Summary
이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 태아기 에탄올 노출로 인해 발생하는 매우 다양한 구조적 결함 및 인지 장애가 특징입니다. FASD의 복잡한 병리로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 발달 결함에 대한 현재의 이해에 중요한 것으로 입증되었습니다. Zebrafish는 제브라피쉬와 인간 사이의 유전학 및 발달 모두의 높은 수준의 보존으로 인해 에탄올로 인한 발달 결함을 조사하는 강력한 모델임이 입증되었습니다. 모델 시스템으로서 제브라피쉬는 유전적으로 다루기 쉽고 반투명한 많은 수의 외부 수정 배아를 포함하여 발달 연구에 이상적인 많은 특성을 가지고 있습니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 시기와 투여량을 정확하게 제어할 수 있습니다. 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 중요한 유전 도구 중 하나는 형질전환입니다. 그러나 형질전환 구조체를 생성하고 형질전환 계통을 설정하는 것은 복잡하고 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 연구자들은 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템을 구축했습니다. 이 모듈식 시스템은 완전한 Tol2 트랜스포존 기반 형질전환 구조의 빠른 조립을 위해 다중 사이트 게이트웨이 클로닝 접근 방식을 사용합니다. 여기에서는 유연한 Tol2 시스템 도구 상자와 제브라피쉬 형질전환을 위한 준비가 된 형질전환 구조를 생성하고 에탄올 연구에서의 사용을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
Introduction
태아기 에탄올 노출은 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)라고 하는 구조적 결함 및 인지 장애의 연속체를 유발합니다.1,2,3,4. 여러 요인 간의 복잡한 관계는 인간에서 FASD의 병인을 연구하고 이해하는 것을 어렵게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 동물 모델이 사용되었습니다. 이 모델에서 사용할 수 있는 생물학적 및 실험적 도구는 에탄올 기형 유발성의 기계론적 기초에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 것으로 입증되었으며, 이러한 모델 시스템의 결과는 인간 에탄올 연구에서 발견된 것과 현저하게 일치했습니다 5,6. 이 중 제브라피쉬는 에탄올 기형 형성을 연구하는 강력한 모델로 부상했습니다.7,8, 부분적으로는 외부 수정, 높은 번식력, 유전적 다루기 쉬움 및 반투명 배아로 인해 발생합니다. 이러한 강점이 결합되어 제브라피쉬는 형질전환 제브라피쉬 계통을 사용한 FASD의 실시간 라이브 이미징 연구에 이상적입니다.
형질전환 제브라피쉬는 배아 발달의 여러 측면을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다9. 그러나 형질전환 구조체 및 후속 형질전환 계통을 만드는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 표준 이식유전자는 이식유전자를 구동하기 위한 활성 프로모터 요소와 폴리 A 신호 또는 "꼬리"를 필요로 하며, 모두 일반적인 벡터 유지를 위해 안정적인 박테리아 벡터에서 필요합니다. 다성분 형질전환 구축물의 전통적인 생성은 여러 시간이 소요되는 서브클로닝 단계(sub-cloning steps)를 필요로 한다(10). Gibson 어셈블리와 같은 PCR 기반 접근 방식은 하위 복제와 관련된 일부 문제를 우회할 수 있습니다. 그러나, 독특한 프라이머는 모든 독특한 형질전환 구축물10의 생성을 위해 설계되고 시험되어야 한다. 이식유전자 구성 외에도 게놈 통합, 생식계열 전달 및 적절한 이식유전자 통합을 위한 스크리닝도 어려웠습니다. 여기서는 트랜스포존 기반 Tol2 형질전환 시스템(Tol2Kit)을 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다(10,11). 이 모듈식 시스템은 다중 사이트 게이트웨이 클로닝을 사용하여 계속 확장되는 "진입" 및 "대상" 벡터 라이브러리에서 여러 형질전환 구조를 신속하게 생성합니다. 통합된 Tol2 전치 가능한 요소는 형질전환 속도를 크게 증가시켜 여러 형질전환 유전자의 신속한 구성 및 게놈 통합을 가능하게 합니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 내배엽 형질전환 제브라피쉬 계통의 생성이 FASD의 기초가 되는 조직 특이적 구조적 결함을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 궁극적으로, 이 프로토콜에서 우리는 모듈식 설정과 형질전환 구조의 구성이 제브라피쉬 기반 FASD 연구에 크게 도움이 될 것임을 보여줍니다.
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Protocol
이 절차에 사용된 모든 제브라피쉬 배아는 확립된 IACUC 프로토콜12에 따라 사육 및 사육되었습니다. 이 프로토콜은 루이빌 대학교의 승인을 받았습니다.
참고: 야생형 제브라피쉬 균주인 AB와 bmp4st72;smad5b1100 이중 돌연변이 계통이 이 연구에 사용되었습니다. 이 과정에서 사용된 모든 물은 멸균 역삼투압수였다. 컨포칼 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 촬영되었습니다. 내배엽 측정은 ImageJ의 측정 도구를 사용하여 이루어졌습니다. 모든 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
1. 솔루션과 미디어 만들기
- 박테리아 배지: 제조업체의 지침에 따라 LB 국물 또는 한천을 녹이고 오토클레이브합니다. 배지를 100mm 페트리 접시에 붓기 전에 암피실린(50μg/mL), 카나마이신(50μg/mL) 또는 암피실린/클로람페니콜 조합(각각 50μg/mL 및 30μg/mL)을 추가합니다.
- 20x 배아 배지 스톡을 만들기 위해, 다음을 1 L의 물에 용해시킨다: 17.5 g의 NaCl, 0.75 g의 KCl, 2.9 g의 CaCl2, 0.41 g의 K2HPO4, 0.142 g의 Na2HPO4 및 4.9 g의 MgSO4·7H2O.0.22 μm 진공 여과 시스템을 사용하여 원액을 필터 멸균하고, 4 °C에서 보관하십시오.
알림: 형성되는 흰색 침전물을 무시하십시오. 이것은 미디어에 영향을 미치지 않습니다. - 19 L의 물에 1.2 g의 NaHCO3를 용해시키고, 1 L의 20x 배아 배지 스톡을 첨가하여 작업 배아 배지 용액을 생성하고, 이 용액을 28°C에서 유지한다.
- 2 % 페놀 레드 용액의 경우 페놀 레드 나트륨 염 20mg을 RNase가없는 물 1mL에 녹여 실온에서 보관합니다.
2. 배아 사출 금형
- 아가로스 주입판을 만들기 위해, 끓을 때까지 가열하여 배아 배지를 최종 농도 3%로 용해시킨다.
- 50mL의 아가로스를 100mm 페트리 접시에 붓고, 아가로스가 여전히 액체인 동안, 몰드 아래에 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 아가로스에 사출 몰드를 부드럽게 놓습니다.
- 아가로스 플레이트를 식히십시오. 아가로스가 고체가 되면, 사출 몰드를 제거하고, 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관한다.
3. 주입 피펫
- 솔레노이드가 2.5로 설정되고 발열체가 14.6으로 설정된 수직 피펫 풀러를 사용하여 필라멘트가 포함된 1.0mm(OD) 모세관을 바늘로 당깁니다.
알림: 가열된 풀러는 모세혈관을 두 개의 바늘로 깨끗하고 고르게 당기면 작동하지만 일관된 주사 결과를 얻으려면 제브라피쉬 배아를 주사한 후 1주일 이내에 주사 바늘을 당겨야 합니다.- 풀러에 모세관을 놓고 클램프를 조이고 양쪽 끝을 조인 다음 발열체를 작동시킵니다.
- 모세관을 당겨 두 개의 주사 바늘을 만듭니다.
- 풀러에서 모세관을 제거하고 바늘 홀더 역할을 하는 모델링 점토 스트립이 있는 빈 페트리 접시에 보관합니다.
4. 트랜스포이즈아제 mRNA 제제
- 0.5mL 미세원심분리기 튜브에서 10μL의 트랜스포이즈아제 플라스미드(150ng/μL), 1.5μL의 제한 엔도뉴클레아제 반응 완충액, 0.3μL의 NotI 엔도뉴클레아제를 조합하여 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 트랜스포이즈아제를 포함하는 Tol2Kit 플라스미드를 선형화합니다.
- RNase가 없는 물로 최대 20μL의 반응을 채운 다음 37°C에서 밤새 혼합하고 분해합니다.
- 1 μL의 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL의 5 MNH4OAc, 및 80 μL의 100% EtOH를 분해 반응에 첨가하여 트랜스포사제 분해를 중지한 다음, -20 °C에서 밤새 혼합하고 냉각시킨다.
- 용액을 4°C에서 20분 동안 14,000x g 로 원심분리한 다음, 상층액을 흡인하고 RNase가 없는 물에 DNA 펠릿을 재현탁합니다.
- 먼저 RNase가 없는 워터 블랭크 2μL를 실행한 다음 선형화된 플라스미드 2μL를 실행하여 형광측정기를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위의 선형 플라스미드 농도를 결정합니다.
참고: 플라스미드 농도는 일반적으로 100-200ng/μL 범위입니다 - 0.5mL 미세원심분리기 튜브에서 10μL의 2x NTP/CAP, 2μL의 10x 반응 완충액, 0.1-1μg의 선형 DNA 주형 및 2μL의 SP6 효소 혼합물과 같은 성분을 순서대로 조합하여 SP6 mRNA 생산을 설정합니다.
- RNase가 없는 물로 최대 20μL의 반응을 채운 다음 37°C에서 2시간 동안 혼합하고 배양합니다.
- 2시간 동안 배양한 후 1μL의 DNase를 넣고 잘 섞은 다음 37°C에서 추가로 15분 동안 배양합니다.
- SP6 반응을 중지하려면 30μL의 LiCl 침전 용액을 반응 튜브에 추가한 다음 혼합하고 -20°C에서 밤새 냉각합니다.
- 용액을 4°C에서 20분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하여 mRNA를 펠릿화한 다음, 상청액을 흡인하고 mRNA 펠릿을 80% EtOH 1mL(RNase가 없는 물로 희석됨)로 세척합니다.
- 용액을 4°C에서 20분 동안 14,000 x g 로 원심분리하여 mRNA를 펠릿화한 다음, 상청액을 흡인한다. 펠릿을 공기 중에서 건조시키십시오.
- RNase가 없는 물 20μL에 mRNA 펠릿을 재현탁하고, 4.5단계(최소 100ng/μL이어야 함)에 설명된 대로 형광계를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위의 mRNA 농도를 결정하고, 일회용으로 튜브당 mRNA 100ng을 분취하고, -80°C에서 보관합니다.
참고: mRNA가 분해되지 않도록 하기 위해 2μL의 mRNA를 DNA 전기영동 겔에서 신속하게 실행하여 1,950bps에서 단일 밴드를 확인할 수 있습니다.
5. 형질전환을 위한 진입 벡터를 생성하기 위한 다중 사이트 게이트웨이 복제
참고: 이 프로토콜은 Kwan et al.10에서 수정되었으며, LR 반응은 half-LR 반응으로 작성되었으며 총 부피는 5μL입니다. 새로운 진입 요소를 생성하기 위해, 5', 중간, 및 3' 공여체 벡터를 사용하는 BP 반응이10,13을 사용될 필요가 있다.
- 반응을 수행하기 위해 p5E, pME 및 p3E의 각각 10fmol과 대상 벡터(pDest)의 20fmol을 수집합니다.
참고: 다중 부위 LR 재조합은 5' 진입 벡터(p5E), 중간 진입 벡터(pME), 3' 진입 벡터(p3E) 및 목적지 벡터(pDest)의 4가지 다른 플라스미드 벡터를 사용하여 제브라피쉬 배아에 주입할 준비가 된 Tol2 반복이 측면에 있는 고유한 형질전환 구조를 생성합니다.- 플라스미드 공급원으로부터 염기쌍에서 4개의 벡터 모두의 크기를 확인한다(표 1, Tol2Kit Wiki페이지 14 또는 Addgene11; 재료 표 참조).
참고: 새로운 벡터의 경우 상용 시퀀싱 회사를 통한 전체 플라스미드 시퀀싱을 통해 정확한 플라스미드 크기(bps)를 제공할 수 있습니다. - 4.5단계에서 설명한 대로 형광측정기를 사용하여 마이크로리터당 나노그램(ng/μL) 단위로 4개 벡터의 농도를 모두 측정합니다.
- DNA의 무게를 660g/mol로 사용하고 플라스미드 크기(bps)를 사용하여 10fmol(진입 벡터) 또는 20fmol(대상 벡터)에 도달하는 데 필요한 플라스미드의 총 나노그램(ng)을 계산합니다.
참고: 콜로라도 대학교(University of Colorado, Anschutz Medical Campus)의 Mosimann 연구실은 LR 반응에 필요한 플라스미드의 양(ng)과 벡터의 부피(μL)를 계산하기 위해 무료로 사용할 수 있는 스프레드시트를 생성했습니다15.
- 플라스미드 공급원으로부터 염기쌍에서 4개의 벡터 모두의 크기를 확인한다(표 1, Tol2Kit Wiki페이지 14 또는 Addgene11; 재료 표 참조).
- 이하에 기술된 구축물 sox17:EGFPCAAX를 생성하기 위해, 하기 벡터를 사용한다: 크기16에서 6,918 bp인 제브라피쉬 sox17 프로모터를 함유하는 p5E 벡터; 크기가10인 프레닐화 EGFP를 포함하는 pME 벡터; 크기가10인 SV40 후기 poly A 신호 서열을 포함하는 p3E 벡터; 그리고 pDest는 크기 5,883에서10bp입니다.
- 5.1.2단계에서 측정된 플라스미드 농도와 각 벡터(단계 5.1.3)에 대한 나노그램(ng) 단위의 양을 사용하여 10fmol(진입 벡터) 또는 20fmol(대상 벡터)에 도달하는 데 필요한 각 플라스미드의 총 마이크로리터(μL)를 계산한 다음 5μL half-LR 반응에 사용하기 위해 이를 2로 나눕니다(아래 나열된 모든 값은 표 2에 나열됨).
- 10fmol의 p5E-sox17을 생성하려면 45.66ng(농도 140.3ng/μL)를 사용하고 멸균수로 4배 희석하여 0.65μL를 얻습니다.
- 10fmol의 pME-EGFPCAAX를 생성하려면 22.08ng(213.5ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 10배 희석하여 0.52μL를 얻습니다.
- 10fmol의 p3E-poly A를 생성하려면 15.73ng(276.1ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 20배 희석하여 0.57μL를 얻습니다.
- 대상 벡터 20fmol의 경우 77.66ng의 pDest(307.3ng/μL 농도)를 사용하고 멸균수로 5배 희석하여 1.63μL를 얻습니다.
- 5μL half-LR 반응을 설정하려면 5.3단계에서 측정된 p5E, pME, p3E 및 pDest의 부피를 0.5mL 미세 원심분리기 튜브에 결합한 다음 멸균수를 추가하여 총 반응 부피 4μL에 도달합니다.
- LR 효소 혼합물을 각각 1분 동안 2회 격렬하게 소용돌이쳐 적절한 혼합을 확인한 다음 반응에 1μL를 추가하고 완전히 혼합합니다.
- 25°C에서 하룻밤(16+ 시간)에 배양합니다.
- 0.5μL의 프로테이나제 K(2μg/μL)를 첨가하여 LR 반응을 중지하고 37°C에서 10분 동안 배양한 다음 실온으로 냉각합니다.
- 플라스미드를 첨가하고 세포를 25-30분 동안 얼음 위에 두어 3-4μL의 플라스미드를 해동되고 화학적으로 유능한 세포로 변환합니다.
- 세포가 얼음 위에 앉아있는 동안 두 개의 LB- 암피실린 한천 플레이트를 실온으로 따뜻하게합니다.
- 42°C 수조에서 정확히 30초 동안 셀을 열 충격합니다.
- 열 충격 후 250μL의 항생제가 없는 풍부한 액체 배지를 세포에 추가하고 37°C에서 1.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다.
- 하나의 암피실린 플레이트에 박테리아 300μL를 뿌리고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음날 아침, 콜로니를 투명 및 불투명의 두 가지 표현형의 존재에 대해 스크리닝하고, 투명한 콜로니(Kwan et al.10에 설명된 대로)를 한 번에 하나씩 선택하고, 액체 배양물을 접종한 다음, 37°C에서 밤새 진탕합니다.
참고: 투명 콜로니에는 거의 항상 올바른 LR 콜로니가 포함됩니다(>85%). - 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 각 액체 배양에 대해 플라스미드 준비를 수행하고 각 플라스미드를 진단적으로 분해하여 형질전환 구조체의 적절한 크기를 확인하며, 이는 LR 게이트웨이 반응이 제대로 작동했음을 나타냅니다.
- 0.5-1 μL의 플라스미드를 사용하여 단계 5.4-5.12에 기술된 바와 같이 표준 박테리아 형질전환 프로토콜을 사용하여 올바른 형질전환 구축물을 재형질전환하고, 단지 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 콜로니를 다시 줄무늬로 만들고 각각이 단계 5.14에서와 같이 LR 형질전환 구조를 갖는지 확인합니다.
- 4.5단계에 설명된 대로 플라스미드 농도를 결정합니다(배아 주입에는 최소 150ng/μL이 필요함).
6. 배아에 이식유전자 주입
- 일회용 트랜스포이즈제 mRNA 샘플 및 Tol2 형질전환 구조체를 얼음 위에서 해동하고 아가로스 주입 플레이트를 실온으로 사전 경고합니다.
- 얼음 위에서 플라스미드 150ng, 전이효소 mRNA 100ng, 2% 페놀 레드(0.3μL)를 혼합합니다. 그런 다음 RNA가 없는 물을 추가하여 부피를 3μL로 만듭니다.
- 이식 피펫을 사용하여 하나의 세포 단계 배아를 한천을 완전히 덮는 EM으로 채워진 주입 플레이트(2단계에서 설명됨)로 옮긴 다음 주입 플레이트의 슬롯당 약 50-75개의 배아를 부드럽게 누릅니다.
- mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물을 모세관 주사 바늘의 열린 끝에 추가하고 모세관 바늘을 주입 장비 전기자에 놓고 주입 장비를 켭니다.
참고: 주입 장비는 공기와 같은 압축 가스를 사용하여 활성화될 때 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 원하는 부피(6.5단계에서 설명)를 배아로 펄스합니다. - 모세관 바늘을 주입판의 EM으로 내리고 집게를 사용하여 팁을 부수어 주입 장비에서 소량의 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물만 펌핑할 수 있도록 합니다.
- mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 작은 3nL 볼루스를 배아의 세포체에 주입합니다.
참고: 3nL 볼루스는 이론적으로 7개의 볼루스가 배아의 정중선에 균등하게 맞을 수 있는 mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물의 부피입니다. - 배아 주입이 끝나면 배아를 슬롯에서 부드럽게 꺼내 주입 플레이트에서 제거하고 신선한 EM(약 40mL)이 담긴 100mm 페트리 접시에 옮겨 피펫팅한 다음 28.5°C에서 배양하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다.
7. 형질전환 삽입을 위한 배아 스크리닝
- 형광 단백질의 발현을 위해 형광 이식유전자가 발현되어야 하는 적절한 발달 단계를 선택하고 형광 해부 현미경으로 형광의 존재 여부를 스크리닝합니다.
참고: 이 배아는 발현이 모자이크이며 형질전환 구조의 게놈 삽입을 보여줍니다. - 별개의 표적 벡터에 함유되어 있는 αcyrstallin의 수정체 특이적 프로모터에 의해 구동되는 유전자 cmlc2 또는 mCherry에 대한 심장 특이적 프로모터에 의해 구동되는 GFP와 같은 형광 트랜스제닉 마커 (단계 7.1에 기재된 바와 같음)를 스크리닝하여 비-형광 도입 유전자를 스크리닝한다.
- 형질전환 삽입에 양성인 배아가 성체 제브라피쉬 단계로 완전히 발달하도록 합니다.
- 잠재적인 형질전환 어류가 번식기에 도달하면 야생형 제브라피쉬로 번식시켜 생식계열 전파 및 형질전환 유전자 발현성 모두에 대해 개별적으로 선별합니다.
- 배아가 정상적으로 발달하고 가장 강력하고 적절한 이식유전자 발현을 제공하는 성인은 향후 작업 및 분석을 위해 고유한 형질전환 제브라피쉬 계통으로 유지됩니다.
참고: 형질전환 구조체의 게놈 삽입을 스크리닝하는 대체 접근 방식으로, 야생형 DNA가 아닌 형질전환 구조체만 증폭하는 PCR 프라이머를 설계합니다.
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Representative Results
형질전환 구축물을 생성하기 위해, 본 발명자들은 Tol2 형질전환 시스템을 사용하였다. 유전자 프로모터/인핸서 요소를 보유하는 p5E, 프로모터/인핸서 요소에 의해 발현되는 유전자를 보유하는 pME 및 최소한 polyA 테일을 보유하는 p3E를 포함한 3개의 진입 벡터를 사용하여 다중 사이트 게이트웨이 LR 클로닝을 통해 형질전환 구축물을 생성했습니다. 대상 벡터인 pDest는 제브라피쉬 배아에서 형질전환 구조체의 게놈 삽입을 위한 Tol2 반복을 제공하며 박테리아 성장에 필요한 모든 필수 유전 정보를 포함합니다(그림 1A). 이 원고의 목적을 위해 우리는 sox17:EGFPCAAX 형질전환 구조체를 만들고 주입했습니다. 내배엽 마커의 프로모터인 sox17은 제브라피쉬의 발달 중인 내배엽에서 막 표지 EGFP를 구동하는 데 사용되었습니다. 비형광단 단백질을 발현하는 형질전환 구조체의 경우, cmlc2:EGFP 와 같은 형광 형질전환 마커를 포함하는 pDest 벡터를 사용하여 게놈 삽입을 지원할 수 있습니다(그림 1A).
상기 프로토콜(표 2)에 기술된 값을 사용하여, sox17:EGFPCAAX 형질전환 구조체가 생성되었고, 이 구조체 중 4 μL가 화학적으로 유능 한 대장균 세포로 형질전환되었다. 하룻밤 동안 37°C에서 배양한 후, 한천 플레이트에는 약 250개의 콜로니가 포함되었습니다(LR 반응은 일반적으로 당사 실험실에서 플레이트당 평균 150-300개의 콜로니). 이들 콜로니의 스크리닝은 불투명도에 기초하여 수행되었다. 우리 손에서 투명한 콜로니는 올바른 sox17:EGFPCAAX 산물>85%의 시간을 가졌지만 불투명한 콜로니는 올바른 재조합 산물을 포함하지 않았습니다(그림 1B, 화살촉 대 화살표). 여러 콜로니로부터 플라스미드를 분리한 후, 재조합 생성물의 제한 소화를 제한 효소인 NcoI로 수행하였다. 두 개의 다른 투명한 콜로니와 하나의 불투명한 콜로니가 소화되었습니다. 두 투명 콜로니는 9,544 bp(소화 대조군으로 로드된 소화되지 않은 플라스미드)의 정확한 크기에서 단일 밴드를 가졌지만, 불투명한 콜로니에는 밴드가 전혀 없었습니다(그림 2A). 이러한 양성 sox17:EGFPCAAX 구축물을 재형질전환하고, 후속 콜로니를 다시 줄무늬로 만들고, 해당 콜로니가 플라스미드를 갖는 것으로 확인되었으며, -80°C 박테리아 냉동고 스톡이 생성되었습니다. sox17:EGFPCAAX 플라스미드와 캡핑-트랜스포사제 mRNA의 농도를 모두 측정하여 둘 다 주입에 사용할 수 있도록 했습니다(그림 2B).
배아는 하나의 세포 단계 배아를 예열된 배아 주입 주형에 넣어 주입을 위해 준비되었습니다(그림 3A-C). 사출 금형에 배치된 후 sox17:EGFPCAAX mRNA가 포함된 주사 바늘을 마이크로매니퓰레이터의 마이크로피펫 홀더에 배치했습니다(그림 3D,E). 배아에 100ng의 전이효소 mRNA, 150ng의 sox17:EGFPCAAX 플라스미드 및 페놀 레드(주사 추적 염료)를 주입했습니다. 3nL 볼루스(프로토콜, 단계 6.6에 설명된 대로 크기에 따라 결정됨)를 배아의 노른자가 아닌 세포체에 주입하여 최상의 통합 기회를 제공했습니다(그림 3F)10.
주입 후, 배아를 사출 주형으로부터 제거하고, 24 시간 동안 발달시켰다. 수정 후 24시간(hpf)에 배아를 EGFPCAAX의 내배엽 발현에 대해 스크리닝했습니다. 모자이크 내배엽 EGFPCAAX 발현은 주입된 배아의 ~75%에서 관찰되었습니다(그림 4A,A'). Gal4 또는 CreERT2와 같은 비형광 이식유전자가 주입된 배아를 스크리닝하기 위해 형질전환 마커(즉, cmlc2:EGFP)(그림 1A)도 포함하는 대상 벡터를 사용할 수 있습니다(그림 4B,B'). sox17:EGFPCAAX의 생식계열 형질전환이 있는 성체 제브라피쉬는 내배엽이 EGFPCAAX로 완전히 표지된 형광 배아를 생성했습니다(그림 4C).
새로 생성된 sox17:EGFPCAAX 형질전환 라인을 사용하여 내배엽 주머니 형성에 대한 에탄올의 영향을 직접 평가할 수 있었습니다. 파우치는 내배엽의 측면 가장자리에 형성되는 돌출부이며, 안면 골격 및 다중 장기 시스템의 형성에 중요하다(17). 뼈 형태형성 단백질(Bmp) 신호전달을 차단하면 주머니의 형성 저하가 발생한다는 것을 이전에 보여줬다18. 우리는 이제 10-18 hpf의 Bmp 돌연변이체의 에탄올 처리가 파우치 크기에 미묘하지만 중요한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 주머니 1-5(제브라피쉬는 6개의 주머니를 가지고 있지만 6번째 주머니는 아직 발달 단계에서 완전히 형성되지 않음)에서 각 주머니의 등쪽-복부 길이를 대조군 및 에탄올 처리된 야생형 Bmp 돌연변이 배아에서 측정했습니다(그림 5A). 에탄올 노출로 인한 일반적인 성장 영향에 대한 대조군으로서 전체 내배엽의 전후 길이를 측정했습니다(그림 5A). 내배엽의 전체 길이는 유전자형이나 치료에 의해 영향을 받지 않았습니다(그림 5B). 그러나, 파우치 1 및 3은 처리되지 않은 야생형 배아와 에탄올 처리된 야생형 배아 사이에서 파우치 길이의 유의한 증가를 보였지만, 처리되지 않은 Bmp 돌연변이체와 에탄올 처리된 Bmp 돌연변이체 사이에서는 길이가 유의하게 감소한 것으로 나타났다(그림 5C; 양방향 ANOVA; 파우치 1: NS(1,54) = 10.39, NS = 0.0021; 파우치 3: NS(1,54) = 12.70, NS = 0.0008)입니다. 파우치 2는 처리되지 않은 야생형 및 Bmp 돌연변이 그룹 사이에서 각각 파우치 크기의 현저한 증가를 보였다(도 5C; 양방향 ANOVA; NS(1,54) = 18.94, < 0.0001).
그림 1: 이식유전자 구축을 위한 LR 게이트웨이 반응. (A) 모듈식 4파트 LR 게이트웨이 클로닝 반응의 개략도. LR Clonase는 3개의 진입 벡터인 p5E, pME 및 p3E와 대상 벡터인 pDest를 매우 특이적인 반응으로 재결합하여 배아 주입에 적합한 새로운 형질전환 산물을 생성합니다. 비형광 형질전환 유전자를 스크리닝하기 위해 pDest 벡터는 선택적 형질전환 마커(예: cmlc2:EGFP)를 포함할 수 있습니다. (b) LR 재조합 생성물의 형질전환으로부터 얻어진 박테리아 콜로니의 예. 투명한 콜로니는 올바른 LR 재조합 산물>85%의 확률(화살촉)을 포함하는 반면, 불투명한 콜로니는 올바른 재조합 산물(화살촉)을 포함하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 플라스미드 DNA 및 트랜스포이즈아제 mRNA의 분석 . (A) LR 재조합 산물의 형질전환으로부터 3개의 콜로니의 진단적 소화. 단일 불투명 콜로니는 스크리닝할 플라스미드를 포함하지 않은 반면, 두 개의 투명한 콜로니는 9,544bp(절단되지 않은 대 절단되지 않은 것)에서 단일 밴드를 포함했습니다. (B) 1,950 bp에서 전이효소 mRNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Zebrafish 배아 주입 설정. (A) 사출 금형을 EM(3% v/v)으로 희석된 액체 아가로스에 넣습니다. (B) 일단 고형화되면, 주형은 아가로스 플레이트로부터 제거된다. (C) 배아는 사출 금형에 배열됩니다. (D,E) mRNA/플라스미드/페놀 레드 혼합물은 미세 조작기의 마이크로피펫 홀더에 배치된 주입 바늘에 피펫팅됩니다. (F) 3nL 볼루스를 1세포 단계에서 배아의 세포체에 주입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 형질전환 구조체를 주입한 제브라피쉬 스크리닝. (ᅡ,ᅡ') 24 hpf에서 이미지화된 배아의 컨포칼 이미지는 sox17:EGFPCAAX 이식유전자의 모자이크 발현을 보여줍니다. (비,비') 24 hpf에서 발달 중인 심장에서 cmlc2:EGFP의 형질전환 마커 발현. 배아의 측면도, 왼쪽은 앞쪽, 등쪽은 위쪽입니다. (C) 이식유전자를 운반하는 성체 제브라피쉬에서 생성된 배아의 컨포칼 이미지. 전체 내배엽은 EGFPCAAX를 발현하고 있습니다. 배아의 측면보기, 왼쪽은 앞쪽, 위쪽은 복부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 에탄올 처리된 야생형 및 Bmp 돌연변이 배아에서 파우치 측정. (A) 내배엽의 전체 길이와 파우치의 길이를 측정하는 개략도. (B) 전체 전후 내배엽 길이의 측정은 처리되지 않은 야생형과 에탄올 처리된 야생형 및 Bmp 돌연변이 배아 사이에 차이가 없음을 보여줍니다. (C) 등-복부 주머니 길이의 측정은 주머니 1과 3이 처리되지 않은 야생형 배아와 에탄올 처리된 야생형 배아 사이에서 주머니 길이가 증가하지만 처리되지 않은 Bmp 돌연변이와 에탄올 처리된 Bmp 돌연변이 사이에서는 길이가 감소함을 나타냅니다(양방향 ANOVA; 주머니 1: NS(1,54) = 10.39, NS = 0.0021; 주머니 3: NS(1,54) = 12.70, NS = 0.0008)입니다. 파우치 2는 미처리 및 에탄올 처리된 야생형 및 Bmp 돌연변이 그룹 사이의 길이의 증가를 나타낸다(two-way ANOVA; NS(1,54) = 18.94, NS < 0.0001). 파우치 4와 파우치 5 사이의 파우치 길이에는 차이가 관찰되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: Lovely Lab에 보관된 Tol2Kit 구성 요소. Lovely Lab에서 사용할 수 있는 모든 항목 및 대상 벡터, 설명 및 원본 실험실. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: LR 재조합 반응에서 각 벡터의 양 및 합집합도 계산. 각 벡터의 양은 크기(bp) 및 각 성분에 필요한 fmol로부터 계산되었다: 각 엔트리 벡터의 10 fmol 및 목적지 벡터의 20 fmol. 플라스미드 농도로부터, 각 벡터를 멸균수에 희석하여 LR 반응에 1 μL 이하를 첨가한다. 멸균수를 벡터 풀에 4μL와 동일하게 첨가하고, LR 반응 혼합물 1μL를 반응에 첨가하고, 25°C에서 밤새 배양합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 에탄올 노출이 발달 및 질병 상태에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다 7,8. 제브라피쉬는 반투명하고, 외부 수정되고, 유전적으로 다루기 쉬운 배아를 대량으로 생산하며, 이를 통해 여러 환경적 맥락에서 여러 이식유전자 표지 조직 및 세포 유형을 동시에 생생하게 이미징할 수 있다19,20. 이러한 강점은 인간과의 강력한 발달 유전 보존과 결합되어 제브라피쉬를 에탄올 7,8의 영향을 이미징하기 위한 강력한 모델 시스템으로 만듭니다. 여기에서 우리는 형질전환 구조물을 생성 및 주입하고 향후 에탄올 연구를 위해 형질전환 제브라피쉬 계통을 설정하기 위한 모듈식 접근 방식에 대한 프로토콜을 설명했습니다.
형질전환 제브라피쉬를 생성하기 위해 다양한 접근 방식이 확립되었습니다. 그러나 형질전환 구조체와 형질전환 계통을 모두 생성하는 것은 어려울 수 있습니다. 전통적인 서브클로닝 기술, BAC 클로닝 또는 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)와 같은 PCR 기반 접근법은 형질전환 구조체를 생성할 수 있지만, 처리량이 낮고 구조에서 다용성이 부족하다10. 또한 이러한 전략은 생성된 모든 형질전환 구조에 대해 재설계되어야 합니다. 하위 복제에는 필요한 모든 제한 부위가 존재하고 고유하다고 가정할 때 여러 번의 소화 및 결찰이 필요합니다. BAC 복제에는 여러 BAC 클론의 시퀀싱 및 테스트가 필요합니다. Gibson 어셈블리의 경우 각 형질전환 구조체에 대해 새로운 PCR 프라이머를 설계해야 합니다. 또한, 절단되지 않은 또는 선형화된 DNA의 주입은 낮은 생식계열 전달을 유도합니다21,22,23.
Tol2Kit은 게이트웨이 클로닝을 사용하여 트랜스포이즈 mRNA와 결합할 때 형질전환 및 생식계열 전달을 크게 증가시키는 Tol2 반복이 측면에 있는 완전한 형질전환 구조를 생성하는 모듈식 시스템입니다 10,11,24,25. 수십 개의 진입 및 목적지 벡터가 Kwan 연구실과 Cole Lab10,11에서 사용할 수 있습니다. 또한 Tol2Kit을 사용하는 제브라피쉬 실험실은 더 많은 진입 및 대상 벡터를 생성하고 선별했습니다. 사용 가능한 벡터의 폭을 예로 들자면, 70개 이상의 벡터를 풀링하여 사용했습니다(표 1). 이러한 모든 커뮤니티 리소스를 사용하면 LR 반응에서 선택한 벡터를 간단히 결합하여 수천 개의 서로 다른 형질전환 구조를 신속하게 생성할 수 있습니다.
최적의 LR 반응을 위해서는 플라스미드 크기와 농도의 정확한 계산이 필요합니다. 각 벡터에 대한 계산은 펨토몰(fmol) 값으로 수행되므로, 각 반응은 형질전환 구조체를 생성하기 위해 높은 플라스미드 부피를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 이 소량의 플라스미드는 희석과 적절한 피펫팅을 반응의 성공에 매우 중요하게 만든다10. LR 반응에 영향을 줄 수 있는 추가 요인은 서로 다른 진입 벡터의 삽입물 크기입니다. 예를 들어, 이 연구에 사용된 p5E-sox17 요소는 4kb 이상이며, 이는 동등하게 큰 pME 및 p3E 요소와 결합하면 매우 큰 형질전환 벡터가 됩니다. 박테리아의 큰 플라스미드는 배양하기 어려울 수 있으므로 박테리아 변형으로 인해 생성되는 콜로니의 수가 감소합니다. 이것은 또한 분리 시 성장이 느려지고 플라스미드 수준이 감소한다10. 중요하게도, 재조합 플라스미드의 형질전환 동안 박테리아 세포의 배양을 증가시킬 뿐만 아니라 매우 유능한 박테리아 세포를 갖는 것이 적절한 이식유전자 형성을 포착하기에 충분한 콜로니를 생성하는 데 중요합니다. 또한 올바른 LR 반응 효소( 재료 표에 나열됨)를 사용하는 것도 LR 반응의 성공에 중요한 역할을 합니다.
형질전환 구조와 박테리아 형질전환의 생성 외에도 배아 주입과 게놈 통합도 어려울 수 있습니다. 고품질 전이효소 mRNA의 생성은 게놈 통합의 빈도를 크게 증가시킨다10. 오래된 바늘은 모세관 작용을 잃을 수 있으므로(즉, 주입액이 바늘 끝으로 이동하지 못함) 배아를 주입하기 직전에 당겨진 모세혈관을 만들어야 합니다(그림 3E). ~3nL의 체액만 주입하기 위해 바늘 끝을 부러뜨리는 것과 세포체를 주입하는 것은 모두 연습이 필요합니다. 우리의 훈련 프로토콜은 바늘을 부러뜨리고 배아를 주입하는 것이 마스터될 때까지 페놀 레드 주사 염료만 세포체에 주입하는 것을 포함합니다. 세포체를 주입하면 게놈 통합 속도가 급격히 증가합니다10. 이 모든 것을 결합하면 평균 75% 이상의 게놈 삽입 및 모자이크 발현이 가능하지만 이는 구조마다 다를 수 있습니다.
게놈 삽입은 무작위일 수 있기 때문에 모자이크 발현을 보이는 모든 배아는 고유한 형질전환 삽입이며 지속적인 스크리닝이 필요합니다. 이러한 지속적인 스크리닝은 통합 부위가 배아의 발달에 해롭지 않고, 생식계열 전달이 발생하며, 이식유전자의 발현이 약화되거나 잠재적으로 침묵되지 않는다는 것을 보여주기 위해 필요합니다. 형질전환 라인이 확립되면 에탄올 연구에서 여러 분석에 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 비-형광 형질전환 구조체의 경우, 일반적으로 사용되는 형질전환 마커는 cmlc2:GFP 및 αcrystallin:RFP를 포함하며, 이는 각각 심장 및 망막을 표지하고, 지속적인 형질전환 스크리닝을 가능하게 한다. 스크리닝을 위한 형질전환 마커 외에도 이 두 형질전환 유전자는 에탄올이 심장 및 망막 발달에 미치는 영향을 직접 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내배엽 특이적 막 태그 EGFP 구조의 안정적인 생식계열 전달을 갖는 sox17:EGFPCAAX 형질전환 제브라피쉬 계통을 생성했습니다. 이 라인을 사용하여 에탄올에 민감한 Bmp 돌연변이 배아에서 내배엽 주머니 형성에 대한 에탄올의 영향을 측정할 수 있었습니다. 우리는 파우치 1-3의 크기, 파우치 4 및 5의 크기나 전체 내배엽 길이가 에탄올 처리된 Bmp 돌연변이체에서 영향을 받지 않는다는 것을 보여주었습니다(그림 5). 이 파일럿 작업은 Bmp-에탄올 상호 작용이 내배엽 형성, 특히 주머니 형성의 기초가 되는 세포 행동을 방해한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 에탄올 연구를 위한 형질전환 제브라피쉬 계통을 생성하는 유용성을 예시합니다. 결과적으로, 새로운 형질전환 계통을 만드는 것은 FASD에서 에탄올에 민감한 세포 과정과 조직 사건에 대한 우리의 이해를 크게 증가시킬 것입니다.
궁극적으로, 형질전환 제브라피쉬와 일반적으로 제브라피쉬는 FASD 7,8 연구에서 믿을 수 없을 정도로 강력한 것으로 입증되었습니다. Tol2Kit은 연구원들이 제브라피쉬에 주입할 준비가 된 여러 형질전환 구조물을 신속하게 생성할 수 있도록 하는 매우 다재다능한 툴킷입니다. 모듈식 설계와 새로운 진입 벡터 생성의 용이성은 구성 요소를 재설계할 필요 없이 형질전환 구조를 생성하는 데 극도의 유연성을 제공합니다. 전반적으로 이 툴킷은 제브라피쉬 연구와 FASD에 대한 이해 향상을 목표로 하는 일반적인 연구를 크게 향상시킬 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 기사에 제시된 연구는 국립 보건원/국립 알코올 남용 연구소(NIH/NIAAA) R00AA023560에서 CBL에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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