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Biochemistry

हीट-शॉक प्रोटीन 90 इनहिबिटर की खोज के लिए मैलाकाइट ग्रीन परख

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64693
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

Summary

मैलाकाइट ग्रीन परख प्रोटोकॉल हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) सप्रेसर्स, साथ ही एटीपी-निर्भर एंजाइमों के खिलाफ अन्य अवरोधक यौगिकों की खोज के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है।

Abstract

हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) एक आशाजनक एंटीकैंसर लक्ष्य है क्योंकि कई ऑन्कोजेनिक प्रोटीन पर इसका चैपरोनिंग प्रभाव होता है। एचएसपी 90 की गतिविधि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) को एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) और मुक्त फॉस्फेट को हाइड्रोलाइज करने की क्षमता पर निर्भर है। एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि इसके चैपरोनिंग फ़ंक्शन से जुड़ी हुई है; एटीपी एचएसपी 90 के एन-टर्मिनल डोमेन को बांधता है, और इसके बंधन को बाधित करना एचएसपी 90 फ़ंक्शन को दबाने में सबसे सफल रणनीति पाई गई। एटीपीस गतिविधि को एक कलरिमेट्रिक मैलाकाइट ग्रीन परख द्वारा मापा जा सकता है, जो एटीपी हाइड्रोलिसिस द्वारा गठित मुक्त फॉस्फेट की मात्रा निर्धारित करता है। यहां, मैलाकाइट ग्रीन फॉस्फेट परख किट का उपयोग करके खमीर एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि को निर्धारित करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, एक प्रामाणिक अवरोधक के रूप में गेल्डानामाइसिन लेने से एचएसपी 90 अवरोधकों की खोज के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान किए गए हैं। अंत में, खमीर एचएसपी 90 के खिलाफ अवरोधक अणुओं के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के माध्यम से इस परख प्रोटोकॉल के आवेदन पर चर्चा की गई है।

Introduction

हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) एक आणविक चैपरोन है जो कैंसर के विकास और प्रगति के लिए जिम्मेदार प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखता है। इसके अलावा, एंटीनोप्लास्टिक एजेंटों के प्रतिरोध के विकास के लिए जिम्मेदार प्रोटीन भी एचएसपी 901 के ग्राहक हैं। सामान्य कोशिकाओं की तुलना में सभी कैंसर सेल प्रकारों (>90% सेलुलर प्रोटीन) में एचएसपी 90 सर्वव्यापी रूप से अतिरंजित होता है, जहां यह कुल प्रोटीन के 2% से कम हो सकता है। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं का एचएसपी 90 सह-चैपरोन के साथ एक परिसर में रहता है, जबकि एक सामान्य कोशिका में यह मुख्य रूप से एक मुक्त, गैर-जटिल अवस्था 2,3 में मौजूद होता है। हाल के वर्षों में, कई एचएसपी 90 अवरोधकों को इन विट्रो और विवो अध्ययनों में सेनोलिटिक प्रभाव रखने के लिए प्रदर्शित किया गया है, जहां उन्होंने चूहों के जीवन काल 4,5,6 में काफी सुधार किया है। उपरोक्त सभी निष्कर्ष इस तथ्य को प्रमाणित करते हैं कि एचएसपी 90 अवरोधक कई कैंसर प्रकारों में प्रभावी हो सकते हैं, कम प्रतिकूल प्रभाव और प्रतिरोध विकसित करने की संभावना कम हो सकती है। एचएसपी 90 के चैपरोनिंग फ़ंक्शन को एचएसपी 90 के एन-टर्मिनल डोमेन पर एटीपी को बांधकर और इसे एडीपी और फ्री फॉस्फेट7 में हाइड्रोलाइज करके पूरा किया जाता है। एचएसपी 90 के एटीपी बाइंडिंग पॉकेट से प्रतिस्पर्धात्मक रूप से जुड़ने वाले छोटे अणु प्रोटीन के चैपरोनिंग प्रभाव को सफलतापूर्वक दबाने के लिए पाए गए। आज तक, यह एचएसपी 90 निषेध के लिए सबसे अच्छी रणनीति बनी हुई है, जो इस तथ्य से समर्थित है कि ऐसे अवरोधक नैदानिक परीक्षणों8 तक पहुंच गए हैं। उनमें से एक, पिमिट्सपिब, जून 2022 9 में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) के इलाज के लिए जापान में अनुमोदितकिया गया था। यह पहला एचएसपी 90 अवरोधक है जिसे 199410 में चैपरोन की दवा की स्थापना के बाद से अनुमोदित किया गया था।

मैलाकाइट ग्रीन परख अकार्बनिक फॉस्फेट का पता लगाने के लिए एक सरल, संवेदनशील, तेज और सस्ती प्रक्रिया है, जो स्वचालन और यौगिकों के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए उपयुक्तहै। परख को छोटे प्रयोगशाला-पैमाने के सेटअपों में एचएसपी 90 अवरोधकों की स्क्रीनिंग के साथ-साथ एचटीएस12,13,14,15,16,17 में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। परख एक रंगीन विधि का उपयोग करती है जो एचएसपी 90 की एटीपीस गतिविधि के कारण गठित मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट को निर्धारित करती है। इस परिमाणीकरण का आधार मुक्त फॉस्फेट और मोलिब्डेनम के बीच एक फॉस्फोमोलिबिट कॉम्प्लेक्स का गठन है, जो बाद में हरे रंग को उत्पन्न करने के लिए मैलाकाइट हरे रंग के साथ प्रतिक्रिया करता है (चित्रा 1)। इस तेजी से रंग गठन को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, या प्लेट रीडर पर 600-660 एनएम18,19 के बीच मापा जाता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, खमीर एचएसपी 90 के साथ एक मैलाकाइट ग्रीन परख करने और चैपरोन के खिलाफ अवरोधकों की बाद की पहचान करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। प्राकृतिक उत्पाद अणु, गेल्डामाइसिन (जीए), जिसके साथ एचएसपी 90 की दवा पहली बार स्थापित की गई थी, को एक प्रामाणिक अवरोधक10 के रूप में लिया गया था। एचटीएस परीक्षण के लिए बड़ी संख्या में अणुओं की उपलब्धता के कारण वर्तमान दवा खोज कार्यक्रम का एक अभिन्न अंग बन गया है। इस तकनीक ने पिछले 2 वर्षों में अधिक महत्व प्राप्त किया है क्योंकि कोविद -19 संक्रमण20,21 के इलाज के लिए दवाओं को पुन: तैयार करने की तत्काल आवश्यकता है। इसलिए, मैलाकाइट ग्रीन परख विधि को अपनाकर खमीर एचएसपी 90 प्रोटीन के खिलाफ अणुओं के एचटीएस के लिए एक विस्तृत रूपरेखा प्रस्तुत की गई है।

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Protocol

1. लैब-स्केल मैलाकाइट ग्रीन परख

  1. परख बफर की तैयारी
    1. तालिका 1 में प्रस्तुत संरचना और तैयारी के अनुसार परख बफर तैयार करें।
  2. फॉस्फेट मानकों की तैयारी
    1. मैलाकाइट ग्रीन परख फॉस्फेट परख किट (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) में प्रदान किए गए 1 एमएम फॉस्फेट मानक का उपयोग करें।
    2. 40 μM फॉस्फेट समाधान (प्रीमिक्स समाधान) प्राप्त करने के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 960 μL में 1 mM फॉस्फेट मानक का 40 μL। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ प्रीमिक्स घोल जोड़ें, ताकि 0 से 40 μM तक फॉस्फेट का एक सीरियल कमजोर पड़ जाए।
  3. खमीर Hsp90 की तैयारी
    1. 0.66 मिलीग्राम / एमएल की ग्लिसरॉल स्टॉक एकाग्रता के साथ खमीर एचएसपी 90 का उपयोग करें। उपयोग से ठीक पहले बर्फ पर पिघलें।
    2. मापनीय एटीपीस गतिविधि के लिए खमीर एचएसपी 90 के 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) का उपयोग करें। जांचें कि खाली और सकारात्मक नियंत्रण के बीच मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक को जोड़ने के बाद ऑप्टिकल घनत्व अंतर कम से कम 0.5 और 1.0 से कम है। यहां, रिक्त (एचएसपी 90 के बिना) और सकारात्मक नियंत्रण (एचएसपी 90 के साथ) के बीच अवशोषण अंतर 0.510 पाया गया।
  4. एटीपी की तैयारी
    1. 4 mM स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 1 मिलीग्राम एटीपी को 453.39 μL अल्ट्रा-शुद्ध पानी वाली शीशी में स्थानांतरित करें। निर्जल एटीपी (आणविक भार [एम.डब्ल्यू.] = 551.14) के आधार पर वजन गणना करें। एटीपी को ताजा तैयार करें, क्योंकि यह समय के साथ अनायास हाइड्रोलाइज कर सकता है।
    2. 0.2 mM (80 μL की अंतिम कुल परख अच्छी मात्रा) देने के लिए प्रत्येक कुएं में एटीपी स्टॉक समाधान का 4 μL जोड़ें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रतिक्रिया के अंतिम घटक के रूप में एटीपी जोड़ें ताकि सभी प्रतिक्रियाएं एक साथ शुरू हों।
  5. गेल्डामाइसिन (जीए) की तैयारी
    1. डीएमएसओ के 178.37 μL (m.w. = 560.64) में 1 मिलीग्राम को भंग करके जीए का 10 mM स्टॉक तैयार करें। स्टॉक समाधान का उपयोग करके, सीरियल कमजोर पड़ने से डीएमएसओ में 4 एमएम, 0.8 एमएम, 0.16 एमएम, 0.032 एमएम, 0.0064 एमएम और 0.00128 एमएम समाधान तैयार करें।
    2. क्रमशः 0.1 mM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM, और 0.000032 mM की अंतिम अच्छी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में इन स्टॉक समाधानों का 2 μL जोड़ें।
    3. तालिका 2 और तालिका 3 में वर्णित कुओं को खाली (बफर + पानी + डीएमएसओ) और नकारात्मक नियंत्रण (बफर + पानी + डीएमएसओ में एचएसपी 90) युक्त कुओं के साथ तैयार करें। जीए युक्त कुएं (बफर + पानी + जीए में एचएसपी 90) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
  6. अच्छी प्लेटों की तैयारी और जोड़ने का क्रम
    1. तालिका 2 में प्रस्तुत लेआउट के साथ 96-वेल प्लेटें तैयार करें। 620 एनएम पर अवशोषण दिखाने वाले यौगिकों के लिए, इस तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को रिकॉर्ड करने के लिए एक अलग कुआं तैयार करें। जीए के लिए एक अलग कुआं तैयार न करें, क्योंकि जीए परख में उपयोग की जाने वाली एकाग्रता के लिए 620 एनएम पर अवशोषण नहीं दिखाता है।
    2. प्रत्येक घटक को प्रत्येक घटक की कुल मात्रा के साथ तैयार करें, जैसा कि तालिका 3 में प्रस्तुत किया गया है।
    3. प्रत्येक कुएं में अल्ट्रा-शुद्ध पानी जोड़कर परख कुएं स्थापित करें। इसके बाद, परख बफर और एक यौगिक समाधान (उदाहरण के लिए, जीए समाधान) की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    4. फिर, उपयुक्त कुओं में एचएसपी 90 जोड़ें, और कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर पर 2 मिनट के लिए प्लेटों को हिलाएं।
    5. मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके एटीपी समाधान के 4 μL जोड़ें। प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें और कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर (200 आरपीएम) पर 2 मिनट के लिए हिलाएं। प्लेट को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. मैलाकाइट हरे अभिकर्मक की तैयारी और जोड़
    1. मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक में अभिकर्मक ए (3 एम एचसीएल में अमोनियम मोलिब्डेट) और बी (मैलाकाइट ग्रीन और पॉलीविनाइल अल्कोहल) होते हैं। उपयोग करने से पहले अभिकर्मक को कमरे के तापमान पर लाएं। अभिकर्मकों A और B को 100: 1 अनुपात (1,000 μL: 10 μL) पर मिलाएं। उपयोग से पहले 3 घंटे के भीतर इसे तैयार करें, क्योंकि यह अस्थिर है और 3 घंटे के बाद विघटित होना शुरू हो जाता है।
    2. चरण 1.6.5 के 3 घंटे के बाद, मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके एटीपी के समान क्रम में जोड़े गए 20 μL मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक को जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
    3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट रीडर में 620 एनएम पर प्लेट के अवशोषण को मापें।

2. मैलाकाइट ग्रीन परख द्वारा एचएसपी 90 अवरोधकों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

नोट: उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला-पैमाने पर पद्धति के समान है। प्रत्येक मामले में अंतिम अच्छी तरह से मात्रा 80 μL है। हालांकि, अभिकर्मकों के अतिरिक्त के क्रम में थोड़ा अंतर है। प्रयोगशाला-पैमाने पर आधारित विधि में, समाधान जोड़ने के पांच चरण हैं (34 μL पानी, 32 μL बफर, DMSO में 2 μL यौगिक, Hsp90 का 8 μL, और अंत में एटीपी समाधान का 4 μL)। इसके विपरीत, एचटीएस के साथ जोड़ने के तीन चरण होते हैं (खमीर एचएसपी 90 युक्त बफर घोल का 40 μL, यौगिकों वाले पानी के 18 μL में DMSO का 2 μL, और अंत में पानी में घुलने वाले एटीपी का 20 μL)। HTS सेटअप में सटीक रूप से पाइप किए जा सकने वाले समाधान की न्यूनतम मात्रा 20 μL है। इसलिए, प्रयोगशाला और HTS तराजू के बीच पाइपिंग में अंतर देखा जाता है।

  1. परख बफर की तैयारी (पीएच 7.4)
    1. एचटीएस में लैब-स्केल मैलाकाइट ग्रीन परख (तालिका 1) के लिए उसी बफर का उपयोग करें।
  2. खमीर Hsp90 की तैयारी
    1. 0.66 मिलीग्राम / एमएल की ग्लिसरॉल स्टॉक एकाग्रता के साथ प्रोटीन का उपयोग करें। उपयोग से ठीक पहले बर्फ पर पिघलें।
    2. प्रत्येक कुएं में खमीर एचएसपी 90 के 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) का उपयोग करें, जो औसत दर्जे की एटीपीस गतिविधि प्रदान करता है।
    3. प्रत्येक कुएं के लिए बफर (32 μL) में प्रोटीन (8 μL) को पतला करें। प्रत्येक कुएं के लिए अंतिम कुल कार्य मात्रा 80 μL की कुल परख मात्रा में 40 μL है।
  3. 0.8 mM ATP की तैयारी
    1. 0.8 एमएम समाधान प्राप्त करने के लिए आसुत जल के 2,267 μL में 1 मिलीग्राम एटीपी घोलें। प्रत्येक कुएं के लिए कुल कार्य मात्रा 80 μL की कुल परख मात्रा में 20 μL है।
  4. परीक्षण यौगिकों की तैयारी जेलडामाइसिन (जीए) /
    1. चरण 1.5 के अनुसार, डीएमएसओ में जीए का 0.8 एमएम स्टॉक तैयार करें। 80 μM की अंतिम सांद्रता देने के लिए 90 μL पानी के साथ GA स्टॉक के 10 μL को पतला करें।
    2. उपयुक्त परख कुओं में 80 μM GA समाधान के 20 μL का उपयोग करें (अंतिम कुल परख अच्छी मात्रा = 80 μL), जिससे 20 μM की अंतिम अच्छी एकाग्रता मिलती है। यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
    3. परीक्षण यौगिकों के लिए, मूल्यांकन के लिए उनकी वांछित एकाग्रता के अनुसार डीएमएसओ में समाधान तैयार करें।
    4. खाली (बफर + पानी + डीएमएसओ) और नकारात्मक नियंत्रण कुओं (बफर + पानी + डीएमएसओ में एचएसपी 90) के अलावा 90 μL पानी में 10 μL DMSO तैयार करें। परीक्षण यौगिकों को 100 μM अंतिम अच्छी एकाग्रता पर एक समान तरीके से तैयार करें।
  5. परख प्लेटों का डिजाइन और अतिरिक्त का क्रम
    1. परख स्थापित करने के लिए चार मुख्य प्लेटों, एक यौगिक प्लेट, और अभिकर्मकों के स्टॉक वाले चार अतिरिक्त प्लेटों का उपयोग करें (चित्रा 2 और तालिका 4)।
    2. इसके अलावा, प्लेट ए, प्रत्येक कुएं में परख बफर के 90 μL जोड़ें; इसके अलावा प्लेट बी, प्रत्येक कुएं में एचएसपी 90 के साथ बफर के 90 μL जोड़ें; प्लेट C और D के अलावा, प्रत्येक कुएं में क्रमशः 90 μL ATP और 90 μL मैलाकाइट हरे अभिकर्मक जोड़ें (तालिका 5 और तालिका 6)।
    3. अतिरिक्त प्लेट ए और प्लेट बी से, स्वचालित मल्टीचैनल डिस्पेंसिंग सिस्टम का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं से क्रमशः मुख्य प्लेट 1 और 2, और 3 और 4 में 40 μL घोल स्थानांतरित करें। यहां, बायोमेक (आर) एफएक्सपी प्रयोगशाला स्वचालन वर्कस्टेशन का उपयोग किया गया था (चित्रा 2 और तालिका 6)।
    4. यौगिक प्लेट के प्रत्येक कुएं से, घोल के 20 μL को मुख्य प्लेटों 1, 2, 3 और 4 में स्थानांतरित करें (चित्रा 2)। एक शेकर (200 आरपीएम) में 1 मिनट के लिए प्लेटों को हिलाएं।
    5. अतिरिक्त प्लेट सी (एटीपी) के प्रत्येक कुएं से, मुख्य प्लेटों 1, 2, 3 और 4 में 20 μL समाधान स्थानांतरित करें (चित्रा 2)। एक शेकर (200 आरपीएम) में 1 मिनट के लिए प्लेटों को हिलाएं।
    6. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. चरण 1.7 के अनुसार मैलाकाइट हरा अभिकर्मक तैयार करें। 3 घंटे के बाद, अतिरिक्त प्लेट डी से 20 μL मैलाकाइट हरे अभिकर्मक को मुख्य प्लेट 1, 2, 3 और 4 के कुओं में स्थानांतरित करें (चित्र 2)।
    8. कमरे के तापमान पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट रीडर में प्लेट का अवशोषण 620 एनएम पर मापें।

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Representative Results

परख के परिणामों की व्याख्या मुक्त फॉस्फेट आयन एकाग्रता के कारण अवशोषण के संदर्भ में की जाती है। 620 एनएम पर खमीर एचएसपी 90 द्वारा एटीपी हाइड्रोलिसिस के कारण मुक्त फॉस्फेट द्वारा अवशोषण को 100% एटीपीस गतिविधि, या शून्य प्रतिशत प्रोटीन निषेध माना जाता है। प्रोटीन का निषेध एटीपी हाइड्रोलिसिस (कम मुक्त फॉस्फेट) की समाप्ति की ओर जाता है। जो 620 एनएम पर कम अवशोषण के संदर्भ में परिलक्षित होता है।

लैब-स्केल मैलाकाइट ग्रीन परख के परिणाम
फॉस्फेट मानक के लिए मानक ग्राफ चित्रा 3 में दर्शाया गया है। एचएसपी 90 की गतिविधि को एटीपी को एडीपी और अकार्बनिक फॉस्फेट (पीआई) में हाइड्रोलाइज करने की क्षमता के संदर्भ में मापा जाता है। एक उच्च मुक्त फॉस्फेट एकाग्रता से मैलाकाइट हरे रंग के साथ जटिल गठन में वृद्धि होती है, जो 620 एनएम (चित्रा 4) पर एक तीव्र हरे रंग का पता लगाने योग्य होती है।

प्रतिशत अवरोध की गणना निम्नलिखित समीकरण द्वारा की जाती है:

% निषेध Equation 1

Equation 2

एचएसपी 90 के अवशोषण को शून्य प्रतिशत निषेध (100% एटीपीस गतिविधि) के रूप में माना जाता था। प्रतिशत एटीपीस गतिविधि का उपयोग जीए द्वारा प्रोटीन के खुराक-निर्भर अवरोध को मापने के लिए किया जाता है। यह देखा गया कि जीए ने प्रोटीन को खुराक पर निर्भर तरीके से रोक दिया, जिसमेंआईसी 50 मान 0.85 μM (चित्रा 5 और तालिका 7) था।

ग्राफ़िंग सॉफ्टवेयर के सिग्मोइडल वक्र दृष्टिकोण का उपयोग आईसी 50 मान (एकाग्रता जिस पर अणु एचएसपी90 एटीपीस गतिविधि का 50% प्रदर्शित करते हैं) निर्धारित करने के लिए किया गया था।

मैलाकाइट ग्रीन परख द्वारा एचएसपी 90 अवरोधकों के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के परिणाम
एचटीएस को संदर्भ मानक के रूप में जीए (20 μM अंतिम अच्छी एकाग्रता) लेकर डुप्लिकेट में परीक्षण यौगिकों (कोड 3 से 96) के साथ किया गया था। यौगिकों के 620 एनएम पर अवशोषण ज्ञात नहीं था और इसलिए अकेले यौगिकों का अवशोषण दर्ज किया गया था (मुख्य प्लेट 1 और 2; चित्र 6)। मुख्य प्लेटों 3 और 4 के प्रत्येक कुएं के लिए अवशोषण मूल्य (एचएसपी 90 के साथ; चित्र 7) प्लेट 1 और 2 (अकेले यौगिक) में संबंधित अवशोषण से कटौती की गई थी। एचएसपी 90 के अवशोषण को 100% एटीपीस गतिविधि माना जाता था।

प्रतिशत अवरोध की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की गई थी:

% निषेध Equation 3

Equation 4

20 μM GA एकाग्रता ने 75.82% अवरोध का प्रदर्शन किया। यौगिक 82 के 100 μM ने खमीर Hsp90 प्रोटीन का 100% अवरोध दिखाया, जबकि यौगिक 6 और 95 ने क्रमशः 73.07% और 62.88% अवरोध प्रदर्शित किया, 100 μM पर (तालिका 8)। अन्य यौगिकों ने प्रोटीन को 100 μM पर 50% से कम दबा दिया और निष्क्रिय माना गया।

Figure 1
चित्र 1: मैलाकाइट ग्रीन (एमजी) अभिकर्मक की प्रतिक्रियाएं। (ए) मैलाकाइट हरे रंग की संरचना। (बी) पाई के साथ मैलाकाइट ग्रीन अभिकर्मक ए (3 एम एचसीएल में अमोनियम मोलिब्डेट) की प्रतिक्रियाएं, और अभिकर्मक बी (पॉलीविनाइल अल्कोहल में मैलाकाइट ग्रीन) के साथ बाद की प्रतिक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एचटीएस प्रोटोकॉल के लिए प्रायोगिक योजना। आंकड़ा अतिरिक्त प्लेटों से मुख्य परख प्लेट में अभिकर्मकों को जोड़ने के क्रम को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मानक फॉस्फेट एकाग्रता के लिए मानक भूखंड। एक्स-अक्ष माइक्रोमोलर में पाई एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-अक्ष पर 620 एनएम पर अवशोषण को दर्शाया गया है। त्रुटि पट्टियाँ दो नमूना संख्याओं (n = 2) के बीच विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मैलाकाइट हरे अभिकर्मक के अतिरिक्त रंग विकास। उच्च फॉस्फेट एकाग्रता और अधिक एटीपीस गतिविधि के साथ हरा रंग अधिक तीव्र हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: खमीर एचएसपी90 के खिलाफ गेल्डामाइसिन के लिए आईसी 50 गणना। प्रत्येक बिंदु दो निर्धारणों (एन = 2) का औसत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: मैलाकाइट हरे अभिकर्मक को जोड़ने के बाद रंग विकास। (A) मुख्य प्लेट 1 में रंग विकास। ए 11 कुएं में गुलाबी रंग यौगिक रंग के कारण है। (बी) मुख्य प्लेट 2 में रंग विकास। ए 11 कुएं में गुलाबी रंग यौगिक की रंगीन प्रकृति के कारण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: मैलाकाइट हरे अभिकर्मक को जोड़ने के बाद रंग विकास। मैलाकाइट हरे अभिकर्मक के अतिरिक्त रंग विकास। (ए) मुख्य प्लेट में रंग विकास 3. (बी) मुख्य प्लेट में रंग विकास 4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टॉक समाधान अंतिम शंख। कमजोर पड़ना (अंतिम/स्टॉक) 100 मिलीलीटर स्टॉक के लिए आवश्यक राशि (कुल मात्रा × कमजोर होना)
1000 mM Tris-HCl, pH 7.4 200 mM 0.2 20 mL
1000 mM KCl 40 mM 0.04 4 mL
1000 mM MgCl2 12 mM 0.012 1.2 mL
अति-शुद्ध पानी ना ना 100 mL कुल आयतन में जोड़ें

तालिका 1: परख बफर की तैयारी।

#  1 2 3 4 5
एक अति-शुद्ध पानी अति-शुद्ध पानी कोरा कोरा
B 4 μM PB 4 μM PB नकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण
C 8 μM PB 8 μM PB GA(100 μM) + Hsp90 GA(100 μM) + Hsp90
D 12 μM PB 12 μM PB GA(20 μM) + Hsp90 GA(20 μM) + Hsp90
E 16 μM PB 16 μM PB GA(4 μM) + Hsp90 GA(4 μM) + Hsp90
F 24 μM PB 24 μM PB GA(0.8 μM) + Hsp90 GA(0.8 μM) + Hsp90
G 32 μM PB 32 μM PB GA(0.16 μM) + Hsp90 GA(0.16 μM) + Hsp90
H 40 μM PB 40 μM PB GA(0.032 μM) + Hsp90 GA(0.032 μM) + Hsp90
नोट: कुल कुएं की मात्रा 80 μL है। पीबी = फॉस्फेट बफर मानक।

तालिका 2: 96-वेल प्लेट का लेआउट।

# कोरा नकारात्मक नियंत्रण खमीर Hsp90 + GA
परख बफर 40 μL 32 μL 32 μL
DMSO 2 μL 2 μL -
जीए - - 2 μL
Hsp90 - 8 μL 8 μL
एटीपी (4 mM) 4 μL 4 μL 4 μL
अति-शुद्ध पानी 34 μL 34 μL 34 μL
कुल आयतन 80 μL 80 μL 80 μL

तालिका 3: प्रत्येक कुएं का घटक।

प्लेट आईडी व्याख्या
1 यौगिक युक्त मुख्य प्लेट
2 यौगिक युक्त मुख्य प्लेट (प्लेट 1 की डुप्लिकेट)
3 Hsp90 और यौगिक के साथ मुख्य प्लेट
4 एचएसपी 90 और यौगिक के साथ मुख्य प्लेट (प्लेट 3 की डुप्लिकेट)
वाणिज्यिक पत्र यौगिक समाधान
एक बफर समाधान
B Hsp90 के साथ बफर समाधान
C एटीपी समाधान
D मालाकाइट हरा अभिकर्मक समाधान
नोट: सभी प्लेटें 96-अच्छी तरह से पारदर्शी हैं। मुख्य प्लेट: प्लेटें जहां अंतिम एटीपीस प्रतिक्रिया होती है। प्लेट सीपी, ए, बी, सी, और डी विशिष्ट अभिकर्मकों वाले अतिरिक्त प्लेटें हैं।

तालिका 4: एचटीएस परख में उपयोग की जाने वाली प्लेटों के प्रकार।

# 1 2 3 4 वाणिज्यिक पत्र एक B C D
1:10 डीएमएसओ में यौगिक/जीए समाधान: पानी 20 μL 20 μL 20 μL 20 μL 90 μL - - - -
HSP90 समाधान: बफर समाधान (1:4) - - 40 μL 40 μL - - 90 μL - -
बफर समाधान 40 μL 40 μL - - - 90 μL - - -
एटीपी (0.8 mM) 20 μL 20 μL 20 μL 20 μL - - - 90 μL -
मालाकाइट हरा अभिकर्मक - - - - - - - - 90 μL
कुल आयतन 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 90 μL 90 μL 90 μL 90 μL 90 μL
नोट: जीए = गेल्डामाइसिन। अतिरिक्त प्लेटों सीपी, ए, बी, सी और डी के लिए, मुख्य प्लेटों में समाधान के सही हस्तांतरण के लिए एक अतिरिक्त 10 μL लिया जाता है।

तालिका 5: एचटीएस प्रोटोकॉल में प्रत्येक कुएं का घटक।

# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक DMSO+W 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89
B जीए 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90
C 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91
D 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92
E 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93
F 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94
G 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95
H 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
नोट: 3-96 एचएसपी 90 निषेध क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए यौगिक कोड हैं। जीए = गेल्डामाइसिन। W = अल्ट्रा-शुद्ध पानी

तालिका 6: अच्छी तरह से प्लेट मुख्य प्लेट 1 और 2 (एचएसपी 90 के बिना), और 3 और 4 (एचएसपी 90 के साथ) के लिए रखी गई है।

अच्छी तरह से घटक % ATPase गतिविधि* % निषेध
Hsp90 100 0.00
GA(100 μM) 17.46 82.55
GA (20 μM) 17.77 82.23
GA(4 μM) 18.27 81.73
GA (0.8 μM) 58.43 41.57
GA (0.16 μM) 91.38 8.62
GA (0.032 μM) 92.86 7.14
* दो स्वतंत्र निर्धारण का एक औसत

तालिका 7: "गेल्डामाइसिन की प्रतिशत निषेध और एटीपीस गतिविधि".

अच्छी तरह से घटक Abs (A) अच्छी तरह से घटक Abs (B) B-A % ATPase गतिविधि* % निषेध
कोरा 0.281 नकारात्मक नियंत्रण 0.663 0.383 100 0
GA (20 μM) 0.295 GA (20 μM)+Hsp90 0.388 0.093 24.18 75.82
यौगिक 6 (100 μM) 0.3 यौगिक 6 (100 μM) + Hsp90 0.403 0.103 26.93 73.07
यौगिक 82 (100 μM) 0.49 यौगिक 82 (100 μM) + Hsp90 0.462 -0.028 -7.32 107.32
यौगिक 95 (100 μM) 0.327 यौगिक 95 (100 μM) + Hsp90 0.469 0.142 37.12 62.88

तालिका 8: गेल्डामाइसिन और चयनित यौगिकों की प्रतिशत निषेध और एटीपीस गतिविधि।

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Discussion

एचएसपी 90 उपन्यास एंटीकैंसर दवा अणुओं की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है। चूंकि इसकी दवा 199410 में स्थापित की गई थी, 18 अणु नैदानिक परीक्षणों तक पहुंच गए हैं। वर्तमान में, सात अणु नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में हैं, या तो अकेले या संयोजन22 में। ऐसे सभी छोटे अणु एन-टर्मिनल एटीपी बाइंडिंग इनहिबिटर हैं। चैपरोन (सी-टर्मिनल इनहिबिटर, मिडिल डोमेन इनहिबिटर) को बाधित करने के अन्य साधन एन-टर्मिनल इनहिबिटर के रूप में तेजी से आगे नहीं बढ़े हैं। इसलिए, एन-टर्मिनल एटीपी बाइंडिंग अवरोधक यौगिक अभी भी नैदानिक रूप से विपणन योग्य अणु में प्रगति का वादा करते हैं। इसके अलावा, जून, 2022 में अनुमोदित एकमात्र एचएसपी 90 अवरोधक (जापान में जीआईएसटी के उपचार के लिए पिमिट्सपिब), एक एन-टर्मिनल एटीपी-बाइंडिंग अणु9 है। हालांकि, एक एकल अणु, आज तक, दुनिया के अन्य हिस्सों में विपणन योग्य चरण तक नहीं पहुंचाहै। इस विफलता के कई मुख्य कारण हैं, जिनमें फॉर्मूलेशन के मुद्दे, विषाक्तता के अलावा अणुओं के उत्पादन की लागत जैसे ओटोटॉक्सिसिटी और कुछ यौगिकों से जुड़े कार्डियोटॉक्सिसिटी शामिल हैं। इन प्रतिकूल प्रभावों को दूर करने के लिए, एचएसपी 90 एन-टर्मिनल चयनात्मक अवरोधकों (अल्फा और बीटा) का अब 25,26,27 पता लगाया जा रहा है। उपरोक्त सभी चर्चा यौगिकों की एचटीएस स्क्रीनिंग की गारंटी देती है, जो अपने एटीपी बाइंडिंग फांक से बंधकर एचएसपी 90 गतिविधि को दबा देगी।

दवाओं की खोज के लिए परख तेज, लागत प्रभावी, संवेदनशील, आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कम खतरनाक रसायनों और / या स्थितियों का उपयोग करने की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, इसे आसानी से प्रयोगशाला पैमाने के साथ-साथ एचटीएस सेटअप में भी किया जाना चाहिए। उपलब्ध एचएसपी 90 एटीपीस निरोधात्मक परख का एक विस्तृत विश्लेषण किया गया था, और दिए गए संस्थागत सेटअप में सभी के बीच मैलाकाइट ग्रीन फॉस्फेट परख सबसे उपयुक्त पाया गया था। अन्य परख प्रणालियां एचटीएस प्रणाली (पाइरूवेट / लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज युग्मित एंजाइम) 28,29 में स्वचालन के अनुकूल नहीं थीं; फ्लोरेसेंस ध्रुवीकरण परख30, सिंटिलेशन प्रॉक्सिमिटी परख, सतह प्लास्मोन अनुनाद परख, और समय-हल किए गए प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (टीआर-फ्रेट) 28,29 की तरह महंगा; समय लेने वाली (टीआर-फ्रेट) 28,29; या विकिरण खतरों जैसे कि28,29। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में नए एचएसपी 90 एन-टर्मिनल एटीपी बाइंडिंग इनहिबिटर की पहचान के लिए लैब-स्केल या एचटीएस के रूप में एक सरल मैलाकाइट ग्रीन परख प्रस्तुत की गई है।

इस परख में प्रमुख चिंता फॉस्फेट आयनों के साथ मूल्यांकन किए जाने वाले बफर और पौधे के अर्क का संदूषण है, जिससे गलत परिणाम हो सकते हैं। प्रतिक्रिया पीएच पर एटीपी के गैर-एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस से भी गलत परिणाम हो सकते हैं। उपरोक्त समस्याओं को फॉस्फेट-मुक्त बफर (पीएच 7.4) का उपयोग करके हल किया गया था। इसके अतिरिक्त, एक रिक्त स्थान बफर + पानी + डीएमएसओ के साथ किया गया था, और उसके बाद रिक्त मान से सकारात्मक नियंत्रण / नमूना यौगिकों के अवशोषण मूल्य को घटाया गया था। इस परख प्रक्रिया में एक सावधानी बरतने की आवश्यकता है, अभिकर्मकों के अतिरिक्त सख्त पालन है, जैसे मल्टी-चैनल पिपेट के माध्यम से प्रत्येक कुएं में एक साथ एटीपी को जोड़ना। ऐसा इसलिए है ताकि प्रतिक्रिया हर कुएं में एक ही समय में शुरू होती है, एक ही इनक्यूबेशन समय, और उसके बाद मैलाकाइट हरे अभिकर्मक को जोड़ने के बाद अवशोषण के एक ही माप पर। एटीपीस प्रतिक्रिया अत्यधिक समय संवेदनशील है, और इसलिए प्रतिक्रिया दीक्षा और समाप्ति समय में थोड़ा बदलाव, इनक्यूबेशन समय, और अवशोषण रिकॉर्ड करने के लिए समय परख परिणामों को काफी प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, 34% सोडियम साइट्रेट समाधान (एटीपीस प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए उपयोग किया जाता है) के 10 μL के अलावा मानक वक्र की रैखिकता को प्रभावित करता है, और इसलिए हमारे परख प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया था।

इस परख की एकमात्र सीमा उन यौगिकों का मूल्यांकन है जो 620 एनएम पर खमीर एचएसपी 90 द्वारा एटीपी से जारी मुक्त फॉस्फेट द्वारा दिखाए गए अवशोषण से अधिक प्रदर्शित करते हैं। एक गलत सकारात्मक या गलत नकारात्मक के परिणामस्वरूप ऐसे यौगिकों के मामले में हो सकता है। हालांकि, ऐसे यौगिकों का सामना करने की संभावना बहुत दुर्लभ है। यह विशेष रूप से पौधे के अर्क और / या उनके अंशों के मूल्यांकन के साथ समस्याग्रस्त हो सकता है, जहां यौगिकों का मिश्रण मौजूद है।

अंत में, लैब-स्केल से एचटीएस तक स्केल-अप सफलतापूर्वक खमीर एचएसपी 90 के साथ किया गया था। लैब-स्केल के साथ-साथ एचटीएस में स्टेपवाइज परख प्रोटोकॉल दुनिया भर के वैज्ञानिकों को नोवेल एचएसपी 90 इनहिबिटर की खोज के लिए इस प्रक्रिया को अपनाने में मदद करेगा। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल को अन्य एटीपी निर्भर प्रोटीन जैसे एचएसपी 70, जीआरपी 94, लोन प्रोटीज, प्रोटीज टीआई, एएए प्रोटीज आदि31,32,33 के खिलाफ एटीपीस अवरोधकों की खोज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को कोरिया रिसर्च फैलोशिप (केआरएफ) कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, जो कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के पोस्टडॉक्टोरल फेलो थे, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (एनआरएफ -2019 एच 1 डी 3 ए 1 ए 01102952) द्वारा वित्त पोषित थे। लेखक इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए केआईएसटी इंट्राम्यूरल अनुदान और महासागर और मत्स्य पालन मंत्रालय अनुदान संख्या 2एमआरबी 130 के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

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References

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