Summary
Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.
Abstract
Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.
Introduction
L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.
Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.
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Protocol
Tous les embryons de poisson zèbre utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés conformément aux protocoles IACUCétablis 12. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université de Louisville.
NOTE: La souche de poisson-zèbre de type sauvage, AB, et la lignée double mutante bmp4st72;smad5b1100 ont été utilisées dans cette étude. Toute l’eau utilisée dans cette procédure était de l’eau stérile par osmose inverse. Les images confocales ont été prises au microscope confocale à balayage laser. Les mesures de l’endoderme ont été effectuées à l’aide de l’outil de mesure d’ImageJ. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un logiciel statistique.
1. Faire les solutions et les médias
- Milieu bactérien: Dissoudre le bouillon LB ou la gélose selon les instructions du fabricant et l’autoclave. Avant de verser le média dans des boîtes de Petri de 100 mm, ajouter de l’ampicilline (50 μg/mL), de la kanamycine (50 μg/mL) ou une combinaison ampicilline/chloramphénicol (50 μg/mL et 30 μg/mL, respectivement).
- Pour obtenir 20x le milieu embryonnaire, dissoudre les éléments suivants dans 1 L d’eau : 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO 4, 0,142 g de Na2HPO 4 et4,9 g de MgSO4·7H2O. Filtrer-stériliserla solution mère à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 μm, et conserver à 4 °C.
REMARQUE: Ignorez le précipité blanc qui se forme; Cela n’aura pas d’impact sur les médias. - Dans 19 L d’eau, dissoudre 1,2 g de NaHCO3 et ajouter 1 L du milieu embryonnaire 20x pour générer la solution de milieu embryonnaire fonctionnel, et maintenir cette solution à 28 °C.
- Pour une solution de rouge de phénol à 2 %, dissoudre 20 mg de sel de sodium rouge de phénol dans 1 mL d’eau exempte de RNase et conserver à température ambiante.
2. Moules d’injection d’embryons
- Pour fabriquer la plaque d’injection d’agarose, dissoudre l’agarose dans le milieu embryonnaire jusqu’à une concentration finale de 3% en chauffant à ébullition.
- Versez 50 ml d’agarose dans des boîtes de Petri de 100 mm et, pendant que l’agarose est encore liquide, placez doucement le moule d’injection dans l’agarose pour éviter la formation de bulles sous le moule.
- Laissez refroidir les plaques d’agarose. Une fois que l’agarose est solide, retirez le moule d’injection et conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
3. Pipettes d’injection
- Tirer des capillaires de 1,0 mm (OD) contenant un filament dans des aiguilles à l’aide d’un extracteur de pipette vertical avec le solénoïde réglé sur 2,5 et l’élément chauffant réglé sur 14,6.
REMARQUE: Tout extracteur chauffé fonctionnera s’il tire les capillaires en deux aiguilles proprement et uniformément, mais les aiguilles d’injection doivent être tirées dans la semaine 1 suivant l’injection des embryons de poisson zèbre pour des résultats d’injection cohérents.- Placez le capillaire dans l’extracteur, serrez la pince à chaque extrémité, puis activez l’élément chauffant.
- Tirez les capillaires pour créer deux aiguilles d’injection.
- Retirez les capillaires de l’extracteur et rangez-les dans une boîte de Petri vide avec une bande de pâte à modeler qui sert de porte-aiguille.
4. Préparation de l’ARNm de la transposase
- Linéariser le plasmide Tol2Kit contenant la transposase avec une endonucléase de restriction NotI en combinant les éléments suivants dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de plasmide de transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction, 0,3 μL d’endonucléase NotI.
- Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et digérer à 37 °C pendant la nuit.
- Arrêtez la digestion par transposition en ajoutant 1 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH4OAc et 80 μL d’EtOH à 100% à la réaction de digestion, puis mélangez et refroidissez à -20 °C pendant la nuit.
- Centrifuger la solution à 14 000x g pendant 20 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau sans RNase.
- Déterminer la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre en faisant d’abord couler 2 μL d’un blanc d’eau sans RNase, puis 2 μL du plasmide linéarisé.
REMARQUE: Les concentrations plasmidiques varient généralement entre 100 et 200 ng / μL - Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant les composants suivants dans l’ordre dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampon de réaction 10x, 0,1-1 μg de matrice d’ADN linéaire et 2 μL de mélange d’enzymes SP6.
- Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et incuber à 37 °C pendant 2 h.
- Après 2 h d’incubation, ajouter 1 μL de DNase, bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 37 °C.
- Pour arrêter la réaction SP6, ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl dans le tube de réaction, puis mélanger et refroidir à -20 °C pendant la nuit.
- Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour enduire l’ARNm, puis aspirer le surnageant et laver la pastille d’ARNm avec 1 mL d’EtOH à 80% (dilué avec de l’eau sans RNase).
- Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler l’ARNm, puis aspirer le surnageant. Laissez le granulé sécher à l’air.
- Resuspendre la pastille d’ARNm dans 20 μL d’eau exempte de RNase, déterminer la concentration d’ARNm en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre comme décrit à l’étape 4.5 (doit être d’au moins 100 ng/μL), aliquote 100 ng d’ARNm par tube à usage unique, et conserver à −80 °C.
REMARQUE: Pour s’assurer que l’ARNm n’est pas dégradé, 2 μL d’ARNm peuvent être rapidement exécutés sur un gel d’électrophorèse d’ADN pour confirmer une seule bande à 1 950 bps.
5. Clonage de passerelle multisite pour créer des vecteurs d’entrée pour la transgénèse
REMARQUE : Ce protocole est modifié à partir de Kwan et coll.10, la réaction LR étant écrite comme une réaction demi-LR et avec un volume total de 5 μL. Pour générer de nouveaux éléments d’entrée, les réactions BP utilisant des vecteurs donneurs 5', milieu et 3' doivent être utilisées10,13.
- Pour effectuer la réaction, recueillir 10 fmol de p5E, pME et p3E et 20 fmol du vecteur de destination (pDest).
REMARQUE: La recombinaison LR multisite utilise quatre vecteurs plasmidiques différents: un vecteur d’entrée 5' (p5E), un vecteur d’entrée intermédiaire (pME), un vecteur d’entrée 3' (p3E) et un vecteur de destination (pDest), pour générer une construction transgénique unique flanquée de répétitions Tol2 prêtes à être injectées dans des embryons de poisson zèbre.- Identifiez la taille des quatre vecteurs dans les paires de bases à partir de la source plasmidique (Tableau 1, Tol2Kit Wiki page14 ou Addgene11; voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE: Pour les nouveaux vecteurs, le séquençage plasmidique complet via des sociétés de séquençage commerciales peut fournir la taille exacte du plasmide en bps. - Déterminer la concentration des quatre vecteurs en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre, comme décrit à l’étape 4.5.
- En utilisant le poids de l’ADN comme 660 g / mol et la taille du plasmide (en bps), calculer le total des nanogrammes (ng) de plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination).
REMARQUE: Le laboratoire Mosimann de l’Université du Colorado, Anschutz Medical Campus, a généré une feuille de calcul disponible gratuitement pour calculer la quantité de plasmide nécessaire (en ng) et le volume (en μL) des vecteurs nécessaires dans la réaction LR15.
- Identifiez la taille des quatre vecteurs dans les paires de bases à partir de la source plasmidique (Tableau 1, Tol2Kit Wiki page14 ou Addgene11; voir le Tableau des matériaux).
- Pour générer la construction décrite ci-dessous, sox17: EGFPCAAX, utilisez les vecteurs suivants : un vecteur p5E contenant le promoteur sox17 du poisson zèbre, dontla taille est de 6 918 pb ; un vecteur pME contenant l’EGFP prénylé, d’une taille10 de 3 345 pb; un vecteur p3E contenant la séquence de signaux poly A tardifs SV40, d’une taille10 de 2 838 pb; et le pDest, qui est de 5 883 pb en taille10.
- À l’aide de la concentration plasmidique déterminée à l’étape 5.1.2 et de la quantité en nanogrammes (ng) pour chaque vecteur (étape 5.1.3), calculer les microlitres totaux (μL) de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination), puis diviser cela par deux pour une utilisation dans les réactions demi-LR de 5 μL (toutes les valeurs énumérées ci-dessous sont énumérées dans le tableau 2).
- Pour générer 10 fmol de p5E-sox17, utilisez 45,66 ng (à une concentration de 140,3 ng/μL) et diluez avec de l’eau stérile d’un facteur 4 pour obtenir 0,65 μL.
- Pour générer 10 fmols de pME-EGFPCAAX, utiliser 22,08 ng (à une concentration de 213,5 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 10 pour obtenir 0,52 μL.
- Pour générer 10 fmol de p3E-poly A, utiliser 15,73 ng (à une concentration de 276,1 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 20 pour obtenir 0,57 μL.
- Pour 20 fmol du vecteur de destination, utiliser 77,66 ng de pDest (à une concentration de 307,3 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 5 pour obtenir 1,63 μL.
- Pour mettre en place une réaction demi-LR de 5 μL, combinez les volumes de p5E, pME, p3E et pDest déterminés à l’étape 5.3 dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL, puis ajoutez de l’eau stérile pour atteindre un volume de réaction total de 4 μL.
- Tourbillonner vigoureusement le mélange d’enzymes LR 2x pendant 1 min chacun pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 1 μL à la réaction et bien mélanger.
- Incuber à 25 °C pendant la nuit (16+ h).
- Arrêter la réaction LR en ajoutant 0,5 μL de protéinase K (2 μg/μL), incuber à 37 °C pendant 10 min, puis refroidir à température ambiante.
- Transformez 3-4 μL de plasmide en cellules décongelées et chimiquement compétentes en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur la glace pendant 25-30 min.
- Pendant que les cellules reposent sur de la glace, réchauffer deux plaques de gélose LB-ampicilline à température ambiante.
- Choc thermique des cellules dans un bain-marie à 42°C pendant 30 s précises.
- Après le choc thermique, ajouter 250 μL de milieux liquides riches et sans antibiotiques aux cellules, et incuber en agitant à 37 °C pendant 1,5 h.
- Étaler 300 μL de bactéries sur une plaque d’ampicilline et incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Le lendemain matin, examiner les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes, clair et opaque, choisir les colonies claires (comme décrit dans Kwan et al.10) une à la fois, inoculer la culture liquide, puis agiter à 37 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Les colonies claires contiennent presque toujours la bonne colonie LR (>85% du temps). - À l’aide d’une trousse commerciale conforme aux instructions du fabricant, effectuer une préparation plasmidique sur chaque culture liquide et digérer diagnostiquement chaque plasmide pour confirmer la taille appropriée de la construction transgénique, ce qui indique que la réaction de la passerelle LR a fonctionné correctement.
- Retransformez les constructions transgéniques correctes en utilisant le protocole de transformation bactérienne standard décrit aux étapes 5.4-5.12 en utilisant 0,5-1 μL du plasmide, et incuber seulement à 37 °C pendant 1 h.
- Resemer les colonies et confirmer que chacune a la construction transgénique LR comme à l’étape 5.14.
- Déterminer la concentration plasmidique comme décrit à l’étape 4.5 (au moins 150 ng/μL est nécessaire pour l’injection d’embryons).
6. Injection du transgène dans les embryons
- Décongeler un échantillon d’ARNm transposase à usage unique et une construction transgénique Tol2 sur de la glace et avertir une plaque d’injection d’agarose à température ambiante.
- Combinez les éléments suivants sur la glace : 150 ng de plasmide, 100 ng d’ARNm de transposase et 2 % de rouge de phénol (0,3 μL). Ensuite, ajoutez de l’eau sans ARN pour compléter le volume à 3 μL.
- Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert sur la plaque d’injection (décrite à l’étape 2) remplie de ME recouvrant complètement l’agar-agar, puis presser doucement environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection.
- Ajouter le mélange ARNm/plasmide/rouge phénol à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire, placer l’aiguille capillaire dans l’armature de la plate-forme d’injection et allumer la plate-forme d’injection.
REMARQUE:La plate-forme d’injection utilise du gaz comprimé, tel que de l’air, pour pulser le volume souhaité (décrit à l’étape 6.5) du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans l’embryon lorsqu’il est activé. - Abaissez l’aiguille capillaire dans l’EM de la plaque d’injection et brisez l’embout à l’aide d’une pince pour permettre à seulement une petite quantité de mélange ARNm/plasmide/rouge phénol d’être pompée par la plate-forme d’injection.
- Injecter les embryons avec un petit bolus de 3 nL du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans le corps cellulaire de l’embryon.
REMARQUE: Un bolus de 3 nL est un volume de mélange d’ARNm / plasmide / rouge phénol auquel sept bolus peuvent théoriquement s’adapter également à travers la ligne médiane de l’embryon. - Lorsque l’injection des embryons est terminée, retirez-les de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et en les transférant-pipetage dans une boîte de Petri de 100 mm avec EM frais (environ 40 ml), puis incuber à 28,5 °C pour permettre aux embryons de se développer.
7. Dépistage des embryons en vue de leur insertion transgénique
- Pour l’expression des protéines fluorescentes, choisir le stade de développement approprié où le transgène fluorescent doit être exprimé et rechercher la présence de fluorescence au microscope à dissection fluorescente.
NOTE: Ces embryons seront en mosaïque dans leur expression et montreront une insertion génomique de la construction transgénique. - Dépister les transgènes non fluorescents par criblage d’un marqueur transgénique fluorescent (tel que décrit à l’étape 7.1), tel que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène cmlc2 ou mCherry piloté par le promoteur spécifique du cristallin de l’αcyrstalline, qui sont contenus dans des vecteurs de destination distincts.
- Permettre aux embryons positifs pour l’insertion transgénique de se développer pleinement jusqu’aux stades de poisson-zèbre adulte.
- Une fois que les poissons transgéniques potentiels atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant à des poissons-zèbres de type sauvage.
- Les adultes dont les embryons se développent normalement et donnent l’expression transgénique la plus forte et la plus appropriée sont conservés comme des lignées uniques de poissons-zèbres transgéniques pour les travaux et analyses futurs.
REMARQUE : Comme approche alternative au dépistage de l’insertion génomique de constructions transgéniques, concevoir des amorces de PCR qui amplifient uniquement la construction transgénique et non l’ADN de type sauvage.
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Representative Results
Pour générer les constructions transgéniques, nous avons utilisé le système de transgénèse Tol2. Trois vecteurs d’entrée, dont p5E, qui contient les éléments promoteur/amplificateur de gène, pME, qui contient le gène à exprimer par les éléments promoteurs/amplificateurs, et p3E qui, au minimum, détient la queue polyA, ont été utilisés pour générer la construction transgénique via le clonage LR de passerelle multisite. Le vecteur de destination, pDest, fournit les répétitions Tol2 pour l’insertion génomique de la construction transgénique dans les embryons de poisson zèbre et contient toute l’information génétique essentielle à la croissance bactérienne (Figure 1A). Pour les besoins de ce manuscrit, nous avons créé et injecté une construction transgénique sox17:EGFPCAAX . Le promoteur du marqueur de l’endoderme, sox17, a été utilisé pour piloter l’EGFP marqué à la membrane dans l’endoderme en développement du poisson zèbre. Pour les constructions transgéniques qui expriment des protéines non fluorophores, un vecteur pDest contenant un marqueur transgénique fluorescent tel que cmlc2:EGFP peut être utilisé pour faciliter l’insertion génomique (Figure 1A).
En utilisant les valeurs décrites dans le protocole ci-dessus (tableau 2), la construction transgénique sox17:EGFPCAAX a été générée, et 4 μL de cette construction ont été transformés en cellules d’Escherichia coli chimiquement compétentes. Après incubation à 37 °C pendant une nuit, la plaque de gélose contenait environ 250 colonies (les réactions LR sont généralement en moyenne de 150 à 300 colonies par plaque dans notre laboratoire). Le criblage de ces colonies a été effectué sur la base de l’opacité. Entre nos mains, les colonies qui étaient claires avaient le bon produit sox17:EGFPCAAX >85% du temps, alors que les colonies opaques ne contenaient jamais le bon produit de recombinaison (Figure 1B, pointe de flèche vs flèche). Après avoir isolé le plasmide de plusieurs colonies, la digestion de restriction des produits recombinants a été réalisée avec l’enzyme de restriction, NcoI. Deux colonies claires différentes et une colonie opaque ont été digérées. Les deux colonies claires avaient une seule bande à la taille correcte de 9 544 pb (plasmides non digérés chargés comme témoin de digestion), tandis que la colonie opaque n’avait aucune bande (figure 2A). Ces constructions positives sox17:EGFPCAAX ont été retransformées, les colonies suivantes ont été striées à nouveau, ces colonies ont été confirmées comme ayant le plasmide et des stocks de congélateurs bactériens de -80 °C ont été générés. Les concentrations du plasmide sox17:EGFPCAAX et de l’ARNm de la transposase coiffée ont été déterminées afin qu’ils puissent tous deux être utilisés pour l’injection (figure 2B).
Les embryons ont été préparés pour l’injection en plaçant un embryon au stade cellulaire dans un moule d’injection d’embryons préchauffé (figure 3A-C). Une fois placée dans le moule d’injection, l’aiguille d’injection contenant l’ARNm sox17:EGFPCAAX a été placée dans un porte-micropipette sur le micromanipulateur (Figure 3D,E). Les embryons ont été injectés avec 100 ng d’ARNm transposase, 150 ng de plasmide sox17:EGFPCAAX et du rouge de phénol (colorant de suivi des injections). Un bolus de 3 nL (déterminé par la taille décrite dans le protocole, étape 6.6) a été injecté dans le corps cellulaire et non dans le jaune de l’embryon pour avoir les meilleures chances d’intégration (Figure 3F)10.
Après l’injection, les embryons ont été retirés du moule d’injection et laissés se développer pendant 24 heures. 24 heures après la fécondation (HPF), les embryons ont été examinés pour l’expression endodermique d’EGFPCAAX. L’expression de l’endoderme en mosaïque EGFPCAAX a été observée chez ~75% des embryons injectés (Figure 4A,A'). Pour dépister les embryons injectés avec des transgènes non fluorescents tels que Gal4 ou CreERT2, un vecteur de destination contenant également un marqueur transgénique (c.-à-d. cmlc2:EGFP) (Figure 1A) peut être utilisé (Figure 4B,B'). Le poisson zèbre adulte ayant eu une transgénèse germinale de sox17:EGFPCAAX a généré des embryons fluorescents avec l’endoderme entièrement marqué avec EGFPCAAX (Figure 4C).
En utilisant la nouvelle lignée transgénique sox17:EGFPCAAX, nous avons pu évaluer directement l’impact de l’éthanol sur la formation des poches endodermiques. Les poches sont des protubérances qui se forment sur le bord latéral de l’endoderme et sont importantes pour la formation du squelette facial et de multiples systèmes organiques17. Nous avons précédemment montré que le blocage de la signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp) entraîne une hypoplasie des poches18. Nous montrons maintenant que le traitement à l’éthanol des mutants Bmp de 10 à 18 hpf a un impact subtil mais significatif sur la taille de la poche. La longueur dorso-ventrale de chaque poche des poches 1 à 5 (le poisson zèbre a six poches, mais la sixième n’avait pas encore complètement formé au stade de développement de l’image) a été mesurée chez des embryons mutants Bmp de type sauvage traités à l’éthanol (Figure 5A). Pour contrôler les effets généraux sur la croissance dus à l’exposition à l’éthanol, la longueur antéro-postérieure de l’endoderme entier a été mesurée (figure 5A). La longueur totale de l’endoderme n’a pas été affectée par le génotype ou le traitement (figure 5B). Cependant, les poches 1 et 3 ont montré des augmentations significatives de la longueur de la poche entre les embryons de type sauvage non traités et traités à l’éthanol, mais des diminutions significatives de la longueur entre les mutants Bmp non traités et traités à l’éthanol (Figure 5C; ANOVA bidirectionnelle; poche 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; poche 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). La poche 2 a montré des augmentations significatives de la taille de la poche entre les groupes de type sauvage non traité et traité à l’éthanol et les groupes mutants Bmp, respectivement (figure 5C; ANOVA bidirectionnelle; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figure 1 : Réaction de la passerelle LR pour la construction du transgène. (A) Schéma de la réaction modulaire de clonage de passerelle LR en quatre parties. LR Clonase recombine les trois vecteurs d’entrée, p5E, pME et p3E, et le vecteur de destination, pDest, dans une réaction très spécifique pour générer un nouveau produit transgénique prêt pour l’injection embryonnaire. Pour le criblage de transgènes non fluorescents, les vecteurs pDest peuvent contenir des marqueurs transgéniques optionnels (cmlc2:EGFP, par exemple). (B) Exemple de colonies bactériennes obtenues par la transformation des produits de recombinaison LR. Les colonies claires contenaient un produit de recombinaison LR correct >85% du temps (pointe de flèche), tandis que les colonies opaques ne contenaient jamais de produit de recombinaison correct (flèche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse de l’ADN plasmidique et de l’ARNm de la transposase. (A) Digestion diagnostique des trois colonies à partir de la transformation des produits de recombinaison LR. La seule colonie opaque ne contenait aucun plasmide à cribler, tandis que les deux colonies transparentes contenaient une seule bande à 9 544 pb (non coupée ou coupée). (B) ARNm de transposition à 1 950 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Configuration de l’injection d’embryons de poisson zèbre. (A) Un moule d’injection est placé dans de l’agarose liquide diluée dans EM (3% v/v). (B) Une fois solidifié, le moule est retiré de la plaque d’agarose. (C) Les embryons sont disposés dans les moules d’injection. (D, E) Le mélange ARNm/plasmide/rouge phénol est pipeté dans l’aiguille d’injection, qui est placée dans le porte-micropipette du micromanipulateur. (F) Un bolus de 3 nL est injecté dans le corps cellulaire de l’embryon au stade unicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Criblage du poisson-zèbre injecté avec la construction transgénique. (A,A') L’image confocale d’un embryon imagé à 24 hpf montre l’expression en mosaïque du transgène sox17:EGFPCAAX. (B,B') Expression du marqueur transgénique de cmlc2:EGFP dans le cœur en développement à 24 hpf. Vues latérales des embryons, avec l’avant à gauche et la dorsale en haut. (C) Image confocale d’un embryon issu d’un poisson-zèbre adulte porteur de transgènes. L’endoderme entier exprime EGFPCAAX. Vue latérale de l’embryon, avec l’avant à gauche et le ventral au sommet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Mesures de la poche dans les embryons de type sauvage et mutants Bmp traités à l’éthanol. (A) Schéma montrant la mesure de la longueur totale de l’endoderme et de la longueur des poches. (B) Les mesures de la longueur globale de l’endoderme antéro-postérieur ne montrent aucune différence entre les embryons de type sauvage et les embryons mutants Bmp non traités et traités à l’éthanol. (C) Les mesures de la longueur de la poche dorso-ventrale indiquent que les poches 1 et 3 montrent une augmentation de la longueur de la poche entre les embryons de type sauvage non traités et traités à l’éthanol, mais diminue en longueur entre les mutants Bmp non traités et traités à l’éthanol (ANOVA bidirectionnelle; poche 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; poche 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). La poche 2 montre une augmentation de la longueur entre les groupes de type sauvage et de mutants Bmp non traités et traités à l’éthanol (ANOVA bidirectionnelle; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Aucune différence n’a été observée dans la longueur des poches entre les sachets 4 et 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Composants Tol2Kit hébergés dans le Lovely Lab. Tous les vecteurs d’entrée et de destination disponibles dans le Lovely Lab, leurs descriptions et leur laboratoire d’origine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Calcul de la quantité et de la concertation de chaque vecteur dans la réaction de recombinaison LR. La quantité de chaque vecteur a été calculée à partir de la taille (en pb) et du fmol nécessaire pour chaque composant: 10 fmol de chaque vecteur d’entrée et 20 fmol du vecteur de destination. À partir de la concentration plasmidique, chaque vecteur est dilué dans de l’eau stérile pour ajouter 1 μL ou moins à la réaction LR. De l’eau stérile est ajoutée au pool de vecteurs pour atteindre 4 μL, 1 μL de mélange réactionnel LR est ajouté à la réaction et il est incubé à 25 °C pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20. Ces forces, combinées à la forte conservation génétique développementale chez l’homme, font du poisson-zèbre un puissant système modèle pour l’imagerie de l’impact de l’éthanol 7,8. Ici, nous avons décrit le protocole pour une approche modulaire de génération et d’injection de constructions transgéniques et d’établissement de lignées de poissons-zèbres transgéniques pour de futures études sur l’éthanol.
De nombreuses approches différentes ont été établies pour générer un poisson zèbre transgénique. Cependant, générer à la fois des constructions transgéniques et des lignées transgéniques peut être décourageant. Alors que les techniques traditionnelles de sous-clonage, le clonage BAC ou les approches basées sur la PCR telles que l’assemblage Gibson permettent de générer des constructions transgéniques, elles ont un faible débit et manquent de polyvalence dans leur construction10. En outre, ces stratégies doivent être repensées pour chaque construction transgénique créée. Le sous-clonage nécessite de multiples digestions et ligatures, en supposant que tous les sites de restriction nécessaires sont présents et uniques. Le clonage BAC nécessite le séquençage et le test de plusieurs clones BAC. Pour l’assemblage Gibson, de nouveaux amorces PCR doivent être conçus pour chaque construction transgénique. De plus, l’injection d’ADN non coupé ou linéarisé entraîne une faible transmission germinale21,22,23.
Le Tol2Kit est un système modulaire qui utilise le clonage de passerelle pour générer des constructions transgéniques complètes flanquées de répétitions Tol2 qui, lorsqu’elles sont combinées à l’ARNm de la transposase, augmentent considérablement la transgénèse et la transmission germinale 10,11,24,25. Des dizaines de vecteurs d’entrée et de destination sont disponibles auprès du laboratoire Kwan et du laboratoire Cole10,11. En outre, les laboratoires de poissons zèbres qui utilisent le Tol2Kit ont généré et organisé de nombreux autres vecteurs d’entrée et de destination. À titre d’exemple de l’étendue des vecteurs disponibles, nous avons regroupé et utilisé plus de 70 vecteurs (tableau 1). Avec toutes ces ressources communautaires, on peut rapidement générer des milliers de constructions transgéniques différentes en combinant simplement les vecteurs de choix dans une réaction LR.
Les réactions LR optimales nécessitent des calculs exacts de la taille et de la concentration du plasmide. Les calculs pour chaque vecteur sont effectués en valeurs femtomole (fmol), de sorte que chaque réaction ne nécessite pas un volume plasmidique élevé pour générer une construction transgénique. Cependant, cette petite quantité de plasmide rend les dilutions et le pipetage approprié extrêmement critiques pour le succès de la réaction10. D’autres facteurs qui peuvent avoir un impact sur la réaction LR sont la taille des inserts dans les différents vecteurs d’entrée. Par exemple, l’élément p5E-sox17 utilisé dans cette étude est supérieur à 4 kb, ce qui, s’il est combiné avec des éléments pME et p3E de taille égale, donnera un très gros vecteur transgénique. Un gros plasmide dans les bactéries peut être difficile à cultiver, diminuant ainsi le nombre de colonies générées par la transformation bactérienne. Cela entraînera également une croissance plus lente et une diminution des niveaux de plasmides lorsqu’ils sont isolés10. Il est important de noter que le fait d’avoir des cellules bactériennes hautement compétentes, ainsi que d’augmenter l’incubation des cellules bactériennes pendant la transformation du plasmide de recombinaison, sont essentiels pour générer suffisamment de colonies pour capturer la formation appropriée des transgènes. En outre, l’utilisation de l’enzyme réactionnelle LR correcte (répertoriée dans le tableau des matériaux) joue également un rôle majeur dans le succès de la réaction LR.
Au-delà de la génération d’une construction transgénique et des transformations bactériennes, l’injection d’embryons et l’intégration du génome peuvent également être difficiles. La génération d’ARNm transposase de haute qualité augmente considérablement la fréquence de l’intégration génomique10. Les capillaires tirés doivent être fabriqués peu de temps avant l’injection des embryons, car les aiguilles plus anciennes peuvent perdre leur action capillaire (c.-à-d. que le liquide d’injection ne parvient pas à se déplacer jusqu’à l’extrémité de l’aiguille) (Figure 3E). Le fait de casser la pointe de l’aiguille pour n’injecter que ~3 nL de liquide et d’injecter le corps cellulaire nécessite de la pratique. Notre protocole d’entraînement consiste à injecter au corps cellulaire uniquement du colorant d’injection de rouge phénolique jusqu’à ce que l’aiguille soit maîtrisée et que l’injection des embryons soit maîtrisée. L’injection du corps cellulaire augmente considérablement le taux d’intégration du génome10. En combinant tout cela, nous avons une moyenne de 75% ou plus d’insertion du génome et d’expression en mosaïque, mais cela peut varier d’une construction à l’autre.
Étant donné que l’insertion génomique peut être aléatoire, chaque embryon qui présente une expression en mosaïque est une insertion transgénique unique et nécessite un dépistage continu. Ce dépistage continu est nécessaire pour montrer que le site d’intégration n’est pas préjudiciable au développement de l’embryon, que la transmission germinale se produit et que l’expression du transgène n’est pas atténuée ou potentiellement réduite au silence. Une fois qu’une lignée transgénique a été établie, elle peut être facilement utilisée pour de multiples analyses dans des études sur l’éthanol. Pour ces constructions transgéniques non fluorescentes, les marqueurs transgéniques couramment utilisés comprennent cmlc2:GFP et αcrystallin:RFP, qui marquent respectivement le cœur et la rétine et permettent un dépistage transgénique continu. En plus des marqueurs transgéniques pour le dépistage, ces deux transgènes peuvent être utilisés pour étudier directement l’impact de l’éthanol sur le développement du cœur et de la rétine.
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons généré une lignée de poisson-zèbre transgénique sox17:EGFPCAAX qui avait une transmission germinale stable d’une construction EGFP marquée par membrane spécifique à l’endoderme. En utilisant cette ligne, nous avons pu mesurer l’impact de l’éthanol sur la formation de poches endodermiques chez les embryons mutants Bmp sensibles à l’éthanol. Nous avons montré que les tailles des poches 1 à 3 mais pas celles des poches 4 et 5 ni la longueur globale de l’endoderme étaient impactées chez les mutants Bmp traités à l’éthanol (Fig 5). Ce travail pilote suggère que l’interaction Bmp-éthanol perturbe la formation de l’endoderme, en particulier les comportements cellulaires sous-jacents à la formation de la poche. Ce travail illustre l’utilité de générer des lignées de poisson-zèbre transgéniques pour les études sur l’éthanol. Par conséquent, la création de nouvelles lignées transgéniques améliorera considérablement notre compréhension des processus cellulaires sensibles à l’éthanol et des événements tissulaires dans l’ETCAF.
En fin de compte, le poisson zèbre transgénique, et le poisson zèbre en général, se sont révélés incroyablement puissants dans l’étude de l’ETCAF 7,8. Le Tol2Kit est une boîte à outils extrêmement polyvalente qui permet aux chercheurs de générer rapidement plusieurs constructions transgéniques prêtes à être injectées dans le poisson zèbre. La conception modulaire et la facilité de génération de nouveaux vecteurs d’entrée se traduisent par une flexibilité extrême dans la génération de constructions transgéniques sans avoir à redessiner les composants. Dans l’ensemble, cette trousse améliorera grandement la recherche sur le poisson zèbre et la recherche en général visant à améliorer la compréhension de l’ETCAF.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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