ، pDest ، في تفاعل محدد للغاية لتوليد منتج جديد معدل وراثيا جاهز لحقن الجنين. لفحص الجينات المحورة غير الفلورية ، يمكن أن تحتوي ناقلات pDest على علامات محورة وراثيا اختيارية (cmlc2: EGFP ، كمثال). (ب) مثال على المستعمرات البكتيرية التي تم الحصول عليها من تحويل منتجات إعادة التركيب LR. احتوت المستعمرات الواضحة على منتج إعادة تركيب LR صحيح >85٪ من الوقت (رأس السهم) ، بينما لم تحتوي المستعمرات غير الشفافة أبدا على منتج إعادة التركيب الصحيح (السهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل الحمض النووي البلازميد والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الترانسبوليز. أ: الهضم التشخيصي للمستعمرات الثلاث الناتجة عن تحول نواتج إعادة التركيب LR. لم تحتوي المستعمرة المفردة غير الشفافة على أي بلازميد للفحص ، بينما احتوت المستعمرتان الواضحتان على شريط واحد عند 9544 نقطة أساس (غير مقطوع مقابل مقطوع). (ب) الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) عند 1950 bp. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: إعداد حقن جنين الزرد. (أ) يتم وضع قالب حقن في أغاروز سائل مخفف في EM (3٪ v / v). (ب) بمجرد صلابته، يزال القالب من صفيحة الأغاروز. ج: الأجنة مرتبة في قوالب الحقن. (د، ه) يتم سحب خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر في إبرة الحقن ، والتي يتم وضعها في حامل الماصة الدقيقة في المناولة الدقيقة. (و) تحقن بلعة مقدارها 3 nL في جسم خلية الجنين في مرحلة الخلية الواحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: فحص أسماك الزرد المحقونة بالبنية المعدلة وراثيا. (أ ، أ) تظهر الصورة البؤرية لجنين تم تصويره عند 24 hpf التعبير الفسيفسائي لجين التحوير sox17: EGFPCAAX. (ب ، ب) تعبير علامة معدلة وراثيا ل cmlc2: EGFP في القلب النامي عند 24 hpf. مناظر جانبية للأجنة ، مع وجود أمامي إلى اليسار وظهري في الأعلى. (ج) صورة متحدة البؤر لجنين ناتج عن سمكة الزرد البالغة الحاملة لجين التحوير. الأديم الباطن بأكمله يعبر عن EGFPCAAX. منظر جانبي للجنين ، مع وجود أمامي إلى اليسار وبطني في الأعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قياسات الحقيبة في الأجنة الطافرة من النوع البري المعالج بالإيثانول والأجنة الطافرة Bmp. (أ) رسم تخطيطي يوضح قياس الطول الكلي للأديم الباطن وطول الأكياس. (ب) لا تظهر قياسات طول الأديم الباطن الأمامي الخلفي الكلي أي فرق بين الأجنة البرية غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول والأجنة الطافرة Bmp. (ج) تشير قياسات طول الحقيبة الظهرية البطنية إلى أن الحقيبتين 1 و 3 تظهران زيادات في طول الحقيبة بين الأجنة البرية غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول ولكنها تتناقص في الطول بين طفرات Bmp غير المعالجة والمعالجة بالإيثانول (ANOVA ثنائي الاتجاه ؛ الحقيبة 1: F (1،54) = 10.39 ، p = 0.0021 ؛ الحقيبة 3: F (1،54) = 12.70 ، p = 0.0008). تظهر الحقيبة 2 زيادة في الطول بين المجموعات الطافرة من النوع البري غير المعالج والمعالج بالإيثانول و Bmp (ANOVA ثنائي الاتجاه; F (1,54) = 18.94 ، ص < 0.0001). لم تلاحظ فروق في طول الحقيبة بين الحقيبتين 4 و 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مكونات Tol2Kit الموجودة في Lovely Lab. كل متجه دخول ووجهة متاح في Lovely Lab وأوصافهم ومختبرهم الأصلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: حساب كمية وتنسيق كل متجه في تفاعل إعادة التركيب LR. تم حساب كمية كل متجه من الحجم (في bp) و fmol اللازم لكل مكون: 10 fmol من كل متجه إدخال و 20 fmol من متجه الوجهة. من تركيز البلازميد ، يتم تخفيف كل ناقل في ماء معقم لإضافة 1 ميكرولتر أو أقل إلى تفاعل LR. يضاف الماء المعقم إلى حوض النواقل ليساوي 4 ميكرولتر ، ويضاف 1 ميكرولتر من مزيج تفاعل LR إلى التفاعل ، ويتم تحضينه عند 25 درجة مئوية طوال الليل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتبر الزرد مناسبا بشكل مثالي لدراسة تأثير التعرض للإيثانول على حالات النمووالمرض 7,8. ينتج الزرد أعدادا كبيرة من الأجنة الشفافة والمخصبة خارجيا والقابلة للسحب وراثيا ، مما يسمح بالتصوير الحي للعديد من الأنسجة وأنواع الخلايا الموسومة بالجينات المحورة في وقت واحد في سياقات بيئية متعددة19,20. هذه القوة ، جنبا إلى جنب مع الحفظ الوراثي التنموي القوي مع البشر ، تجعل الزرد نظاما نموذجيا قويا لتصوير تأثير الإيثانول 7,8. هنا ، وصفنا بروتوكول النهج المعياري لتوليد وحقن التركيبات المعدلة وراثيا وإنشاء خطوط الزرد المعدلة وراثيا لدراسات الإيثانول المستقبلية.

تم إنشاء العديد من الأساليب المختلفة لتوليد الزرد المعدل وراثيا. ومع ذلك ، فإن توليد كل من التركيبات المعدلة وراثيا والخطوط المعدلة وراثيا يمكن أن يكون أمرا شاقا. في حين أن تقنيات الاستنساخ الفرعية التقليدية ، أو استنساخ BAC ، أو النهج القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل مثل تجميع جيبسون تسمح بتوليد تركيبات محورة وراثيا ، إلا أنها تتمتع بإنتاجية منخفضة وتفتقر إلى التنوع في بنائها10. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إعادة تصميم هذه الاستراتيجيات لكل بنية معدلة وراثيا تم إنشاؤها. يتطلب الاستنساخ الفرعي عمليات هضم وربط متعددة ، على افتراض أن جميع مواقع التقييد اللازمة موجودة وفريدة من نوعها. يتطلب استنساخ BAC تسلسل واختبار العديد من استنساخ BAC. لتجميع جيبسون ، يجب تصميم بادئات PCR جديدة لكل بنية معدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، يؤدي حقن الحمض النووي غير المصقول أو الخطي إلى انخفاض انتقال الخط الجرثومي21،22،23.

Tol2Kit هو نظام معياري يستخدم استنساخ البوابة لتوليد تركيبات معدلة وراثيا كاملة محاطة بتكرار Tol2 ، عند دمجها مع الحمض النووي الريبي المرسال transposase ، تزيد بشكل كبير من الجينات المحورة وانتقال الخط الجرثومي10،11،24،25. تتوفر العشرات من متجهات الدخول والوجهة من مختبر كوان ومختبر كول10،11. بالإضافة إلى ذلك ، قامت مختبرات الزرد التي تستخدم Tol2Kit بإنشاء وتنظيم العديد من ناقلات الدخول والوجهة. وكمثال على اتساع المتجهات المتاحة، قمنا بتجميع واستخدام أكثر من 70 متجه (الجدول 1). مع كل هذه الموارد المجتمعية ، يمكن للمرء أن يولد بسرعة الآلاف من التركيبات المعدلة وراثيا المختلفة ببساطة عن طريق الجمع بين المتجهات المفضلة في تفاعل LR.

تتطلب تفاعلات LR المثلى حسابات دقيقة لحجم البلازميد وتركيزه. يتم إجراء حسابات كل متجه بقيم الفيمتومول (fmol) ، لذلك لا يتطلب كل تفاعل حجم بلازميد مرتفع لتوليد بنية محورة وراثيا. ومع ذلك ، فإن هذه الكمية الصغيرة من البلازميد تجعل التخفيفات والماصات المناسبة حاسمة للغاية لنجاح التفاعل10. العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على تفاعل LR هي حجم الإدخالات في متجهات الدخول المختلفة. على سبيل المثال ، يزيد عنصر p5E-sox17 المستخدم في هذه الدراسة عن 4 كيلو بايت ، والذي ، إذا تم دمجه مع عناصر pME و p3E كبيرة بنفس القدر ، فسيؤدي إلى ناقل معدل وراثيا كبير جدا. قد يكون من الصعب زراعة البلازميد الكبير في البكتيريا ، مما يقلل من عدد المستعمرات الناتجة عن التحول البكتيري. سيؤدي هذا أيضا إلى تباطؤ النمو وانخفاض مستويات البلازميد عند عزله10. الأهم من ذلك ، أن وجود خلايا بكتيرية عالية الكفاءة ، وكذلك زيادة حضانة الخلايا البكتيرية أثناء تحول بلازميد إعادة التركيب ، هي المفتاح لتوليد مستعمرات كافية لالتقاط تكوين الجينات المحورة المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام إنزيم تفاعل LR الصحيح (المدرج في جدول المواد) يلعب أيضا دورا رئيسيا في نجاح تفاعل LR.

بالإضافة إلى توليد بنية معدلة وراثيا وتحولات بكتيرية ، قد يكون حقن الجنين وتكامل الجينوم صعبا أيضا. إن توليد الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الجودة يزيد بشكل كبير من تواتر التكامل الجيني10. يجب عمل الشعيرات الدموية المسحوبة قبل وقت قصير من حقن الأجنة لأن الإبر القديمة يمكن أن تفقد العمل الشعري (أي أن سائل الحقن يفشل في الانتقال إلى طرف الإبرة) (الشكل 3E). يتطلب كل من كسر طرف الإبرة لحقن ~ 3 nL فقط من السوائل وحقن جسم الخلية الممارسة. يتضمن بروتوكول التدريب الخاص بنا حقن جسم الخلية بصبغة حقن الفينول الحمراء فقط حتى يتم إتقان كسر الإبرة وحقن الأجنة. يؤدي حقن جسم الخلية إلى زيادة كبيرة في معدل تكامل الجينوم10. بالجمع بين كل هذا ، يبلغ متوسط إدخال الجينوم وتعبير الفسيفساء 75٪ أو أكثر ، ولكن هذا يمكن أن يختلف من بناء إلى آخر.

نظرا لأن الإدخال الجينومي يمكن أن يكون عشوائيا ، فإن كل جنين يظهر تعبيرا فسيفسائيا هو إدخال وراثي فريد ويتطلب فحصا مستمرا. هذا الفحص المستمر ضروري لإظهار أن موقع التكامل لا يضر بتطور الجنين ، وأن انتقال الخط الجرثومي يحدث ، وأن التعبير عن جين التحوير لا يتم تخفيفه أو احتمال إسكاته. بمجرد إنشاء خط معدل وراثيا ، يمكن استخدامه بسهولة لإجراء تحليلات متعددة في دراسات الإيثانول. بالنسبة لتلك التركيبات المعدلة وراثيا غير الفلورية ، تشمل العلامات المعدلة وراثيا شائعة الاستخدام cmlc2: GFP و αcrystallin: RFP ، والتي تسمي القلب والشبكية ، على التوالي ، وتسمح باستمرار الفحص الوراثي. بالإضافة إلى العلامات المعدلة وراثيا للفحص ، يمكن استخدام هذين الجينين المحورين لدراسة تأثير الإيثانول مباشرة على نمو القلب والشبكية.

باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، أنشأنا خط سمك الزرد المعدل وراثيا sox17: EGFPCAAX الذي كان له انتقال جرثومي مستقر لبنية EGFP الموسومة بغشاء خاص بالأديم الباطن. باستخدام هذا الخط ، تمكنا من قياس تأثير الإيثانول على تكوين الجيب الباطن في الأجنة الطافرة Bmp الحساسة للإيثانول. لقد أظهرنا أن أحجام الأكياس 1-3 ولكن ليس الأكياس 4 و 5 ولا طول الأديم الباطن الكلي قد تأثرت في طفرات Bmp المعالجة بالإيثانول (الشكل 5). يشير هذا العمل التجريبي إلى أن تفاعل Bmp-ethanol يعطل تكوين الأديم الباطن ، ولا سيما سلوكيات الخلية الكامنة وراء تكوين الحقيبة. يجسد هذا العمل فائدة توليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا لدراسات الإيثانول. نتيجة لذلك ، فإن إنشاء خطوط معدلة وراثيا جديدة سيزيد بشكل كبير من فهمنا للعمليات الخلوية الحساسة للإيثانول وأحداث الأنسجة في FASD.

في النهاية ، أثبتت أسماك الزرد المعدلة وراثيا ، وسمك الزرد بشكل عام ، أنها قوية بشكل لا يصدق في دراسة FASD 7,8. Tol2Kit عبارة عن مجموعة أدوات متعددة الاستخدامات للغاية تمكن الباحثين من إنشاء تركيبات متعددة وراثية جاهزة للحقن في الزرد بسرعة. يؤدي التصميم المعياري وسهولة توليد متجهات دخول جديدة إلى مرونة قصوى في توليد تركيبات معدلة وراثيا دون الحاجة إلى إعادة تصميم أي مكونات. بشكل عام ، ستعمل مجموعة الأدوات هذه على تحسين كل من أبحاث الزرد والبحوث بشكل عام التي تهدف إلى تحسين فهم FASD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 189 ، نموذج الحيوان ، الزرد ، التنمية ، الإيثانول ، اضطرابات طيف الكحول الجنيني ، الجينات المحورة ، استنساخ البوابة متعددة المواقع ، Tol2Kit
نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. … More

Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter