Summary
Questo lavoro descrive un protocollo per il sistema modulare di transgenesi Tol2, un metodo di clonazione basato su gateway per creare e iniettare costrutti transgenici in embrioni di zebrafish.
Abstract
I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) sono caratterizzati da un insieme altamente variabile di difetti strutturali e disturbi cognitivi che insorgono a causa dell'esposizione prenatale all'etanolo. A causa della complessa patologia della FASD, i modelli animali si sono dimostrati fondamentali per la nostra attuale comprensione dei difetti di sviluppo indotti dall'etanolo. I pesci zebra hanno dimostrato di essere un potente modello per esaminare i difetti di sviluppo indotti dall'etanolo a causa dell'alto grado di conservazione sia della genetica che dello sviluppo tra zebrafish e umani. Come sistema modello, i pesci zebra possiedono molti attributi che li rendono ideali per gli studi sullo sviluppo, tra cui un gran numero di embrioni fecondati esternamente che sono geneticamente trattabili e traslucidi. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione i tempi e il dosaggio dell'esposizione all'etanolo in più contesti genetici. Un importante strumento genetico disponibile nel pesce zebra è la transgenesi. Tuttavia, generare costrutti transgenici e stabilire linee transgeniche può essere complesso e difficile. Per affrontare questo problema, i ricercatori del pesce zebra hanno stabilito il sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposoni. Questo sistema modulare utilizza un approccio di clonazione gateway multisito per l'assemblaggio rapido di costrutti transgenici completi basati su trasposoni Tol2. Qui, descriviamo la cassetta degli attrezzi flessibile del sistema Tol2 e un protocollo per generare costrutti transgenici pronti per la transgenesi del pesce zebra e il loro uso negli studi sull'etanolo.
Introduction
L'esposizione prenatale all'etanolo dà origine a un continuum di deficit strutturali e disturbi cognitivi definiti disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)1,2,3,4. Le complesse relazioni tra molteplici fattori rendono difficile lo studio e la comprensione dell'eziologia della FASD negli esseri umani. Per risolvere questa sfida, è stata utilizzata un'ampia varietà di modelli animali. Gli strumenti biologici e sperimentali disponibili in questi modelli si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione delle basi meccanicistiche della teratogenicità dell'etanolo e i risultati di questi sistemi modello sono stati notevolmente coerenti con ciò che si trova negli studi sull'etanolo umano 5,6. Tra questi, i pesci zebra sono emersi come un potente modello per studiare la teratogenesi dell'etanolo7,8, in parte a causa della loro fecondazione esterna, alta fecondità, trattabilità genetica ed embrioni traslucidi. Questi punti di forza si combinano per rendere il pesce zebra ideale per studi di imaging live in tempo reale di FASD utilizzando linee di zebrafish transgeniche.
I pesci zebra transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studiare molteplici aspetti dello sviluppo embrionale9. Tuttavia, la creazione di costrutti transgenici e successive linee transgeniche può essere estremamente difficile. Un transgene standard richiede un elemento promotore attivo per guidare il transgene e un segnale o "coda" poli A, il tutto in un vettore batterico stabile per il mantenimento generale del vettore. La generazione tradizionale di un costrutto transgenico multicomponente richiede più fasi di sub-clonazione che richiedono molto tempo10. Gli approcci basati sulla PCR, come l'assemblaggio Gibson, possono aggirare alcuni dei problemi associati alla subclonazione. Tuttavia, primer unici devono essere progettati e testati per la generazione di ogni costrutto transgenico unico10. Oltre alla costruzione del transgene, anche l'integrazione genomica, la trasmissione della linea germinale e lo screening per una corretta integrazione transgenica sono stati difficili. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo del sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposone (Tol2Kit)10,11. Questo sistema modulare utilizza la clonazione multisito di gateway per generare rapidamente più costrutti transgenici da una libreria in continua espansione di vettori "ingresso" e "destinazione". Gli elementi trasponibili Tol2 integrati aumentano notevolmente il tasso di transgenesi, consentendo la rapida costruzione e integrazione genomica di più transgeni. Utilizzando questo sistema, mostriamo come la generazione di una linea di zebrafish transgenico endoderma può essere utilizzata per studiare i difetti strutturali tessuto-specifici alla base della FASD. In definitiva, in questo protocollo, dimostriamo che la configurazione modulare e la costruzione di costrutti transgenici aiuteranno notevolmente la ricerca FASD basata sul pesce zebra.
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Protocol
Tutti gli embrioni di zebrafish utilizzati in questa procedura sono stati allevati e allevati seguendo i protocolli IACUC stabiliti12. Questi protocolli sono stati approvati dall'Università di Louisville.
NOTA: In questo studio sono stati utilizzati il ceppo zebrafish wild-type, AB, e la linea mutante doppia bmp4st72;smad5b1100 . Tutta l'acqua utilizzata in questa procedura era acqua sterile ad osmosi inversa. Le immagini confocali sono state scattate con un microscopio confocale a scansione laser. Le misurazioni dell'endoderma sono state effettuate utilizzando lo strumento di misurazione in ImageJ. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software statistici.
1. Realizzare le soluzioni e i media
- Mezzi batterici: sciogliere il brodo LB o l'agar secondo le istruzioni del produttore e l'autoclave. Prima di versare il terreno in piastre di Petri da 100 mm, aggiungere ampicillina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o una combinazione ampicillina/cloramfenicolo (50 μg/mL e 30 μg/mL, rispettivamente).
- Per ottenere 20 x supporti embrionali, sciogliere quanto segue in 1 L di acqua: 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl, 2,9 g di CaCl 2, 0,41 g di K 2 HPO 4, 0,142 g di Na 2 HPO 4 e 4,9 g di MgSO4·7H 2O. Filtrare-sterilizzare la soluzione madre utilizzando un sistema di filtrazionesotto vuoto da 0,22 μm, e conservare a 4 °C.
NOTA: ignorare il precipitato bianco che si forma; Questo non avrà alcun impatto sui media. - In 19 L di acqua, sciogliere 1,2 g di NaHCO3 e aggiungere 1 L del 20x embrione media stock per generare la soluzione di supporto embrionale funzionante e mantenere questa soluzione a 28 °C.
- Per una soluzione di rosso fenolo al 2%, sciogliere 20 mg di sale sodico rosso fenolo in 1 mL di acqua priva di RNasi e conservare a temperatura ambiente.
2. Stampi per iniezione di embrioni
- Per preparare la piastra di iniezione dell'agarosio, sciogliere l'agarosio nel mezzo embrionale fino a una concentrazione finale del 3% riscaldando a ebollizione.
- Versare 50 ml di agarosio in piastre di Petri da 100 mm e, mentre l'agarosio è ancora liquido, posizionare delicatamente lo stampo ad iniezione nell'agarosio per evitare la formazione di bolle sotto lo stampo.
- Lasciate raffreddare i piatti di agarosio. Una volta che l'agarosio è solido, rimuovere lo stampo per iniezione e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
3. Pipette a iniezione
- Tirare capillari da 1,0 mm (OD) contenenti un filamento in aghi utilizzando un estrattore di pipette verticale con il solenoide impostato su 2,5 e l'elemento riscaldante impostato su 14,6.
NOTA: Qualsiasi estrattore riscaldato funzionerà se tira i capillari in due aghi in modo pulito e uniforme, ma gli aghi per iniezione devono essere tirati entro 1 settimana dall'iniezione degli embrioni di zebrafish per ottenere risultati di iniezione coerenti.- Posizionare il capillare nell'estrattore, stringere il morsetto a ciascuna estremità, quindi attivare l'elemento riscaldante.
- Tirare i capillari per creare due aghi per iniezione.
- Rimuovere i capillari dall'estrattore e conservarli in una capsula di Petri vuota con una striscia di argilla modellante che funge da portaaghi.
4. Preparazione dell'mRNA transposasi
- Linearizzare il plasmide Tol2Kit contenente trasposasi con un'endonucleasi di restrizione NotI combinando quanto segue in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml: 10 μL di plasmide di trasposasi (150 ng/μL), 1,5 μL di tampone di reazione endonucleasi di restrizione, 0,3 μL di endonucleasi NotI.
- Riempire la reazione fino a 20 μL con acqua priva di RNasi, quindi mescolare e digerire a 37 °C durante la notte.
- Interrompere la digestione della trasposasi aggiungendo 1 μL di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL di 5 M NH4OAc e 80 μL di 100% EtOH alla reazione di digestione, quindi mescolare e raffreddare a -20 °C durante la notte.
- Centrifugare la soluzione a 14.000x g per 20 minuti a 4 °C, quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet di DNA in acqua priva di RNasi.
- Determinare la concentrazione lineare del plasmide in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro facendo prima scorrere 2 μL di un bianco d'acqua privo di RNasi e quindi facendo scorrere 2 μL del plasmide linearizzato.
NOTA: Le concentrazioni di plasmidi variano tipicamente tra 100-200 ng/μL - Impostare la produzione di mRNA SP6 combinando i seguenti componenti in ordine in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml: 10 μL di 2x NTP/CAP, 2 μL di tampone di reazione 10x, 0,1-1 μg di modello lineare di DNA e 2 μL di miscela enzimatica SP6.
- Riempire la reazione fino a 20 μL con acqua priva di RNasi, quindi miscelare e incubare a 37 °C per 2 ore.
- Dopo l'incubazione per 2 ore, aggiungere 1 μL di DNasi, mescolare bene e incubare per altri 15 minuti a 37 °C.
- Per arrestare la reazione SP6, aggiungere 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl al tubo di reazione, quindi mescolare e raffreddare a -20 °C durante la notte.
- Centrifugare la soluzione a 14.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettare l'mRNA, quindi aspirare il surnatante e lavare il pellet di mRNA con 1 mL di EtOH all'80% (diluito con acqua priva di RNasi).
- Centrifugare la soluzione a 14.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettare l'mRNA, quindi aspirare il surnatante. Lasciare asciugare il pellet all'aria.
- Risospendere il pellet di mRNA in 20 μL di acqua priva di RNasi, determinare la concentrazione di mRNA in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro come descritto al punto 4.5 (dovrebbe essere almeno 100 ng/μL), aliquote 100 ng di mRNA per provetta monouso e conservare a -80 °C.
NOTA: Per assicurarsi che l'mRNA non sia degradato, 2 μL di mRNA possono essere rapidamente eseguiti su un gel di elettroforesi del DNA per confermare una singola banda a 1.950 bps.
5. Clonazione di gateway multisito per creare vettori di ingresso per la transgenesi
NOTA: Questo protocollo è modificato da Kwan et al.10, con la reazione LR scritta come una reazione semi-LR e con un volume totale di 5 μL. Per generare nuovi elementi di ingresso, le reazioni BP utilizzando vettori donatori 5', medi e 3' devono essere utilizzati10,13.
- Per eseguire la reazione, raccogliere 10 fmol ciascuno di p5E, pME e p3E e 20 fmol del vettore di destinazione (pDest).
NOTA: La ricombinazione LR multisito utilizza quattro diversi vettori plasmidici: un vettore di ingresso 5' (p5E), un vettore di entrata intermedia (pME), un vettore di ingresso 3' (p3E) e un vettore di destinazione (pDest), per generare un costrutto transgenico unico affiancato da ripetizioni Tol2 pronte per essere iniettate in embrioni di zebrafish.- Identificare la dimensione di tutti e quattro i vettori in coppie di basi dalla sorgente del plasmide (Tabella 1, Tol2Kit Wiki pagina14 o Addgene11; vedere la Tabella dei materiali).
NOTA: Per i nuovi vettori, il sequenziamento plasmidico completo tramite società di sequenziamento commerciale può fornire l'esatta dimensione del plasmide in bps. - Determinare la concentrazione di tutti e quattro i vettori in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro, come descritto al punto 4.5.
- Utilizzando il peso del DNA come 660 g / mol e la dimensione del plasmide (in bps), calcolare i nanogrammi totali (ng) di plasmide necessari per raggiungere 10 fmol (vettori di ingresso) o 20 fmol (vettore di destinazione).
NOTA: Il laboratorio Mosimann presso l'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus, ha generato un foglio di calcolo liberamente disponibile per calcolare la quantità di plasmide necessaria (in ng) e il volume (in μL) dei vettori necessari nella reazione LR15.
- Identificare la dimensione di tutti e quattro i vettori in coppie di basi dalla sorgente del plasmide (Tabella 1, Tol2Kit Wiki pagina14 o Addgene11; vedere la Tabella dei materiali).
- Per generare il costrutto descritto di seguito, sox17: EGFPCAAX, utilizzare i seguenti vettori: un vettore p5E contenente il promotore sox17 del pesce zebra, che è 6.918 bp di dimensione16; un vettore pME contenente l'EGFP prenilato, di dimensioni10 di 3.345 bp; un vettore p3E contenente la sequenza di segnali SV40 late poly A, di dimensione10 di 2.838 bp; e il pDest, che è 5.883 bp in taglia10.
- Utilizzando la concentrazione del plasmide determinata nella fase 5.1.2 e la quantità in nanogrammi (ng) per ciascun vettore (fase 5.1.3), calcolare i microlitri totali (μL) di ciascun plasmide necessari per raggiungere 10 fmol (vettori di ingresso) o 20 fmol (vettore di destinazione), quindi dividerli per due per l'uso nelle reazioni semiLR da 5 μL (tutti i valori elencati di seguito sono elencati nella Tabella 2).
- Per generare 10 fmol di p5E-sox17, utilizzare 45,66 ng (ad una concentrazione di 140,3 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 4 per ottenere 0,65 μL.
- Per generare 10 fmol di pME-EGFPCAAX, utilizzare 22,08 ng (ad una concentrazione di 213,5 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 10 per ottenere 0,52 μL.
- Per generare 10 fmol di p3E-poli A, utilizzare 15,73 ng (ad una concentrazione di 276,1 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 20 per ottenere 0,57 μL.
- Per 20 fmol del vettore di destinazione, utilizzare 77,66 ng di pDest (ad una concentrazione di 307,3 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 5 per ottenere 1,63 μL.
- Per impostare una reazione semi-LR da 5 μL, combinare i volumi di p5E, pME, p3E e pDest determinati nella fase 5.3 in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml, quindi aggiungere acqua sterile per raggiungere un volume di reazione totale di 4 μL.
- Vortice vigorosamente la miscela enzimatica LR 2x per 1 minuto ciascuno per garantire una corretta miscelazione, quindi aggiungere 1 μL alla reazione e mescolare accuratamente.
- Incubare a 25 °C durante la notte (16+ h).
- Interrompere la reazione LR aggiungendo 0,5 μL di proteinasi K (2 μg/μL), incubare a 37 °C per 10 minuti e quindi raffreddare a temperatura ambiente.
- Trasformare 3-4 μL di plasmide in cellule scongelate e chimicamente competenti aggiungendo il plasmide e lasciando riposare le cellule sul ghiaccio per 25-30 minuti.
- Mentre le cellule siedono sul ghiaccio, riscaldare due piastre di agar ampicillina LB a temperatura ambiente.
- Shock termico delle celle a bagnomaria a 42°C per 30 secondi precisi.
- Dopo lo shock termico, aggiungere 250 μL di mezzo liquido ricco e privo di antibiotici alle cellule e incubare agitando a 37 °C per 1,5 ore.
- Distribuire 300 μL di batteri su una piastra di ampicillina e incubare a 37°C durante la notte.
- La mattina seguente, esaminare le colonie per la presenza di due fenotipi, chiaro e opaco, scegliere le colonie chiare (come descritto in Kwan et al.10) una alla volta, inoculare la coltura liquida e quindi agitare a 37 ° C durante la notte.
NOTA: Le colonie chiare contengono quasi sempre la colonia LR corretta (>85% delle volte). - Utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, eseguire una preparazione plasmidica su ciascuna coltura liquida e digerire diagnosticamente ciascun plasmide per confermare la dimensione appropriata del costrutto transgenico, il che indica che la reazione gateway LR ha funzionato correttamente.
- Ritrasformare i costrutti transgenici corretti utilizzando il protocollo standard di trasformazione batterica come descritto nelle fasi 5.4-5.12 utilizzando 0,5-1 μL del plasmide e incubare solo a 37 °C per 1 ora.
- Ri-striare le colonie e confermare che ognuna ha il costrutto transgenico LR come nel punto 5.14.
- Determinare la concentrazione plasmidica come descritto al punto 4.5 (per l'iniezione dell'embrione sono necessari almeno 150 ng/μL).
6. Iniezione del transgene negli embrioni
- Scongelare un campione di mRNA trasposasi monouso e un costrutto transgenico Tol2 sul ghiaccio e preavvertire una piastra di iniezione di agarosio a temperatura ambiente.
- Combinare quanto segue su ghiaccio: 150 ng di plasmide, 100 ng di mRNA trasposasi e 2% rosso fenolo (0,3 μL). Quindi, aggiungere acqua priva di RNA per aumentare il volume a 3 μL.
- Trasferire gli embrioni allo stadio di una cellula utilizzando pipette di trasferimento sulla piastra di iniezione (descritta al punto 2) riempita con EM che copre completamente l'agar, quindi premere delicatamente circa 50-75 embrioni per fessura della piastra di iniezione.
- Aggiungere la miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo all'estremità aperta di un ago di iniezione capillare, posizionare l'ago capillare nell'armatura del carro di iniezione e accendere il carro di iniezione.
NOTA:Il carro di iniezione utilizza gas compresso, come l'aria, per pulsare il volume desiderato (descritto al punto 6.5) della miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo nell'embrione quando attivato. - Abbassare l'ago capillare nell'EM della piastra di iniezione e rompere la punta usando una pinza per consentire solo una piccola quantità di miscela rosso mRNA / plasmide / fenolo da pompare fuori dal carro di iniezione.
- Iniettare gli embrioni con un piccolo bolo di 3 nL della miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo nel corpo cellulare dell'embrione.
NOTA: Un bolo di 3 nL è un volume di miscela rosso mRNA / plasmide / fenolo in cui sette boli possono teoricamente adattarsi ugualmente attraverso la linea mediana dell'embrione. - Al termine dell'iniezione degli embrioni, rimuoverli dalla piastra di iniezione estraendoli delicatamente dalla fessura e trasferirli in una capsula di Petri da 100 mm con EM fresco (circa 40 ml), quindi incubarli a 28,5 °C per consentire agli embrioni di svilupparsi.
7. Screening degli embrioni per l'inserimento transgenico
- Per l'espressione di proteine fluorescenti, scegliere lo stadio di sviluppo appropriato in cui il transgene fluorescente deve essere espresso e selezionare la presenza di fluorescenza al microscopio da dissezione fluorescente.
NOTA: Questi embrioni saranno mosaici nella loro espressione e mostreranno un inserimento genomico del costrutto transgenico. - Screening dei transgeni non fluorescenti mediante screening per un marcatore transgenico fluorescente (come descritto nella fase 7.1), come GFP guidata dal promotore cardiaco-specifico per il gene cmlc2 o mCherry guidata dal promotore specifico del cristallino di αcyrstallin, che sono contenuti in distinti vettori di destinazione.
- Lasciare che gli embrioni positivi per l'inserimento transgenico si sviluppino completamente negli stadi adulti di zebrafish.
- Una volta che i potenziali pesci transgenici raggiungono l'età riproduttiva, selezionarli individualmente sia per la trasmissione della linea germinale che per l'espressività transgenica allevandoli al pesce zebra selvatico.
- Gli adulti i cui embrioni si sviluppano normalmente e danno l'espressione transgenica più forte e più appropriata sono tenuti come linee di zebrafish transgeniche uniche per futuri lavori e analisi.
NOTA: Come approccio alternativo allo screening per l'inserimento genomico di costrutti transgenici, progettare primer PCR che amplificano solo il costrutto transgenico e non il DNA wild-type.
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Representative Results
Per generare i costrutti transgenici, abbiamo usato il sistema di transgenesi Tol2. Tre vettori di ingresso, tra cui p5E, che contiene gli elementi promotore/potenziatore del gene, pME, che contiene il gene che deve essere espresso dagli elementi promotore/potenziatore, e p3E che, come minimo, detiene la coda polyA, sono stati utilizzati per generare il costrutto transgenico tramite clonazione LR multisite gateway. Il vettore di destinazione, pDest, fornisce le ripetizioni Tol2 per l'inserimento genomico del costrutto transgenico negli embrioni di zebrafish e contiene tutte le informazioni genetiche essenziali per la crescita batterica (Figura 1A). Ai fini di questo manoscritto, abbiamo creato e iniettato un costrutto transgenico sox17:EGFPCAAX . Il promotore del marcatore endodermico, sox17, è stato utilizzato per guidare EGFP marcato con membrana nell'endoderma in via di sviluppo del pesce zebra. Per i costrutti transgenici che esprimono proteine non fluorofore, un vettore pDest che contiene un marcatore transgenico fluorescente come cmlc2:EGFP può essere usato per aiutare nell'inserimento genomico (Figura 1A).
Utilizzando i valori descritti nel protocollo sopra (Tabella 2), è stato generato il costrutto transgenico sox17:EGFPCAAX e 4 μL di questo costrutto sono stati trasformati in cellule di Escherichia coli chimicamente competenti. Dopo l'incubazione a 37 °C durante la notte, la piastra di agar conteneva circa 250 colonie (le reazioni LR in genere hanno una media di 150-300 colonie per piastra nel nostro laboratorio). Lo screening di queste colonie è stato eseguito in base all'opacità. Nelle nostre mani, le colonie che erano chiare avevano il prodotto sox17:EGFPCAAX corretto >85% delle volte, mentre le colonie opache non contenevano mai il prodotto di ricombinazione corretto (Figura 1B, punta di freccia contro freccia). Dopo aver isolato il plasmide da diverse colonie, la digestione di restrizione dei prodotti ricombinanti è stata eseguita con l'enzima di restrizione, NcoI. Due diverse colonie chiare e una colonia opaca sono state digerite. Entrambe le colonie chiare avevano una singola banda alla dimensione corretta di 9.544 bp (plasmidi non digeriti caricati come controllo digestivo), mentre la colonia opaca non aveva alcuna banda (Figura 2A). Questi costrutti positivi sox17:EGFPCAAX sono stati ritrasformati, le colonie successive sono state nuovamente striate, quelle colonie sono state confermate avere il plasmide e sono stati generati congelatori batterici a -80 °C. Le concentrazioni sia del plasmide sox17:EGFPCAAX che dell'mRNA con tappo della trasposasi sono state determinate in modo che potessero essere entrambi utilizzati per l'iniezione (Figura 2B).
Gli embrioni sono stati preparati per l'iniezione inserendo embrioni allo stadio cellulare in uno stampo per iniezione di embrioni preriscaldati (Figura 3A-C). Una volta inserito nello stampo per iniezione, l'ago per iniezione contenente l'mRNA sox17:EGFPCAAX è stato inserito in un supporto per micropipette sul micromanipolatore (Figura 3D,E). Gli embrioni sono stati iniettati con 100 ng di mRNA trasposasi, 150 ng di plasmide sox17:EGFPCAAX e rosso fenolo (colorante tracciante per iniezione). Un bolo di 3 nL (determinato dalle dimensioni come descritto nel protocollo, fase 6.6) è stato iniettato nel corpo cellulare e non nel tuorlo dell'embrione per le migliori possibilità di integrazione (Figura 3F)10.
Dopo l'iniezione, gli embrioni sono stati rimossi dallo stampo di iniezione e lasciati sviluppare per 24 ore. A 24 ore dopo la fecondazione (hpf), gli embrioni sono stati sottoposti a screening per l'espressione endodermica di EGFPCAAX. L'espressione dell'endoderma a mosaico EGFPCAAX è stata osservata in ~ 75% degli embrioni iniettati (Figura 4A, A'). Per lo screening degli embrioni iniettati con transgeni non fluorescenti come Gal4 o CreERT2, può essere utilizzato un vettore di destinazione che contiene anche un marcatore transgenico (cioè cmlc2:EGFP) (Figura 1A) (Figura 4B,B'). Il pesce zebra adulto che ha avuto la transgenesi germinale di sox17:EGFPCAAX ha generato embrioni fluorescenti con l'endoderma completamente etichettato con EGFPCAAX (Figura 4C).
Utilizzando la nuova linea transgenica sox17:EGFPCAAX, siamo stati in grado di valutare direttamente l'impatto dell'etanolo sulla formazione delle buste endodermiche. Le sacche sono sporgenze che si formano sul bordo laterale dell'endoderma e sono importanti per la formazione dello scheletro facciale e dei sistemi di organi multipli17. Abbiamo precedentemente dimostrato che il blocco della segnalazione della proteina morfogenetica ossea (Bmp) provoca ipoplasia delle sacche18. Ora mostriamo che il trattamento con etanolo di mutanti Bmp da 10-18 hpf ha un impatto sottile ma significativo sulle dimensioni del sacchetto. La lunghezza dorsale-ventrale di ciascuna sacca dalle sacche 1-5 (il pesce zebra ha sei sacche, ma la sesta doveva ancora formarsi completamente nella fase di sviluppo ripresa) è stata misurata in embrioni mutanti Bmp di tipo selvaggio trattati con etanolo (Figura 5A). Come controllo per gli impatti generali sulla crescita dovuti all'esposizione all'etanolo, è stata misurata la lunghezza antero-posteriore dell'intero endoderma (Figura 5A). La lunghezza complessiva dell'endoderma non è stata influenzata dal genotipo o dal trattamento (Figura 5B). Tuttavia, le sacche 1 e 3 hanno mostrato aumenti significativi della lunghezza della sacca tra gli embrioni wild-type non trattati e trattati con etanolo, ma diminuzioni significative della lunghezza tra i mutanti Bmp non trattati e trattati con etanolo (Figura 5C; ANOVA a due vie; sacchetto 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; sacchetto 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 ha mostrato aumenti significativi delle dimensioni della busta tra i gruppi wild-type e mutanti Bmp non trattati e trattati con etanolo (Figura 5C; ANOVA a due vie; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figura 1: Reazione del gateway LR per la costruzione del transgene. (A) Schema della reazione modulare di clonazione del gateway LR in quattro parti. LR Clonase ricombina i tre vettori di ingresso, p5E, pME e p3E, e il vettore di destinazione, pDest, in una reazione altamente specifica per generare un nuovo prodotto transgenico pronto per l'iniezione embrionale. Per lo screening di transgeni non fluorescenti, i vettori pDest possono contenere marcatori transgenici opzionali (cmlc2:EGFP, come esempio). (B) Esempio di colonie batteriche ottenute dalla trasformazione dei prodotti di ricombinazione LR. Le colonie chiare contenevano un prodotto di ricombinazione LR corretto >85% delle volte (punta di freccia), mentre le colonie opache non contenevano mai un prodotto di ricombinazione corretto (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi del DNA plasmidico e dell'mRNA trasposasi . (A) Digestione diagnostica delle tre colonie dalla trasformazione dei prodotti di ricombinazione LR. La singola colonia opaca non conteneva alcun plasmide da schermare, mentre le due colonie chiare contenevano una singola banda a 9.544 bp (non tagliata vs. tagliata). (B) MRNA trasposasi a 1.950 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Configurazione dell'iniezione di embrioni di zebrafish. (A) Uno stampo per iniezione viene posto in agarosio liquido diluito in EM (3% v/v). (B) Una volta solidificato, lo stampo viene rimosso dalla piastra di agarosio. (C) Gli embrioni sono disposti negli stampi ad iniezione. (D,E) La miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo viene pipettata nell'ago per iniezione, che viene inserito nel supporto della micropipetta nel micromanipolatore. (F) Un bolo di 3 nL viene iniettato nel corpo cellulare dell'embrione allo stadio unicellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Screening del pesce zebra iniettato con il costrutto transgenico. (A,A') L'immagine confocale di un embrione ripreso a 24 hpf mostra l'espressione a mosaico del transgene sox17:EGFPCAAX. (B,B») Espressione del marcatore transgenico di cmlc2:EGFP nel cuore in via di sviluppo a 24 hpf. Vista laterale degli embrioni, con anteriore a sinistra e dorsale nella parte superiore. (C) Immagine confocale di un embrione generato da un pesce zebra adulto portatore di transgene. L'intero endoderma esprime EGFPCAAX. Vista laterale dell'embrione, con anteriore a sinistra e ventrale nella parte superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Misure della sacca in embrioni wild-type e mutanti Bmp trattati con etanolo. (A) Schema che mostra la misurazione della lunghezza totale dell'endoderma e della lunghezza delle buste. (B) Le misurazioni della lunghezza complessiva dell'endoderma antero-posteriore non mostrano alcuna differenza tra embrioni wild-type e Bmp mutanti non trattati e trattati con etanolo. (C) Le misurazioni della lunghezza della sacca dorsale-ventrale indicano che le sacche 1 e 3 mostrano un aumento della lunghezza della sacca tra gli embrioni wild-type non trattati con etanolo e quelli trattati con etanolo, ma diminuisce di lunghezza tra i mutanti Bmp non trattati e trattati con etanolo (ANOVA a due vie; sacchetto 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; sacchetto 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). Pouch 2 mostra un aumento della lunghezza tra i gruppi wild-type e mutanti Bmp non trattati e trattati con etanolo (ANOVA a due vie; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Non sono state osservate differenze nella lunghezza della busta tra le buste 4 e 5. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Componenti Tol2Kit ospitati nel Lovely Lab. Ogni vettore di ingresso e destinazione disponibile nel Lovely Lab, le loro descrizioni e il loro laboratorio di origine. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Calcolo della quantità e della concertazione di ciascun vettore nella reazione di ricombinazione LR. La quantità di ciascun vettore è stata calcolata dalla dimensione (in bp) e dal fmol necessari per ciascun componente: 10 fmol di ciascun vettore di ingresso e 20 fmol del vettore di destinazione. Dalla concentrazione del plasmide, ogni vettore viene diluito in acqua sterile per aggiungere 1 μL o meno alla reazione LR. L'acqua sterile viene aggiunta al pool vettoriale per eguagliare 4 μL, 1 μL di miscela di reazione LR viene aggiunto alla reazione e viene incubato a 25 ° C durante la notte. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
I pesci zebra sono ideali per studiare l'impatto dell'esposizione all'etanolo sullo sviluppo e sugli stati patologici 7,8. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni traslucidi, fecondati esternamente e geneticamente trattabili, che consentono l'imaging dal vivo di diversi tessuti e tipi di cellule marcati con transgene contemporaneamente in più contesti ambientali19,20. Questi punti di forza, combinati con la forte conservazione genetica dello sviluppo con gli esseri umani, rendono il pesce zebra un potente sistema modello per l'imaging dell'impatto dell'etanolo 7,8. Qui, abbiamo descritto il protocollo per un approccio modulare per generare e iniettare costrutti transgenici e stabilire linee di zebrafish transgenici per futuri studi sull'etanolo.
Sono stati stabiliti molti approcci diversi per generare pesci zebra transgenici. Tuttavia, generare sia costrutti transgenici che linee transgeniche può essere scoraggiante. Mentre le tradizionali tecniche di sub-clonazione, la clonazione BAC o gli approcci basati sulla PCR come l'assemblaggio Gibson consentono di generare costrutti transgenici, hanno un basso throughput e mancano di versatilità nella loro costruzione10. Inoltre, queste strategie devono essere ridisegnate per ogni costrutto transgenico creato. La sub-clonazione richiede digestioni e legature multiple, supponendo che tutti i siti di restrizione necessari siano presenti e unici. La clonazione BAC richiede il sequenziamento e il test di più cloni BAC. Per l'assemblaggio Gibson, i nuovi primer PCR devono essere progettati per ogni costrutto transgenico. Inoltre, l'iniezione di DNA non tagliato o linearizzato porta a una bassa trasmissione germinale21,22,23.
Il Tol2Kit è un sistema modulare che utilizza il clonaggio gateway per generare costrutti transgenici completi affiancati da ripetizioni Tol2 che, se combinate con mRNA trasposasi, aumentano notevolmente la transgenesi e la trasmissione germinale 10,11,24,25. Decine di vettori di ingresso e destinazione sono disponibili dal laboratorio Kwan e dal Cole Lab10,11. Inoltre, i laboratori zebrafish che utilizzano il Tol2Kit hanno generato e curato molti più vettori di ingresso e destinazione. Come esempio dell'ampiezza dei vettori disponibili, abbiamo raggruppato e utilizzato oltre 70 vettori (Tabella 1). Con tutte queste risorse comunitarie, è possibile generare rapidamente migliaia di diversi costrutti transgenici semplicemente combinando i vettori di scelta in una reazione LR.
Le reazioni LR ottimali richiedono calcoli esatti delle dimensioni e della concentrazione del plasmide. I calcoli per ciascun vettore sono fatti in valori femtomole (fmol), quindi ogni reazione non richiede un alto volume plasmidico per generare un costrutto transgenico. Tuttavia, questa piccola quantità di plasmide rende le diluizioni e il pipettaggio corretto estremamente critici per il successo della reazione10. Ulteriori fattori che possono influenzare la reazione LR sono la dimensione degli inserti nei diversi vettori di ingresso. Ad esempio, l'elemento p5E-sox17 utilizzato in questo studio è superiore a 4 kb, che, se combinato con elementi pME e p3E altrettanto grandi, si tradurrà in un vettore transgenico molto grande. Un grande plasmide nei batteri può essere difficile da coltivare, diminuendo così il numero di colonie generate dalla trasformazione batterica. Ciò si tradurrà anche in una crescita più lenta e in una diminuzione dei livelli di plasmide quando isolato10. È importante sottolineare che avere cellule batteriche altamente competenti, oltre ad aumentare l'incubazione delle cellule batteriche durante la trasformazione del plasmide di ricombinazione, sono fondamentali per generare abbastanza colonie per catturare la corretta formazione del transgene. Inoltre, l'utilizzo dell'enzima di reazione LR corretto (elencato nella tabella dei materiali) svolge anche un ruolo importante nel successo della reazione LR.
Oltre alla generazione di un costrutto transgenico e alle trasformazioni batteriche, anche l'iniezione di embrioni e l'integrazione del genoma possono essere difficili. La generazione di mRNA trasposasi di alta qualità aumenta notevolmente la frequenza di integrazione genomica10. I capillari tirati devono essere fatti poco prima di iniettare gli embrioni poiché gli aghi più vecchi possono perdere l'azione capillare (cioè, il fluido di iniezione non riesce a muoversi verso la punta dell'ago) (Figura 3E). Sia la rottura della punta dell'ago per iniettare solo ~ 3 nL di fluido e l'iniezione del corpo cellulare richiedono pratica. Il nostro protocollo di allenamento prevede l'iniezione del corpo cellulare con solo colorante per iniezione rosso fenolo fino a quando non si rompe l'ago e si iniettano gli embrioni. L'iniezione del corpo cellulare aumenta drasticamente il tasso di integrazione del genoma10. Combinando tutto questo, abbiamo una media del 75% o superiore di inserimento del genoma e dell'espressione del mosaico, ma questo può variare da costrutto a costrutto.
Poiché l'inserimento genomico può essere casuale, ogni embrione che mostra l'espressione del mosaico è un inserimento transgenico unico e richiede uno screening continuo. Questo screening continuo è necessario per dimostrare che il sito di integrazione non è dannoso per lo sviluppo dell'embrione, che si verifica la trasmissione germinale e che l'espressione del transgene non è attenuata o potenzialmente silenziata. Una volta stabilita una linea transgenica, può essere facilmente utilizzata per analisi multiple negli studi sull'etanolo. Per questi costrutti transgenici non fluorescenti, i marcatori transgenici comunemente usati includono cmlc2:GFP e αcrystallin:RFP, che marcano rispettivamente il cuore e la retina e consentono uno screening transgenico continuo. Oltre ai marcatori transgenici per lo screening, questi due transgeni possono essere utilizzati per studiare direttamente l'impatto dell'etanolo sullo sviluppo del cuore e della retina.
Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo generato una linea di zebrafish transgenico sox17:EGFPCAAX che aveva una trasmissione germinale stabile di un costrutto EGFP marcato con membrana endodermica-specifica. Utilizzando questa linea, siamo stati in grado di misurare l'impatto dell'etanolo sulla formazione di sacche endodermiche in embrioni mutanti Bmp sensibili all'etanolo. Abbiamo dimostrato che le dimensioni delle buste 1-3 ma non delle buste 4 e 5 né la lunghezza complessiva dell'endoderma sono state influenzate nei mutanti Bmp trattati con etanolo (Fig. 5). Questo lavoro pilota suggerisce che l'interazione Bmp-etanolo interrompe la formazione dell'endoderma, in particolare i comportamenti cellulari alla base della formazione della sacca. Questo lavoro esemplifica l'utilità di generare linee di zebrafish transgeniche per gli studi sull'etanolo. Di conseguenza, la creazione di nuove linee transgeniche aumenterà notevolmente la nostra comprensione dei processi cellulari sensibili all'etanolo e degli eventi tissutali nella FASD.
In definitiva, il pesce zebra transgenico, e il pesce zebra in generale, hanno dimostrato di essere incredibilmente potenti nello studio di FASD 7,8. Il Tol2Kit è un toolkit estremamente versatile che consente ai ricercatori di generare rapidamente più costrutti transgenici pronti per essere iniettati nel pesce zebra. Il design modulare e la facilità di generare nuovi vettori di ingresso si traducono in un'estrema flessibilità nella generazione di costrutti transgenici senza dover riprogettare alcun componente. Nel complesso, questo toolkit migliorerà notevolmente sia la ricerca sul pesce zebra che la ricerca in generale volta a migliorare la comprensione della FASD.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da una sovvenzione del National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 a CBL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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