Summary
말라카이트 그린 분석 프로토콜은 열충격 단백질 90(Hsp90) 억제 인자 및 ATP 의존성 효소에 대한 기타 억제제 화합물을 발견하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다.
Abstract
열충격 단백질 90(Hsp90)은 여러 발암성 단백질에 대한 샤페로닝 효과로 인해 유망한 항암 표적입니다. Hsp90의 활성은 아데노신 삼인산(ATP)을 아데노신 이인산(ADP) 및 유리 인산염으로 가수분해하는 능력에 따라 다릅니다. Hsp90의 ATPase 활성은 보호자 기능과 관련이 있습니다. ATP는 Hsp90의 N-말단 도메인에 결합하고, 그 결합을 방해하는 것이 Hsp90 기능을 억제하는 가장 성공적인 전략인 것으로 밝혀졌습니다. ATPase 활성은 ATP 가수 분해에 의해 형성된 유리 인산염의 양을 결정하는 비색 말라카이트 그린 분석에 의해 측정 될 수있다. 여기서, 말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트를 사용하여 효모 Hsp90의 ATPase 활성을 결정하는 절차가 설명된다. 또한, 겔다나마이신을 진정한 억제제로 복용하여 Hsp90 억제제를 발견하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 효모 Hsp90에 대한 억제제 분자의 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 이 분석 프로토콜의 적용에 대해 논의합니다.
Introduction
열충격 단백질 90(Hsp90)은 암의 발병 및 진행을 담당하는 단백질의 안정성을 유지하는 분자 샤페론입니다. 또한, 항종양제에 대한 내성 발달을 담당하는 단백질도 Hsp90의 고객이다1. Hsp90은 전체 단백질의 2% 미만을 구성할 수 있는 정상 세포와 비교하여 모든 암세포 유형(세포 단백질의 >90%)에서 유비쿼터스로 과발현됩니다. 더욱이, 암세포의 Hsp90은 공동 샤페론과 복합체에 존재하는 반면, 정상 세포에서는 주로 자유롭고 복합체가 없는 상태로 존재합니다 2,3. 최근 몇 년 동안, 몇몇 Hsp90 억제제는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 세놀리틱 효과를 갖는 것으로 입증되었으며, 여기서 마우스의 수명을 크게 향상시켰습니다 4,5,6. 앞서 언급한 모든 발견은 Hsp90 억제제가 부작용이 적고 내성 발생 가능성이 감소하면서 여러 암 유형에 효과적일 수 있다는 사실을 입증합니다. Hsp90의 샤페로닝 기능은 Hsp90의 N-말단 도메인에서 ATP를 결합하고 이를 ADP와 유리 인산염7로 가수분해함으로써 달성됩니다. Hsp90의 ATP 결합 포켓에 경쟁적으로 결합하는 작은 분자는 단백질의 샤페로닝 효과를 성공적으로 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 현재까지, 이것은 Hsp90 억제를 위한 최선의 전략으로 남아 있으며, 이는 이러한 억제제가 임상 시험에 도달했다는 사실에 의해 뒷받침된다8. 그 중 하나인 Pimitespib은 2022년 6월 일본에서 위장관 기질 종양(GIST) 치료제로 승인되었습니다9. 이는 샤페론의 약물성이 1994년에 확립된 이후 승인된 최초의 Hsp90 억제제이다10.
말라카이트 그린 분석법은 무기 인산염의 검출을 위한 간단하고, 민감하며, 빠르고, 저렴한 절차로, 원하는 표적에 대한 화합물의 자동화 및 고처리량 스크리닝(HTS)에 적합하다11. 이 분석은 HTS 12,13,14,15,16,17뿐만 아니라 소규모 실험실 규모 설정에서 Hsp90 억제제의 스크리닝에 성공적으로 사용되었습니다. 이 분석은 Hsp90의 ATPase 활성으로 인해 형성된 유리 무기 인산염을 결정하는 비색법을 사용합니다. 이 정량화의 기초는 유리 인산염과 몰리브덴 사이에 인산염 분해 화합물이 형성되는 것이며, 이는 이후 말라카이트 그린과 반응하여 녹색을 생성합니다(그림 1). 이 빠른 색 형성은 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 600-660 nm18,19 사이에서 측정됩니다.
본 프로토콜에서, 효모 Hsp90을 이용한 말라카이트 그린 분석을 수행하는 절차 및 샤페론에 대한 억제제의 후속 확인이 기재되어 있다. Hsp90의 약물성이 처음으로 확립된 천연물 분자인 겔다나마이신(geldanamycin, GA)은 진정한 억제제로 간주되었다10. HTS는 테스트를 위해 많은 수의 분자를 사용할 수 있기 때문에 현재 약물 발견 프로그램의 필수적인 부분이 되었습니다. 이 기술은 Covid-19 감염 치료를 위한 약물의 용도 변경이 시급하기 때문에 지난 2년 동안 더 중요해졌습니다20,21. 따라서, 말라카이트 그린 분석법을 채택하여 효모 Hsp90 단백질에 대한 분자의 HTS에 대한 상세한 개요가 제시된다.
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Protocol
1. 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석
- 분석 완충액의 제조
- 표 1에 제시된 조성 및 제제에 따라 분석 완충액을 준비한다.
- 인산염 표준물질의 제조
- 말라카이트 그린 분석 포스페이트 분석 키트(4°C에서 보관)에 제공된 1 mM 포스페이트 표준물을 사용한다.
- 960 μL의 초순수에 40 μL의 1 mM 인산염 표준물질을 피펫으로 피펫하여 40 μM 인산염 용액(premix solution)을 얻었다. 제조업체의 지침에 따라 초순수로 프리믹스 용액을 첨가하여 0에서 40 μM까지 인산염의 연속 희석액을 형성합니다.
- 효모 Hsp90의 제조
- 글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 효모 Hsp90을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.
- 측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 블랭크와 양성 대조군 사이의 말라카이트 그린 시약 첨가 후 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1.0 미만인지 확인하십시오. 여기서, 블랭크(Hsp90 없음)와 양성대조군(Hsp90 포함)의 흡광도 차이는 0.510으로 나타났다.
- ATP의 제조
- ATP 1mg을 초순수 453.39μL가 들어 있는 바이알에 옮겨 4mM의 원액을 얻습니다. 무수 ATP(분자량[m.w.] = 551.14)를 기준으로 중량 계산을 수행합니다. ATP는 시간이 지남에 따라 자발적으로 가수분해될 수 있으므로 신선하게 준비하십시오.
- 4 μL의 ATP 저장 용액을 각 웰에 첨가하여 0.2 mM의 최종 웰 농도 (최종 총 분석 웰 부피 80 μL)를 수득하였다. 모든 반응이 동시에 시작되도록 멀티채널 피펫을 사용하여 ATP를 반응의 마지막 성분으로 추가합니다.
- 겔다나마이신(GA)의 제조
- 1 mg을 178.37 μL의 DMSO (m.w. = 560.64)에 용해시켜 GA의 10 mM 스톡을 준비한다. 원액을 사용하여 연속 희석하여 DMSO 중 4mM, 0.8mM, 0.16mM, 0.032mM, 0.0064mM 및 0.00128mM 용액을 준비합니다.
- 이들 저장 용액 2μL를 각 웰에 첨가하여 각각 0.1mM, 0.02mM, 0.004mM, 0.0008mM, 0.00016mM 및 0.000032mM의 최종 웰 농도를 얻습니다.
- 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같이 웰을 준비하고, 웰은 블랭크 (완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 (완충액 + 물 + DMSO 중 Hsp90)을 함유한다. GA(완충액 중 Hsp90 + 물 + GA)를 함유한 웰은 양성 대조군 역할을 합니다.
- 웰 플레이트 준비 및 첨가 순서
- 표 2에 제시된 레이아웃으로 96웰 플레이트를 준비합니다. 620nm에서 흡광도를 나타내는 화합물의 경우 이 파장에서 흡광도를 기록하기 위한 별도의 웰을 준비합니다. GA는 분석에 사용된 농도에 대해 620nm에서 흡광도를 나타내지 않으므로 GA에 대해 별도의 웰을 준비하지 마십시오.
- 표 3에 제시된 바와 같이 각 성분의 총 부피로 각 성분을 준비하십시오.
- 각 웰에 초순수를 추가하여 분석 웰을 설정합니다. 그런 다음 필요한 양의 분석 완충액과 복합 용액(예: GA 용액)을 추가합니다.
- 그런 다음 Hsp90을 적절한 웰에 넣고 실온에서 플레이트 셰이커에서 플레이트를 2분 동안 흔듭니다.
- 다중 채널 피펫을 사용하여 4 μL의 ATP 용액을 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 플레이트 셰이커(200rpm)에서 2분 동안 흔듭니다. 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.
- 말라카이트 그린 시약의 준비 및 첨가
- 말라카이트 그린 시약은 시약 A(3M HCl 중 몰리브덴산암모늄)와 B(말라카이트 그린 및 폴리비닐 알코올)로 구성됩니다. 사용하기 전에 시약을 실온에 두십시오. 시약 A와 B를 100:1 비율(1,000 μL:10 μL)로 혼합합니다. 불안정하고 3시간 후에 분해되기 시작하므로 사용하기 전에 3시간 이내에 준비하십시오.
- 1.6.5 단계의 3 시간 후, 다중 채널 피펫을 사용하여 ATP와 동일한 순서로 첨가 된 말라카이트 그린 시약 20 μL를 첨가하여 반응을 중지합니다.
- 상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더에서 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.
2. 말라카이트 그린 분석법에 의한 Hsp90 억제제의 고처리량 스크리닝
참고: 고처리량 스크리닝을 위한 프로토콜은 실험실 규모의 방법론과 유사합니다. 각 경우의 최종 웰 부피는 80μL입니다. 그러나, 시약의 첨가 순서에는 약간의 차이가 있다. 실험실 규모 기반 방법에는 5 단계의 용액 첨가 (물 34 μL, 완충액 32 μL, DMSO 중 화합물 2 μL, Hsp90 8 μL, 마지막으로 ATP 용액 4 μL)가 있습니다. 대조적으로, HTS의 경우 3 단계의 첨가가 있습니다 (효모 Hsp90을 함유 한 완충 용액 40 μL, 화합물을 함유 한 물 18 μL에 DMSO 2 μL, 마지막으로 물에 용해 된 ATP 20 μL). HTS 설정에서 정확하게 피펫팅할 수 있는 용액의 최소량은 20 μL입니다. 따라서 실험실 스케일과 HTS 스케일 간의 피펫팅 차이가 관찰됩니다.
- 분석 완충액(pH 7.4)의 제조
- HTS에서 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석과 동일한 완충액을 사용합니다(표 1).
- 효모 Hsp90의 제조
- 글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 단백질을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.
- 각 웰에 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하면 측정 가능한 ATPase 활성을 얻을 수 있습니다.
- 단백질(8 μL)을 각 웰의 완충액(32 μL)에 희석한다. 각 웰의 최종 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 40 μL입니다.
- 0.8 mM ATP의 제조
- ATP 1mg을 증류수 2,267μL에 용해시켜 0.8mM 용액을 얻습니다. 각 웰의 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 20 μL입니다.
- 겔다나마이신(GA)/시험 화합물의 제조
- 단계 1.5에서와 같이 DMSO에서 0.8 mM GA 스톡을 준비한다. GA 스톡 10μL를 물 90μL로 희석하여 최종 농도 80μM을 제공합니다.
- 적절한 분석 웰(최종 총 분석 웰 부피 = 80μL)에 80μM의 GA 용액 20μL를 사용하여 최종 웰 농도 20μM을 제공합니다. 이것은 양성 대조군 역할을 합니다.
- 테스트 화합물의 경우 평가를 위해 원하는 농도에 따라 DMSO에서 용액을 준비합니다.
- 블랭크(완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 웰(완충액 + 물 + DMSO의 Hsp90)에 추가하기 위해 물 90μL에 10μL의 DMSO를 준비합니다. 100 μM 최종 웰 농도에서 유사한 방식으로 시험 화합물을 준비한다.
- 분석 플레이트 설계 및 첨가 순서
- 4개의 메인 플레이트, 1개의 복합 플레이트 및 시약 스톡이 포함된 4개의 첨가 플레이트를 사용하여 분석을 설정합니다(그림 2 및 표 4).
- 또한, 플레이트 A, 90 μL의 분석 완충액을 각 웰에 첨가하고; 플레이트 B에 추가하여, 각 웰에 Hsp90을 갖는 90 μL의 완충액을 첨가하고; 플레이트 C 및 D에 추가하여, 각각 90 μL의 ATP 및 90 μL의 말라카이트 그린 시약을 각 웰에 첨가한다 (표 5 및 표 6).
- 첨가 플레이트 A와 플레이트 B에서 자동 멀티채널 분주 시스템을 사용하여 각 웰에서 각각 메인 플레이트 1과 2, 3과 4로 40μL의 용액을 옮깁니다. 여기서는 Biomek(R) FXP 실험실 자동화 워크스테이션을 사용했습니다(그림 2 및 표 6).
- 복합 플레이트의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.
- 첨가 플레이트 C(ATP)의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.
- 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 1.7단계에 따라 말라카이트 그린 시약을 준비합니다. 3시간 후, 말라카이트 그린 시약 20μL을 첨가 플레이트 D에서 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4의 웰로 옮깁니다(그림 2).
- 상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더로 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.
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Representative Results
분석의 결과는 유리 인산 이온 농도에 의한 흡광도 측면에서 해석됩니다. 620 nm에서 효모 Hsp90에 의한 ATP 가수 분해로 인한 유리 인산염에 의한 흡광도는 100 % ATPase 활성 또는 0 % 단백질 억제로 간주됩니다. 단백질의 억제는 ATP 가수 분해 (유리 인산염 감소)의 중단으로 이어진다. 이는 620nm에서 감소된 흡광도 측면에서 반영됩니다.
실험실 규모의 말라카이트 그린 분석 결과
인산염 표준물질에 대한 표준물질 그래프는 도 3에 묘사되어 있다. Hsp90의 활성은 ATP를 ADP 및 무기 인산염 (Pi)으로 가수 분해하는 능력으로 측정됩니다. 유리 인산염 농도가 높을수록 말라카이트 그린과의 복합체 형성이 증가하여 620nm에서 감지할 수 있는 강렬한 녹색이 생성됩니다(그림 4).
백분율 억제는 다음 방정식으로 계산됩니다.
% 억제 
Hsp90의 흡광도는 0% 억제(100% ATPase 활성)로 간주되었다. 백분율 ATPase 활성은 GA에 의한 단백질의 용량 의존적 억제를 측정하기 위해 사용된다. GA가 0.85 μM의IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 단백질을 억제하는 것으로 관찰되었다(그림 5 및 표 7).
그래프 작성 소프트웨어의 S 자 모양 곡선 접근법은 IC 50 값 (분자가 Hsp90 ATPase 활성의50 %를 나타내는 농도)을 결정하는 데 사용되었습니다.
말라카이트 그린 분석에 의한 Hsp90 억제제의 고처리량 스크리닝(HTS) 결과
HTS는 GA(20μM 최종 웰 농도)를 기준 표준으로 취하여 시험 화합물(코드 3 내지 96)을 이중으로 수행하였다. 화합물의 620nm에서의 흡광도는 알려지지 않았으므로 화합물 단독의 흡광도가 기록되었습니다(주판 1 및 2; 그림 6). 메인 플레이트 3 및 4의 각 웰에 대한 흡광도 값(Hsp90; 그림 7) 플레이트 1 및 2에서 상응하는 흡광도로부터 공제하였다 (화합물 단독). Hsp90의 흡광도는 100% ATPase 활성으로 간주되었다.
백분율 억제는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.
% 억제
20 μM GA 농도는 75.82% 억제를 나타냈다. 화합물 82의 100 μM은 효모 Hsp90 단백질의 100% 억제를 나타낸 반면, 화합물 6 및 95는 100 μM에서 각각 73.07% 및 62.88% 억제를 나타내었다(표 8). 다른 화합물은 100 μM에서 단백질을 50% 미만으로 억제하고 비활성인 것으로 간주되었습니다.
그림 1: 말라카이트 그린(MG) 시약의 반응. (A) 말라카이트 그린의 구조. (B) 말라카이트 그린 시약 A(3M HCl 중 몰리브덴산암모늄)와 Pi의 반응 및 시약 B(폴리비닐 알코올 중 말라카이트 그린)와의 후속 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HTS 프로토콜에 대한 실험 체계. 도면은 첨가 플레이트로부터 주 분석 플레이트에 시약을 첨가하는 순서를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 표준 인산염 농도에 대한 표준 플롯. X축은 마이크로몰 단위의 Pi 농도를 나타내고 Y축은 620nm에서의 흡광도를 나타냅니다. 오차 막대는 두 표본 번호 사이의 편차를 나타냅니다(n = 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 말라카이트 그린 시약 첨가 후 발색. 녹색은 높은 인산염 농도와 더 많은 ATPase 활성으로 더욱 강해집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 효모 Hsp90에 대한 겔다나마이신의 IC50 계산. 각 점은 두 결정의 평균입니다(n = 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 말라카이트 그린 시약 첨가 후 발색. (A) 메인 플레이트의 발색 1. A11 웰의 분홍색은 복합 색상 때문입니다. (B) 메인 플레이트의 발색 2. A11 웰의 분홍색은 화합물의 착색 특성 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 말라카이트 그린 시약 첨가 후 발색. 말라카이트 그린 시약 첨가 후 발색. (A) 메인 플레이트의 발색 3. (B) 메인 플레이트의 발색 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 원액 | 최종 결론. | 희석(최종/재고) | 100ml 육수에 필요한 양(희석 × 총 부피) |
| 1000mM 트리스-HCl, pH 7.4 | 200 밀리엠 | 0.2 | 20 밀리리터 |
| 1000 mM KCl | 40 밀리엠 | 0.04 | 4 밀리리터 |
| 1000 mM MgCl2 | 12 밀리엠 | 0.012 | 1.2 mL |
| 초순수 | 해당 없음 | 해당 없음 | 총 부피 100mL에 추가 |
표 1: 분석 완충액의 제조.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | 초순수 | 초순수 | 빈 | 빈 | |
| B | 4 마이크로미터 PB | 4 마이크로미터 PB | 음성 대조군 | 음성 대조군 | |
| C | 8 마이크로미터 PB | 8 마이크로미터 PB | GA(100μM) + Hsp90 | GA(100μM) + Hsp90 | |
| D | 12 마이크로미터 PB | 12 마이크로미터 PB | GA(20μM) + Hsp90 | GA(20μM) + Hsp90 | |
| E | 16 마이크로미터 PB | 16 마이크로미터 PB | GA(4μM) + Hsp90 | GA(4μM) + Hsp90 | |
| F | 24 마이크로미터 PB | 24 마이크로미터 PB | GA(0.8μM) + Hsp90 | GA(0.8μM) + Hsp90 | |
| G | 32 마이크로미터 PB | 32 마이크로미터 PB | GA(0.16μM) + Hsp90 | GA(0.16μM) + Hsp90 | |
| H | 40 마이크로미터 PB | 40 마이크로미터 PB | GA(0.032μM) + Hsp90 | GA(0.032μM) + Hsp90 | |
| 메모: 총 웰 부피는 80μL입니다. PB = 인산염 완충 표준물질. | |||||
표 2: 96웰 플레이트의 레이아웃.
| # | 빈 | 음성 대조군 | 효모 Hsp90 + GA |
| 분석 버퍼 | 40 마이크로리터 | 32 μL | 32 μL |
| 디엠소 | 2 마이크로리터 | 2 마이크로리터 | - |
| 조지아 | - | - | 2 마이크로리터 |
| HSP90 시리즈 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| 초순수 | 34 마이크로리터 | 34 마이크로리터 | 34 마이크로리터 |
| 총 볼륨 | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
표 3: 각 우물의 구성 성분.
| 플레이트 ID | 설명 |
| 1 | 화합물을 함유하는 메인 플레이트 |
| 2 | 화합물을 함유하는 메인 플레이트(플레이트 1의 복제본) |
| 3 | Hsp90 및 화합물이 있는 메인 플레이트 |
| 4 | Hsp90 및 화합물이 있는 메인 플레이트(플레이트 3의 중복) |
| 증권 시세 표시기 | 복합 용액 |
| A | 완충 용액 |
| B | Hsp90을 가진 완충액 |
| C | ATP 솔루션 |
| D | 말라카이트 녹색 시약 용액 |
| 참고: 모든 플레이트는 96웰 투명합니다. 메인 플레이트 : 최종 ATPase 반응이 일어나는 플레이트. 플레이트 CP, A, B, C 및 D는 특정 시약을 포함하는 첨가 플레이트입니다. | |
표 4: HTS 분석에 사용되는 플레이트의 유형.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 증권 시세 표시기 | A | B | C | D | ||
| 1:10 DMSO:물의 화합물/GA 용액 | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | 90 마이크로리터 | - | - | - | - | ||
| Hsp90 용액 : 완충액 (1 : 4) | - | - | 40 마이크로리터 | 40 마이크로리터 | - | - | 90 마이크로리터 | - | - | ||
| 완충 용액 | 40 마이크로리터 | 40 마이크로리터 | - | - | - | 90 마이크로리터 | - | - | - | ||
| ATP (0.8 밀리엠) | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | 20 마이크로리터 | - | - | - | 90 마이크로리터 | - | ||
| 말라카이트 그린 시약 | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 마이크로리터 | ||
| 총 볼륨 | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 마이크로리터 | 90 마이크로리터 | 90 마이크로리터 | 90 마이크로리터 | 90 마이크로리터 | ||
| 메모: GA = 젤다나마이신. 첨가 플레이트 CP, A, B, C 및 D의 경우, 용액을 메인 플레이트로 완벽하게 전달하기 위해 추가로 10μL를 사용합니다. | |||||||||||
표 5: HTS 프로토콜에서 각 웰의 구성성분.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | 조지아 | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| 참고: 3-96은 Hsp90 억제 가능성을 평가하기 위한 복합 코드입니다. GA = 젤다나마이신. W=초순수 | ||||||||||||
표 6: 메인 플레이트 1과 2(Hsp90 제외), 3과 4(Hsp90 포함)에 대해 웰 플레이트를 배치합니다.
| 잘 구성 | % ATPase 활성* | % 억제 |
| HSP90 시리즈 | 100 | 0.00 |
| GA(100μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 마이크로미터) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0.8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0.16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0.032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *두 개의 독립적인 결정의 평균 | ||
표 7: 겔다나마이신의 백분율 억제 및 ATPase 활성.
| 잘 구성 | 복근 (A) | 잘 구성 | 복근 (B) | 학사 | % ATPase 활성* | % 억제 |
| 빈 | 0.281 | 음성 대조군 | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 마이크로미터) | 0.295 | GA (20 μM) + Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| 화합물 6 (100 μM) | 0.3 | 화합물 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| 화합물 82 (100 μM) | 0.49 | 화합물 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| 화합물 95 (100 μM) | 0.327 | 화합물 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
표 8: 겔다나마이신 및 선택된 화합물의 백분율 억제 및 ATPase 활성.
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Discussion
Hsp90은 새로운 항암제 분자 발견의 중요한 표적입니다. 1994 년에 약물 성이 확립 된 이래10, 18 개의 분자가 임상 시험에 도달했습니다. 현재 7 개의 분자가 단독으로 또는22 개의 조합으로 다양한 임상 시험 단계에 있습니다. 이러한 모든 소분자는 N-말단 ATP 결합 억제제입니다. 샤페론을 억제하는 다른 수단(C-말단 억제제, 중간 도메인 억제제)은 N-말단 억제제만큼 빠르게 진행되지 않았습니다. 따라서 N-말단 ATP 결합 억제제 화합물은 여전히 임상적으로 시장성이 있는 분자로의 진행을 약속합니다. 또한 2022년 6월에 승인된 유일한 Hsp90 억제제(일본 GIST 치료용 Pimitespib)는 N-말단 ATP 결합 분자9입니다. 그러나 현재까지 단일 분자는 세계의 다른 지역에서 시장성있는 단계에 도달하지 못했습니다23,24. 이러한 실패의 주요 원인은 제형 문제, 이독성과 같은 독성 외에 분자 생산 비용, 소수의 화합물과 관련된 심장 독성을 포함하여 몇 가지 주요 원인이 있습니다. 이러한 부작용을 극복하기 위해 Hsp90 N-말단 선택적 억제제(알파 및 베타)가 현재 연구되고 있습니다25,26,27. 앞서 언급한 모든 논의는 ATP 결합 틈새에 결합하여 Hsp90 활성을 억제하는 화합물의 HTS 스크리닝을 보증합니다.
약물 발견을 위한 분석은 빠르고, 비용 효율적이며, 민감하고, 쉽게 재현할 수 있어야 하며, 덜 위험한 화학 물질 및/또는 조건을 활용해야 합니다. 또한 실험실 규모와 HTS 설정에서 편리하게 수행해야 합니다. 이용 가능한 Hsp90 ATPase 억제 분석에 대한 상세한 분석이 수행되었으며, 말라카이트 그린 포스페이트 분석이 주어진 기관 설정에서 가장 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 다른 분석 시스템은 HTS 시스템(피루브산/젖산 탈수소효소 결합 효소)에서 자동화 친화적이지 않았습니다.28,29; 형광 편광 분석(30), 섬광 근접 분석, 표면 플라즈몬 공명 분석, 및 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)과 같이 고가입니다(28,29); (TR-FRET)28,29와 같이 시간이 많이 걸립니다. 또는 섬광 근접 분석28,29와 같은 방사선 위험을 가지고 있습니다. 따라서 새로운 Hsp90 N-말단 ATP 결합 억제제를 식별하기 위한 실험실 규모 또는 HTS와 같은 간단한 말라카이트 그린 분석이 이 프로토콜에 제시됩니다.
이 분석의 주요 관심사는 인산염 이온으로 평가할 완충액 및 식물 추출물의 오염으로 잘못된 결과를 초래할 수 있다는 것입니다. 반응 pH에서 ATP의 비효소적 가수분해는 또한 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다. 앞서 언급한 문제는 무인산염 완충액(pH 7.4)을 사용하여 해결되었습니다. 추가적으로, 완충액 + 물 + DMSO로 블랭크를 수행하고, 그 후 블랭크 값으로부터 양성 대조군/샘플 화합물의 흡광도 값을 뺀다. 이 분석 절차에서 따라야 할 예방 조치는 다중 채널 피펫을 통해 각 웰에 ATP를 동시에 추가하는 것과 같이 시약 추가를 엄격하게 준수하는 것입니다. 이는 모든 웰에서 동일한 시간, 동일한 배양 시간, 그리고 그 후 말라카이트 그린 시약을 첨가한 후 동일한 흡광도를 측정하여 반응이 시작되도록 하기 위함이다. ATPase 반응은 시간에 매우 민감하므로 반응 시작 및 종료 시간, 배양 시간 및 흡광도 기록 시간의 약간의 변화는 분석 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 34% 시트르산나트륨 용액(ATPase 반응 담금질에 사용됨) 10μL의 첨가는 표준 곡선의 선형성에 영향을 미치므로 당사의 분석 프로토콜에 포함되지 않았습니다.
이 분석의 유일한 한계는 620 nm에서 효모 Hsp90에 의해 ATP로부터 방출 된 유리 인산염에 의해 나타난 것보다 더 높은 흡광도를 나타내는 화합물의 평가이다. 위양성 또는 위음성은 이러한 화합물의 경우에 발생할 수 있습니다. 그러나 그러한 화합물을 만날 가능성은 매우 드뭅니다. 이는 특히 화합물 혼합물이 존재하는 식물 추출물 및/또는 그 분획의 평가에서 문제가 될 수 있습니다.
결론적으로, 실험실 규모에서 HTS로의 스케일 업은 효모 Hsp90으로 성공적으로 수행되었습니다. 실험실 규모 및 HTS의 단계적 분석 프로토콜은 전 세계 과학자들이 새로운 Hsp90 억제제를 발견하기 위해 이 절차를 채택하는 데 도움이 될 것입니다. 추가적으로, 상기 프로토콜은 Hsp70, Grp94, 론 프로테아제, 프로테아제 Ti, AAA 프로테아제 등과 같은 다른 ATP 의존성 단백질에 대한 ATPase 억제제의 발견을 위해 적응될 수 있다31,32,33.
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Disclosures
경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
본 연구는 한국연구재단(NRF)의 박사후 연구원인 한국연구연구원(KRF) 프로그램의 지원을 받아 과학기술정보통신부(NRF-2019H1D3A1A01102952)의 지원을 받았다. 저자들은 이 프로젝트에 재정 지원을 해준 KIST 교내 보조금과 해양수산부 보조금 번호 2MRB130에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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