Summary
この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。
Abstract
胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって生じる構造的欠陥および認知障害の非常に多様なセットによって特徴付けられる。FASDの複雑な病理のために、動物モデルはエタノール誘発性発達障害の現在の理解にとって重要であることが証明されています。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュとヒトの間の遺伝学と発生の両方の高度な保存のために、エタノール誘発性発達障害を調べるための強力なモデルであることが証明されています。モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは、遺伝的に扱いやすく半透明の多数の外部受精胚を含む、発生研究に理想的な多くの属性を持っています。これにより、研究者は複数の遺伝的状況でエタノール曝露のタイミングと投与量を正確に制御することができます。ゼブラフィッシュで利用可能な重要な遺伝的ツールの1つは、遺伝子導入です。しかし、トランスジェニック構築物の生成とトランスジェニック株の確立は複雑で困難な場合があります。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュの研究者はトランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステムを確立しました。このモジュラーシステムは、マルチサイトGatewayクローニングアプローチを使用して、完全なTol2トランスポゾンベースのトランスジェニックコンストラクトを迅速に組み立てます。ここでは、柔軟なTol2システムツールボックスと、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスの準備ができているトランスジェニックコンストラクトを生成するためのプロトコルと、エタノール研究におけるそれらの使用について説明します。
Introduction
出生前のエタノール曝露は、胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)1,2,3,4と呼ばれる構造的欠損と認知障害の連続を引き起こします。複数の要因間の複雑な関係により、ヒトにおけるFASDの病因の研究と理解は困難になっています。この課題を解決するために、多種多様な動物モデルが使用されてきました。これらのモデルで利用可能な生物学的および実験的ツールは、エタノール催奇形性の機構的基礎の理解を深める上で重要であることが証明されており、これらのモデルシステムからの結果は、ヒトエタノール研究で見られるものと著しく一致しています5,6。これらの中で、ゼブラフィッシュはエタノール催奇形性を研究するための強力なモデルとして浮上しています7,8、部分的には、それらの外部受精、高い繁殖力、遺伝的扱いやすさ、および半透明の胚のために。これらの強みが組み合わさって、ゼブラフィッシュはトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いたFASDのリアルタイムライブイメージング研究に最適です。
トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の複数の側面を研究するために広く使用されています9。しかし、トランスジェニックコンストラクトとそれに続くトランスジェニック株を作成することは非常に困難な場合があります。標準的な導入遺伝子は、導入遺伝子を駆動するための活性プロモーター要素と、一般的なベクター維持のために安定した細菌ベクター中のポリAシグナルまたは「テール」を必要とします。多成分トランスジェニック構築物の従来の生成は、複数の時間のかかるサブクローニングステップ10を必要とする。ギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチは、サブクローニングに関連する問題のいくつかを回避できます。しかしながら、固有のプライマーは、すべての固有のトランスジェニック構築物の生成のために設計および試験されなければならない10。導入遺伝子の構築を超えて、ゲノム統合、生殖細胞系列伝達、および適切な導入遺伝子統合のスクリーニングも困難でした。ここでは、トランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステム(Tol2Kit)を使用するためのプロトコルについて説明します10,11。このモジュラーシステムは、マルチサイトゲートウェイクローニングを使用して、「エントリ」および「宛先」ベクターの増え続けるライブラリから複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成します。統合されたTol2転移因子は、導入速度を大幅に増加させ、複数の導入遺伝子の迅速な構築とゲノム統合を可能にします。このシステムを使用して、内胚葉トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成を使用して、FASDの根底にある組織特異的な構造欠陥を研究する方法を示します。最終的に、このプロトコルでは、モジュラーセットアップとトランスジェニックコンストラクトの構築がゼブラフィッシュベースのFASD研究に大いに役立つことを示します。
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Protocol
この手順で使用されたすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル12に従って飼育および飼育されました。これらのプロトコルはルイビル大学によって承認されました。
注:野生型ゼブラフィッシュ株AB、および bmp4st72;smad5b1100 二重変異株をこの研究で使用しました。この手順で使用した水はすべて滅菌逆浸透水であった。共焦点画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影した。内胚葉の測定は、ImageJの測定ツールを使用して行われました。すべての統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。
1.ソリューションとメディアの作成
- 細菌培地:製造元の指示に従ってLBブロスまたは寒天を溶解し、オートクレーブします。培地を100 mmペトリ皿に注ぐ前に、アンピシリン(50 μg / mL)、カナマイシン(50 μg / mL)、またはアンピシリン/クロラムフェニコールの組み合わせ(それぞれ50 μg / mLと30 μg / mL)を追加します。.
- 20倍の胚培地ストックを作るには、1 Lの水に次のものを溶解します:17.5 gのNaCl、0.75 gのKCl、2.9 gのCaCl 2、0.41 gのK 2 HPO 4、0.142 gのNa 2 HPO 4、および4.9 gのMgSO 4·7H 2O。 0.22 μmの真空ろ過システムを使用して原液をろ過滅菌します。 4°Cで保存します。
注意: 形成される白い沈殿物は無視してください。これはメディアに影響を与えません。 - 19 Lの水に1.2 gのNaHCO3 を溶解し、1 Lの20x胚培地ストックを加えて作業胚培地溶液を生成し、この溶液を28°Cに維持します。
- 2%フェノールレッド溶液の場合、フェノールレッドナトリウム塩20 mgをRNaseフリー水1 mLに溶解し、室温で保存します。
2.胚射出成形金型
- アガロース注入プレートを作るには、沸騰するまで加熱することにより、胚培地にアガロースを最終濃度3%まで溶解します。
- 50 mLのアガロースを100 mmのペトリ皿に注ぎ、アガロースがまだ液体である間に、射出成形金型をアガロースにそっと置き、金型の下に気泡が形成されないようにします。
- アガロースプレートを冷まします。アガロースが固まったら、射出成形金型を取り外し、使用できるようになるまで4°Cで保管します。
3. インジェクションピペット
- ソレノイドを2.5に、発熱体を14.6に設定した垂直ピペットプーラーを使用して、フィラメントを含む1.0 mm(OD)キャピラリーを針に引き込みます。
注:加熱されたプーラーは、毛細血管を2本の針にきれいに均等に引っ張れば機能しますが、一貫した注射結果を得るには、ゼブラフィッシュ胚を注入してから1週間以内に注射針を引っ張る必要があります。- キャピラリーをプーラーに配置し、クランプの両端を締めてから、発熱体をアクティブにします。
- 毛細血管を引っ張って2本の注射針を作ります。
- プラーから毛細血管を取り外し、ニードルホルダーとして機能するモデリング粘土のストリップを備えた空のペトリ皿に保管します。
4. トランスポゼmRNA調製
- トランスポザーゼを含むTol2KitプラスミドをNotI制限エンドヌクレアーゼで直線化するには、0.5 mLマイクロ遠心チューブで以下を組み合わせることで、トランスポザーゼプラスミド10 μL(150 ng/μL)、制限エンドヌクレアーゼ1.5 μL、NotIエンドヌクレアーゼ0.3 μLを組み合わせます。
- 反応液を20 μLまでRNaseフリーの水で満たし、37°Cで一晩混合して消化します。
- 消化反応に1 μLの0.5 M EDTA(pH 8.0)、2 μLの5 M NH4OAc、および80 μLの100%EtOHを加えてトランスポザーゼ消化を停止し、-20°Cで一晩混合して冷却します。
- 溶液を14,000x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を吸引してDNAペレットをRNaseフリーの水に再懸濁します。
- 蛍光光度計を使用して、最初に2 μLのRNaseフリーウォーターブランクを実行し、次に2 μLの直鎖状プラスミドを実行して、直鎖プラスミド濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。
注:プラスミド濃度は通常100〜200 ng / μLの範囲です - 0.5 mLの微量遠心チューブで次の成分を順番に組み合わせて、SP6 mRNAの生産をセットアップします:10 μLの2x NTP/CAP、2 μLの10x反応バッファー、0.1-1 μgの線状DNAテンプレート、および2 μLのSP6酵素ミックス。
- 反応液をRNaseフリーの水で最大20 μL満たし、混合して37°Cで2時間インキュベートします。
- 2時間インキュベートした後、1 μLのDNaseを加えてよく混合し、37°Cでさらに15分間インキュベートします。
- SP6反応を停止するには、30 μLのLiCl沈殿溶液を反応管に加え、混合して-20°Cで一晩冷却します。
- 溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してmRNAペレットを1 mLの80%EtOH(RNaseフリー水で希釈)で洗浄します。
- 溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引します。ペレットを風乾させます。
- mRNAペレットを20 μLのRNaseフリー水に再懸濁し、ステップ4.5に記載されている蛍光光度計を使用してmRNA濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で測定し(少なくとも100 ng/μLである必要があります)、単回使用の場合はチューブあたり100 ngのmRNAを分注し、-80°Cで保存します。
注:mRNAが分解されていないことを確認するために、2 μLのmRNAをDNA電気泳動ゲル上ですばやく実行して、1,950 bpsで単一バンドを確認することができます。
5. トランスジェネシスのエントリーベクターを作成するためのマルチサイトゲートウェイクローニング
注:このプロトコルはKwan et al.10から変更されており、LR反応はハーフLR反応として書かれており、総容量は5μLです。新しいエントリ要素を生成するには、5'、中間、および3'ドナーベクターを使用するBP反応を使用する必要があります10,13。
- 反応を行うには、p5E、pME、およびp3Eをそれぞれ10 fmol、および宛先ベクター(pDest)を20 fmol集めます。
注:マルチサイトLR組換えは、5'エントリーベクター(p5E)、ミドルエントリーベクター(pME)、3'エントリーベクター(p3E)、および宛先ベクター(pDest)の4つの異なるプラスミドベクターを使用して、ゼブラフィッシュ胚に注入できるTol2リピートに隣接するユニークなトランスジェニック構築物を生成します。- プラスミドソースから塩基対の4つのベクターすべてのサイズを特定します(表1、Tol2Kit Wikiページ14 またはAddgene11; 材料表を参照)。
注:新規ベクターの場合、市販のシーケンシング会社 を介した フルプラスミドシーケンシングにより、正確なプラスミドサイズをbpsで提供できます。 - ステップ4.5の説明に従って、蛍光光度計を使用して、4つのベクターすべての濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。
- DNAの重量を660 g/mol、プラスミドサイズ(bps単位)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)に到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラム(ng)を計算します。
注:コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのMosimann研究室は、LR反応に必要なプラスミドの量(ng単位)とベクターの量(μL単位)を計算するために、無料で入手できるスプレッドシートを生成しました15。
- プラスミドソースから塩基対の4つのベクターすべてのサイズを特定します(表1、Tol2Kit Wikiページ14 またはAddgene11; 材料表を参照)。
- 後述するコンストラクトsox17: EGFPCAAXを生成するには、以下のベクターを使用します:ゼブラフィッシュ sox17 プロモーターを含むp5Eベクター(サイズ16で6,918 bp)。プレニル化EGFPを含むpMEベクターであって、サイズ10で3,345bpであり、サイズ10で2,838 bpであるSV40後期ポリAシグナル配列を含むp3Eベクター;pDestはサイズ10で5,883 bpです。
- ステップ5.1.2で決定したプラスミド濃度と各ベクターのナノグラム(ng)単位の量(ステップ5.1.3)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)のいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットル(μL)を計算し、これを2で割って5 μLのハーフLR反応に使用します(以下の値はすべて 表2に記載されています)。
- 10 fmolのp5E-sox17を生成するには、45.66 ng(濃度140.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で4倍に希釈して0.65 μLを得ます。
- 10 fmolのpME-EGFPCAAXを生成するには、22.08 ng(濃度213.5 ng/μL)を使用し、滅菌水で10倍に希釈して0.52 μLを得ます。
- 10 fmolのp3E-ポリAを生成するには、15.73 ng(濃度276.1 ng/μL)を使用し、滅菌水で20倍に希釈して0.57 μLを得ます。
- 20 fmolの宛先ベクターに対して、77.66 ngのpDest(濃度307.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で5倍に希釈して1.63 μLを得ます。
- 5 μLのハーフLR反応をセットアップするには、ステップ5.3で決定したp5E、pME、p3E、およびpDestの容量を0.5 mLの微量遠心チューブに組み合わせ、滅菌水を加えて総反応容量4 μLにします。
- LR酵素ミックスを2回ずつ1分間激しくボルテックスして適切な混合を確保し、次に反応に1 μLを加えて完全に混合します。
- 25°Cで一晩(16+時間)インキュベートします。
- 0.5 μLのプロテイナーゼK(2 μg/μL)を加えてLR反応を停止し、37°Cで10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。
- 3〜4 μLのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に形質転換するには、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置します。
- 細胞を氷の上に置いた状態で、2枚のLB-アンピシリン寒天プレートを室温に温めます。
- 細胞を42°Cの水浴中で正確に30秒間ヒートショックします。
- ヒートショック後、抗生物質を含まないリッチな液体培地250 μLを細胞に加え、37°Cで1.5時間振とうしながらインキュベートします。
- 1枚のアンピシリンプレートに300 μLの細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌朝、透明と不透明の2つの表現型の存在についてコロニーをスクリーニングし、透明なコロニー(Kwan et al.10に記載されている)を一度に1つずつ選び、液体培養液を接種し、37°Cで一晩振とうします。
注:透明なコロニーには、ほとんどの場合、正しいLRコロニーが含まれています(>85%の確率)。 - 製造元の指示に従って市販のキットを使用して、各液体培養でプラスミド調製を実行し、各プラスミドを診断的に消化して、LRゲートウェイ反応が適切に機能したことを示すトランスジェニックコンストラクトの適切なサイズを確認します。
- 0.5-1 μLのプラスミドを使用して、ステップ5.4-5.12に記載されている標準的な細菌形質転換プロトコルを使用して正しいトランスジェニックコンストラクトを再形質転換し、37°Cで1時間インキュベートします。
- コロニーを再ストリークし、それぞれがステップ5.14のようにLRトランスジェニック構築物を有することを確認する。
- ステップ4.5に記載されているようにプラスミド濃度を決定します(胚注射には少なくとも150 ng/μLが必要です)。
6.導入遺伝子の胚への注入
- シングルユーストランスポザーゼmRNAサンプルとTol2トランスジェニックコンストラクトを氷上で解凍し、アガロース注射プレートを室温に事前に警告します。
- 氷上で次のものを組み合わせます:150 ngのプラスミド、100 ngのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッド(0.3 μL)。次に、RNAフリーの水を加えて容量を3μLにします。
- 寒天を完全に覆うEMで満たされた注入プレート(ステップ2に記載)にトランスファーピペットを使用して1つの細胞段階の胚を移し、次に注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。
- mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加し、キャピラリーニードルを射出リグアーマチュアに配置し、射出リグをオンにします。
メモ:注入リグは、空気などの圧縮ガスを使用して、活性化時にmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の所望の量(ステップ6.5で説明)を胚にパルスします。 - キャピラリーニードルを注入プレートのEMに下げ、鉗子を使用して先端を折って、少量のmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物のみを注入リグから汲み出すことができます。
- mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の小さな3 nLボーラスを胚の細胞体に注入します。
注:3 nLボーラスは、理論的には7つのボーラスが胚の正中線全体に均等に適合するmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の体積です。 - 胚の注入が終了したら、スロットからそっと飛び出し、新鮮なEM(約40 mL)を含む100 mmのペトリ皿にトランスファーピペッティングして注入プレートから取り出し、28.5°Cでインキュベートして胚を発育させます。
7. 遺伝子導入胚のスクリーニング
- 蛍光タンパク質の発現には、蛍光導入遺伝子を発現させる適切な発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡で蛍光の存在をスクリーニングします。
注:これらの胚は、その発現においてモザイク化され、トランスジェニック構築物のゲノム挿入を示す。 - 異なる宛先ベクターに含まれる、遺伝子 cmlc2 またはmCherryの心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカー(ステップ7.1に記載される)のスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。
- トランスジェニック挿入陽性の胚が成体のゼブラフィッシュ期に完全に発達するのを待ちます。
- 潜在的なトランスジェニック魚が繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに繁殖させることにより、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現性の両方について個別にスクリーニングします。
- 胚が正常に発達し、最も強力かつ最も適切な導入遺伝子発現を与える成虫は、将来の研究と分析のためにユニークなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統として保持されます。
注:トランスジェニックコンストラクトのゲノム挿入をスクリーニングするための代替アプローチとして、トランスジェニックコンストラクトのみを増幅し、野生型DNAを増幅しないPCRプライマーを設計します。
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Representative Results
トランスジェニック構築物を生成するために、我々はTol2トランスジェネシスシステムを使用した。遺伝子プロモーター/エンハンサーエレメントを保持するp5E、プロモーター/エンハンサーエレメントによって発現される遺伝子を保持するpME、および少なくともpolyAテールを保持するp3Eを含む3つのエントリーベクターを使用して、マルチサイトゲートウェイLRクローニング を介して トランスジェニック構築物を生成しました。宛先ベクターpDestは、ゼブラフィッシュ胚におけるトランスジェニック構築物のゲノム挿入のためのTol2リピートを提供し、細菌の増殖に必要なすべての遺伝情報を含んでいます(図1A)。この原稿の目的のために、我々は sox17:EGFPCAAX トランスジェニックコンストラクトを作成して注入した。内胚葉 マーカーsox17のプロモーターは、ゼブラフィッシュの発育中の内胚葉において膜タグ付きEGFPを駆動するために使用されました。非蛍光色素タンパク質を発現するトランスジェニック構築物の場合、 cmlc2:EGFP などの蛍光トランスジェニックマーカーを含むpDestベクターを使用して、ゲノム挿入を補助することができます(図1A)。
上記のプロトコル(表2)に記載されている値を使用して、 sox17:EGFPCAAX トランスジェニックコンストラクトを生成し、このコンストラクトの4μLを化学的に有能な 大腸菌 細胞に形質転換しました。37°Cで一晩インキュベートした後、寒天プレートには約250個のコロニーが含まれていました(LR反応は通常、私たちの研究室ではプレートあたり平均150〜300コロニーです)。これらのコロニーのスクリーニングは、混濁に基づいて行った。私たちの手では、透明なコロニーは正しい sox17:EGFPCAAX 産物を持っていました>85%の確率で)が、不透明なコロニーには正しい組換え産物が含まれていませんでした(図1B、矢印対矢印)。いくつかのコロニーからプラスミドを単離した後、制限酵素NcoIを用いて組換え産物の制限消化を行った。2つの異なる透明なコロニーと1つの不透明なコロニーが消化されました。両方の透明なコロニーは、9,544 bpの正しいサイズの単一バンドを有し(未消化のプラスミドをダイジェストコントロールとしてロード)、不透明なコロニーにはバンドを全く持っていませんでした(図2A)。これらの陽性の sox17:EGFPCAAX コンストラクトを再形質転換し、その後のコロニーを再ストリークし、それらのコロニーがプラスミドを有することを確認し、-80°Cのバクテリアフリーザーストックを生成しました。 sox17:EGFPCAAX プラスミドとキャップドトランスポザーゼmRNAの両方の濃度を測定し、両方とも注射に使用できるようにしました(図2B)。
胚は、1つの細胞期胚を予め加温した胚注入型に入れることによって注入のために調製した(図3A−C)。射出成形金型に入れたら、 sox17:EGFPCAAX mRNAを含む注射針をマイクロマニピュレーターのマイクロピペットホルダーに入れました(図3D、E)。胚には、100 ngのトランスポザーゼmRNA、150 ngの sox17:EGFPCAAX プラスミド、およびフェノールレッド(注射追跡色素)を注射しました。3 nLのボーラス(プロトコル、ステップ6.6に記載されているサイズによって決定)を、統合の可能性を最大限に高めるために、胚の卵黄ではなく細胞体に注入しました(図3F)10。
注射後、胚を射出成形型から取り出し、24時間発育させた。受精後24時間(hpf)に、胚をEGFPCAAXの内胚葉発現についてスクリーニングした。 モザイク内胚葉EGFPCAAX発現は、注入された胚の~75%で観察された(図4A、A ́)。Gal4やCreERT2などの非蛍光導入遺伝子を注入した胚をスクリーニングするには、トランスジェニックマーカー(すなわち、cmlc2:EGFP)(図1A)も含む宛先ベクターを使用できます(図4B、B ')。sox17:EGFPCAAXの生殖細胞系列導入を有する成体ゼブラフィッシュは、内胚葉がEGFPCAAXで完全に標識された蛍光胚を作製した(図4C)。
新しく作成したsox17:EGFPCAAXトランスジェニックラインを使用して、内胚葉パウチの形成に対するエタノールの影響を直接評価することができました。ポーチは、内胚葉の側縁に形成される突起であり、顔面骨格および多臓器系の形成に重要である17。我々は以前に、骨形成タンパク質(Bmp)シグナル伝達を遮断すると、パウチの形成不全が生じることを示した18。我々は今、10-18 hpfのBmp変異体のエタノール処理がパウチのサイズに微妙でありながら重要な影響を与えることを示しています。パウチ1〜5(ゼブラフィッシュには6つのポーチがあるが、6番目のポーチは画像化された発生段階ではまだ完全に形成されていなかった)からの各ポーチの背腹側の長さを、対照およびエタノール処理した野生型BMP変異胚で測定した(図5A)。エタノール曝露による一般的な成長影響の対照として、内胚葉全体の前後の長さを測定した(図5A)。内胚葉の全長は、遺伝子型や治療の影響を受けませんでした(図5B)。しかし、パウチ1および3は、未処理の野生型胚とエタノール処理された野生型胚の間でパウチの長さが有意に増加したが、未処理のBmp変異体とエタノール処理されたBmp変異体の間では有意な長さの減少を示した(図5C;双方向ANOVA;パウチ1:F(1,54)= 10.39、p = 0.0021;パウチ3:F(1,54)= 12.70、 p = 0.0008)。パウチ2は、未処理群とエタノール処理群の野生型およびBMP変異体群の間で、それぞれパウチサイズの有意な増加を示した(図5C;双方向ANOVA;F(1,54) = 18.94, p < 0.0001)。
図1:導入遺伝子構築のためのLRゲートウェイ反応 。 (A)モジュラー4部LRゲートウェイクローニング反応の概略図。LRクローナーゼは、3つのエントリーベクターp5E、pME、およびp3Eと宛先ベクターpDestを高度に特異的な反応で再結合し、胚注入の準備ができている新しいトランスジェニック産物を生成します。非蛍光導入遺伝子をスクリーニングするために、pDestベクターは任意のトランスジェニックマーカー(例としてcmlc2:EGFP)を含むことができる。(b)LR組換え産物の形質転換から得られる細菌コロニーの例。透明なコロニーには正しいLR組換え産物が含まれていましたが>85%の確率で(矢印)、不透明なコロニーには正しい組換え産物が含まれていませんでした(矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プラスミドDNAおよびトランスポザーゼmRNAの分析 。 (a)LR組換え産物の形質転換からの3つのコロニーの消化を診断する。単一の不透明なコロニーにはスクリーニング用のプラスミドが含まれていませんでしたが、2つの透明なコロニーには9,544 bpの単一のバンドが含まれていました(ノーカット対カット)。(B)1,950 bpのトランスポザーゼmRNA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゼブラフィッシュ胚注入のセットアップ。 (A)射出成形金型をEM(3%v/v)で希釈した液体アガロースに入れます。(b)固化したら、アガロースプレートからモールドを取り出す。(C)胚は射出成形金型に配置されます。(D,E)mRNA/プラスミド/フェノールレッドの混合物は、マイクロマニピュレーターのマイクロピペットホルダーに入れられた注射針にピペットで送られます。(f)3nLのボーラスを1細胞段階で胚の細胞体に注入する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トランスジェニックコンストラクトを注入したゼブラフィッシュのスクリーニング。 (A,A') 24 hpfで撮影された胚の共焦点画像は、sox17:EGFPCAX導入遺伝子のモザイク発現を示す。(B,B')24 hpfでの発達中の心臓におけるcmlc2:EGFPのトランスジェニックマーカー発現。胚の側面図、左前方、上部が背側。(C)導入遺伝子を有する成体ゼブラフィッシュから生成された胚の共焦点画像。内胚葉全体がEGFPCAXを発現している。胚の側面図、左前方、上部に腹側。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:エタノール処理した野生型およびBMP変異胚におけるパウチ測定。 (a)内胚葉の全長とパウチの長さの測定を示す模式図。(B)前後の内胚葉全長の測定では、未処理とエタノール処理の野生型およびBmp変異胚との間に差は見られない。(C)背腹側パウチ長の測定は、パウチ1および3が未処理およびエタノール処理された野生型胚の間でパウチ長の増加を示すが、未処理およびエタノール処理Bmp変異体の間で長さが減少することを示している(双方向ANOVA;パウチ1:F(1,54)= 10.39、p = 0.0021;パウチ3: F(1,54)= 12.70、 p = 0.0008)。パウチ2は、未処理およびエタノール処理された野生型およびBMP変異体群との間の長さの増加を示す(双方向ANOVA;F(1,54) = 18.94, p < 0.0001)。パウチ4と5の間でパウチの長さに差は見られなかった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ラブリーラボに収容されているTol2Kitコンポーネント。 Lovely Labで利用可能なすべてのエントリおよび宛先ベクター、それらの説明、およびそれらの起源のラボ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:LR再結合反応における各ベクターの量と協奏の計算。 各ベクターの量は、サイズ(bp単位)と各成分に必要なfmol(各エントリーベクターの10fmolと宛先ベクターの20fmol)から計算した。プラスミド濃度から、各ベクターを滅菌水で希釈し、LR反応に1 μL以下添加します。滅菌水を4 μLになるようにベクタープールに加え、1 μLのLR反応混合物を反応に加え、25°Cで一晩インキュベートします。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、エタノール曝露が発育および病態に与える影響を研究するのに理想的です7,8。ゼブラフィッシュは、半透明の、体外受精の、遺伝的に扱いやすい胚を大量に産生し、複数の環境状況で同時にいくつかの導入遺伝子標識組織および細胞タイプのライブイメージングを可能にします19,20。これらの強みは、ヒトとの強力な発生的遺伝的保存と相まって、ゼブラフィッシュをエタノールの影響を画像化するための強力なモデルシステムにしています7,8。ここでは、トランスジェニックコンストラクトを生成および注入し、将来のエタノール研究のためにトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を確立するためのモジュラーアプローチのプロトコルについて説明しました。
トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するために、多くの異なるアプローチが確立されています。しかし、トランスジェニックコンストラクトとトランスジェニック株の両方を生成することは困難な場合があります。従来のサブクローニング技術、BACクローニング、またはギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチでは、トランスジェニック構築物を生成できますが、スループットが低く、構造の多様性に欠けています10。さらに、これらの戦略は、作成されたすべてのトランスジェニックコンストラクトに対して再設計する必要があります。サブクローニングでは、必要なすべての制限部位が存在し、一意であると仮定して、複数の消化とライゲーションが必要です。BACクローニングには、複数のBACクローンのシーケンシングとテストが必要です。ギブソンアセンブリでは、トランスジェニックコンストラクトごとに新しいPCRプライマーを設計する必要があります。さらに、切断されていないDNAまたは直鎖化されたDNAのいずれかの注入は、低生殖細胞系列伝達をもたらす21、22、23。
Tol2Kitは、ゲートウェイクローニングを使用して、トランスポザーゼmRNAと組み合わせると、トランスジェネシスと生殖細胞系列の伝達を大幅に増加させるTol2リピートに隣接する完全なトランスジェニックコンストラクトを生成するモジュラーシステムです10,11,24,25。数十のエントリーベクトルと宛先ベクターは、クワンラボとコールラボ10,11から入手できます。さらに、Tol2Kitを使用するゼブラフィッシュラボは、さらに多くのエントリおよび宛先ベクターを生成およびキュレーションしています。利用可能なベクトルの幅の例として、70を超えるベクトルをプールして使用しました(表1)。これらすべてのコミュニティリソースを使用すると、LR反応で選択したベクターを組み合わせるだけで、何千もの異なるトランスジェニック構築物をすばやく生成できます。
最適なLR反応には、プラスミドのサイズと濃度の正確な計算が必要です。各ベクターの計算はフェムトモール(fmol)値で行われるため、各反応はトランスジェニックコンストラクトを生成するために大量のプラスミドを必要としません。しかしながら、この少量のプラスミドは、希釈および適切なピペッティングを反応の成功にとって非常に重要にする10。LR反応に影響を与える可能性のあるその他の要因は、さまざまなエントリーベクターのインサートのサイズです。例えば、この研究で使用された p5E-sox17 エレメントは4kbを超えており、同じ大きさのpMEおよびp3Eエレメントと組み合わせると、非常に大きなトランスジェニックベクターになります。細菌中の大きなプラスミドは培養が困難であり、したがって細菌の形質転換から生成されるコロニーの数が減少する。これにより、単離された場合、増殖が遅くなり、プラスミドレベルが低下します10。重要なことに、高度に有能な細菌細胞を有すること、ならびに組換えプラスミドの形質転換中の細菌細胞のインキュベーションを増加させることは、適切な導入遺伝子形成を捕捉するのに十分なコロニーを生成するための鍵となる。さらに、正しいLR反応酵素( 材料表に記載)を使用することも、LR反応の成功に大きな役割を果たします。
トランスジェニック構築物の生成と細菌の形質転換を超えて、胚の注入とゲノム統合も困難な場合があります。高品質のトランスポザーゼmRNAの生成は、ゲノム統合の頻度を大幅に増加させます10。古い針は毛細血管現象を失う可能性があるため(つまり、注入液が針の先端に移動できない)、胚を注入する直前に引っ張られた毛細血管を作成する必要があります(図3E)。針先を折って~3nLの液体しか注入しないことと、細胞体に注入することの両方に練習が必要です。私たちのトレーニングプロトコルでは、針が折れるまでフェノールレッド注射染料のみを細胞体に注入し、胚の注入が習得されます。細胞体に注入すると、ゲノム組み込み率が劇的に増加します10。これらすべてを組み合わせると、平均して75%以上のゲノム挿入とモザイク発現がありますが、これは構築物ごとに異なる場合があります。
ゲノム挿入はランダムである可能性があるため、モザイク発現を示すすべての胚は固有のトランスジェニック挿入であり、継続的なスクリーニングが必要です。この継続的なスクリーニングは、組み込み部位が胚の発生に有害ではないこと、生殖細胞系列の伝達が起こること、および導入遺伝子の発現が減弱しないか、潜在的にサイレンシングされないことを示すために必要です。トランスジェニック株が確立されると、エタノール研究における複数の分析に容易に使用できます。これらの非蛍光トランスジェニック構築物の場合、一般的に使用されるトランスジェニックマーカーには、それぞれ心臓と網膜を標識し、継続的なトランスジェニックスクリーニングを可能にする cmlc2:GFP および αcrystallin:RFPが含まれます。スクリーニング用のトランスジェニックマーカーに加えて、これら2つの導入遺伝子は、心臓および網膜の発達に対するエタノールの影響を直接研究するために使用することができる。
上記のプロトコルを使用して、内胚葉特異的膜タグ付きEGFP構築物の安定した生殖細胞系列伝達を有する sox17:EGFPCAAX トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を生成しました。このラインを使用して、エタノール感受性Bmp変異胚の内胚葉パウチ形成に対するエタノールの影響を測定することができました。エタノール処理されたBmp変異体では、パウチ1〜3のサイズが影響を受けましたが、パウチ4と5のサイズも内胚葉全体の長さも影響を受けませんでした(図5)。このパイロット研究は、Bmp-エタノール相互作用が内胚葉形成、特にパウチ形成の根底にある細胞挙動を破壊することを示唆している。この研究は、エタノール研究のためのトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を生成することの有用性を例示している。その結果、新しいトランスジェニック株を作成することで、FASDにおけるエタノール感受性細胞プロセスと組織イベントの理解が大幅に向上します。
最終的に、トランスジェニックゼブラフィッシュ、および一般的なゼブラフィッシュは、FASD 7,8の研究において信じられないほど強力であることが証明されています。Tol2Kitは非常に汎用性の高いツールキットであり、研究者はゼブラフィッシュに注入する準備ができている複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成することができます。モジュラー設計と新しいエントリーベクターの生成の容易さにより、コンポーネントを再設計することなくトランスジェニックコンストラクトを生成する際の非常に柔軟性が得られます。全体として、このツールキットは、ゼブラフィッシュの研究とFASDの理解を深めることを目的とした一般的な研究の両方を大幅に改善します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この記事で紹介した研究は、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH / NIAAA)R00AA023560からCBLへの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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