Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقايسة الملكيت الأخضر لاكتشاف مثبطات بروتين الصدمة الحرارية 90

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64693
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

Summary

بروتوكول الفحص الأخضر الملكيت هو طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لاكتشاف مثبطات بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) ، بالإضافة إلى مركبات مثبطة أخرى ضد الإنزيمات المعتمدة على ATP.

Abstract

بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هو هدف واعد مضاد للسرطان بسبب تأثيره المرافقة على العديد من البروتينات المسرطنة. يعتمد نشاط Hsp90 على قدرته على تحلل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) والفوسفات الحر. يرتبط نشاط ATPase ل Hsp90 بوظيفة المرافقة الخاصة به. يرتبط ATP بالمجال N-terminal ل Hsp90 ، وقد وجد أن تعطيل ارتباطه هو الإستراتيجية الأكثر نجاحا في قمع وظيفة Hsp90. يمكن قياس نشاط ATPase بواسطة مقايسة خضراء من الملكيت اللوني ، والتي تحدد كمية الفوسفات الحر التي يشكلها التحلل المائي ATP. هنا ، يتم وصف إجراء لتحديد نشاط ATPase للخميرة Hsp90 باستخدام مجموعة مقايسة الفوسفات الأخضر الملكيت. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات مفصلة لاكتشاف مثبطات Hsp90 عن طريق تناول geldanamycin كمثبط أصلي. أخيرا ، تمت مناقشة تطبيق بروتوكول الفحص هذا من خلال الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لجزيئات المثبطات ضد الخميرة Hsp90.

Introduction

بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هو مرافق جزيئي يحافظ على استقرار البروتينات المسؤولة عن تطور السرطان وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتينات المسؤولة عن تطوير مقاومة العوامل المضادة للأورام هي أيضا عملاء Hsp901. يتم التعبير عن Hsp90 بشكل مفرط في كل مكان في جميع أنواع الخلايا السرطانية (>90٪ من البروتينات الخلوية) ، مقارنة بالخلايا الطبيعية حيث قد تشكل أقل من 2٪ من إجمالي البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن Hsp90 للخلايا السرطانية موجود في مجمع مع مرافقين مشتركين ، بينما في الخلية الطبيعية يكون موجودا في الغالب في حالة حرة غير معقدة 2,3. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن العديد من مثبطات Hsp90 تمتلك تأثيرات senolytic في الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي ، حيث حسنت بشكل كبير من عمر الفئران4،5،6. تثبت جميع النتائج المذكورة أعلاه حقيقة أن مثبطات Hsp90 يمكن أن تكون فعالة في أنواع متعددة من السرطان ، مع آثار ضارة أقل وفرص أقل لتطوير المقاومة. يتم إنجاز وظيفة المرافقة ل Hsp90 عن طريق ربط ATP في المجال N-terminal ل Hsp90 وتحلله مائيا إلى ADP والفوسفاتالحر 7. تم العثور على جزيئات صغيرة ترتبط بشكل تنافسي بجيب ربط ATP ل Hsp90 لقمع تأثير مرافقة البروتين بنجاح. حتى الآن ، لا تزال هذه هي أفضل استراتيجية لتثبيط Hsp90 ، والتي تدعمها حقيقة أن هذه المثبطات قد وصلت إلى التجارب السريرية8. واحد منهم ، Pimitespib ، تمت الموافقة عليه في اليابان لعلاج ورم انسجة الجهاز الهضمي (GIST) في يونيو 20229. هذا هو أول مثبط Hsp90 تمت الموافقة عليه منذ أن تم إنشاء قابلية الدواء للمرافق في عام 199410.

اختبار الملكيت الأخضر هو إجراء بسيط وحساس وسريع وغير مكلف للكشف عن الفوسفات غير العضوي ، ومناسب للأتمتة والفحص عالي الإنتاجية (HTS) للمركبات مقابل الهدفالمطلوب 11. تم استخدام الفحص بنجاح لفحص مثبطات Hsp90 في إعدادات صغيرة على نطاق المختبر ، وكذلك في HTS12،13،14،15،16،17. يستخدم الفحص طريقة قياس لوني تحدد الفوسفات غير العضوي الحر المتكون بسبب نشاط ATPase ل Hsp90. أساس هذا القياس الكمي هو تكوين مركب فوسفومولبدات بين الفوسفات الحر والموليبدينوم ، والذي يتفاعل لاحقا مع الملكيت الأخضر لتوليد لون أخضر (الشكل 1). يتم قياس هذا التكوين السريع للألوان على مقياس الطيف الضوئي ، أو على قارئ الألواح ، بين 600-660 نانومتر18,19.

في البروتوكول الحالي ، يتم وصف الإجراء الخاص بإجراء مقايسة الملكيت الأخضر مع الخميرة Hsp90 والتحديد اللاحق للمثبطات ضد المرافق. تم أخذ جزيء المنتج الطبيعي ، geldanamycin (GA) ، الذي تم به إثبات قابلية استخدام Hsp90 لأول مرة ، كمثبط أصلي10. أصبحت HTS جزءا لا يتجزأ من برنامج اكتشاف الأدوية الحالي ، نظرا لتوافر عدد كبير من الجزيئات للاختبار. اكتسبت هذه التقنية أهمية أكبر في العامين الماضيين بسبب الحاجة الملحة لإعادة استخدام الأدوية لعلاج عدوى Covid-1920,21. لذلك ، يتم تقديم مخطط تفصيلي ل HTS للجزيئات ضد بروتين الخميرة Hsp90 من خلال اعتماد طريقة الفحص الأخضر الملكيت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مقايسة الملكيت الخضراء على نطاق المختبر

  1. إعداد مقايسة العازلة
    1. قم بإعداد مخزن الفحص المؤقت ، وفقا للتكوين والتحضير المعروضين في الجدول 1.
  2. إعداد معايير الفوسفات
    1. استخدم معيار فوسفات 1 مللي مول ، المقدم في مجموعة مقايسة فوسفات الملكيت الأخضر (المخزنة في 4 درجات مئوية).
    2. ماصة 40 ميكرولتر من معيار فوسفات 1 مللي متر في 960 ميكرولتر من الماء النقي للغاية للحصول على محلول فوسفات 40 ميكرومتر (محلول بريمكس). أضف محلول بريمكس بماء فائق النقاء ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، لتشكيل تخفيف تسلسلي للفوسفات من 0 إلى 40 ميكرومتر.
  3. إعداد الخميرة Hsp90
    1. استخدم الخميرة Hsp90 بتركيز مخزون الجلسرين 0.66 مجم / مل. قم بإذابة الثلج قبل الاستخدام مباشرة.
    2. استخدم 8 ميكرولتر (5.98 ميكروغرام ، 0.80 ميكرومتر) من الخميرة Hsp90 لنشاط ATPase القابل للقياس. تأكد من أن فرق الكثافة الضوئية بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر بين عنصر التحكم الفارغ والموجب لا يقل عن 0.5 وأقل من 1.0. هنا ، وجد أن فرق الامتصاص بين الفراغ (بدون Hsp90) والتحكم الإيجابي (مع Hsp90) هو 0.510.
  4. إعداد ATP
    1. انقل 1 مجم من ATP إلى قنينة تحتوي على 453.39 ميكرولتر من الماء فائق النقاء للحصول على 4 مللي متر من محلول المخزون. قم بإجراء حسابات الوزن بناء على ATP اللامائي (الوزن الجزيئي [m.w.] = 551.14). تحضير ATP طازجا ، لأنه يمكن أن يتحلل تلقائيا بمرور الوقت.
    2. أضف 4 ميكرولتر من محلول مخزون ATP إلى كل بئر لإعطاء تركيز نهائي للبئر يبلغ 0.2 mM (إجمالي حجم بئر الفحص النهائي 80 ميكرولتر). أضف ATP باعتباره المكون الأخير للتفاعل ، باستخدام ماصة متعددة القنوات بحيث تبدأ جميع التفاعلات في وقت واحد.
  5. إعداد جيلداناميسين (GA)
    1. قم بإعداد مخزون 10 mM من GA عن طريق إذابة 1 مجم في 178.37 ميكرولتر من DMSO (m.w. = 560.64). باستخدام محلول المخزون ، قم بإعداد محلول 4 mM و 0.8 mM و 0.16 mM و 0.032 mM و 0.0064 mM و 0.00128 mM في DMSO عن طريق التخفيف التسلسلي.
    2. أضف 2 ميكرولتر من محاليل المخزون هذه إلى كل بئر للحصول على تركيز بئر نهائي يبلغ 0.1 مللي مول و 0.02 مللي مول و 0.004 مللي مول و 0.0008 مللي مول و 0.00016 مللي مول و 0.000032 مللي مول على التوالي.
    3. تجهيز الآبار كما هو موضح في الجدول 2 والجدول 3 ، مع احتواء الآبار على الفراغ (المخزن المؤقت + الماء + DMSO) والتحكم السلبي (Hsp90 في المخزن المؤقت + الماء + DMSO). تعمل الآبار التي تحتوي على GA (Hsp90 في المخزن المؤقت + الماء + GA) كعنصر تحكم إيجابي.
  6. تحضير ألواح البئر وترتيب الإضافة
    1. قم بإعداد 96 لوحة بئر مع التصميم المعروض في الجدول 2. بالنسبة للمركبات التي تظهر امتصاصا عند 620 نانومتر ، قم بإعداد بئر منفصل لتسجيل الامتصاص عند هذا الطول الموجي. لا تقم بإعداد بئر منفصل ل GA ، لأن GA لا يظهر امتصاصا عند 620 نانومتر للتركيز المستخدم في الفحص.
    2. قم بإعداد كل مكون بالحجم الإجمالي لكل مكون ، كما هو موضح في الجدول 3.
    3. قم بإعداد آبار الفحص عن طريق إضافة مياه فائقة النقاء إلى كل بئر. بعد ذلك ، أضف الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت للفحص وحل مركب (على سبيل المثال ، حل GA).
    4. ثم ، أضف Hsp90 إلى الآبار المناسبة ، وهز الألواح لمدة 2 دقيقة على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة.
    5. أضف 4 ميكرولتر من محلول ATP باستخدام ماصة متعددة القنوات. لف اللوحة بورق الألمنيوم ورجها لمدة 2 دقيقة على شاكر لوحة (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  7. تحضير وإضافة كاشف الملكيت الأخضر
    1. يتكون كاشف الملكيت الأخضر من الكواشف A (موليبدات الأمونيوم في 3M HCl) و B (الملكيت الأخضر وكحول البولي فينيل). أحضر الكاشف إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. امزج الكواشف A و B بنسبة 100: 1 (1000 ميكرولتر: 10 ميكرولتر). تحضير هذا في غضون 3 ساعات قبل الاستخدام ، لأنه غير مستقر ويبدأ في التحلل بعد 3 ساعات.
    2. بعد 3 ساعات من الخطوة 1.6.5 ، أوقف التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من كاشف الملكيت الأخضر ، المضاف بنفس ترتيب ATP ، باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    3. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بقياس امتصاص اللوحة عند 620 نانومتر في قارئ اللوحة.

2. فحص عالي الإنتاجية لمثبطات Hsp90 بواسطة مقايسة الملكيت الخضراء

ملاحظة: بروتوكول الفحص عالي الإنتاجية مشابه لمنهجية المختبر. حجم البئر النهائي في كل حالة هو 80 ميكرولتر. ومع ذلك ، هناك اختلاف طفيف في ترتيب إضافة الكواشف. في الطريقة القائمة على نطاق المختبر ، هناك خمس مراحل لإضافة المحلول (34 ميكرولتر من الماء ، 32 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، 2 ميكرولتر مركب في DMSO ، 8 ميكرولتر من Hsp90 ، وأخيرا 4 ميكرولتر من محلول ATP). في المقابل ، مع HTS هناك ثلاث مراحل من الإضافة (40 ميكرولتر من محلول عازل يحتوي على خميرة Hsp90 ، 2 ميكرولتر من DMSO في 18 ميكرولتر من الماء الذي يحتوي على المركبات ، وأخيرا 20 ميكرولتر من ATP المذاب في الماء). الحد الأدنى لمقدار المحلول الذي يمكن سحبه بدقة في إعداد HTS هو 20 ميكرولتر. ومن ثم ، لوحظ اختلاف في السحب بين مقاييس المختبر و HTS.

  1. إعداد المخزن المؤقت للفحص (درجة الحموضة 7.4)
    1. استخدم نفس المخزن المؤقت في HTS كما هو الحال في مقايسة الملكيت الأخضر على نطاق المختبر (الجدول 1).
  2. إعداد الخميرة Hsp90
    1. استخدم البروتين بتركيز مخزون الجلسرين 0.66 مجم / مل. قم بإذابة الثلج قبل الاستخدام مباشرة.
    2. استخدم 8 ميكرولتر (5.98 ميكروغرام ، 0.80 ميكرومتر) من الخميرة Hsp90 في كل بئر ، مما يوفر نشاط ATPase قابل للقياس.
    3. تمييع البروتين (8 ميكرولتر) في العازلة (32 ميكرولتر) لكل بئر. يبلغ إجمالي حجم العمل النهائي لكل بئر 40 ميكرولتر في حجم فحص إجمالي يبلغ 80 ميكرولتر.
  3. تحضير 0.8 مللي متر ATP
    1. قم بإذابة 1 مجم من ATP في 2267 ميكرولتر من الماء المقطر للحصول على محلول 0.8 mM. يبلغ إجمالي حجم العمل لكل بئر 20 ميكرولتر في إجمالي حجم الفحص 80 ميكرولتر.
  4. تحضير جيلداناميسين (GA) / مركبات الاختبار
    1. قم بإعداد مخزون 0.8 مللي متر من GA في DMSO ، كما في الخطوة 1.5. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من مخزون GA ب 90 ميكرولتر من الماء لإعطاء تركيز نهائي قدره 80 ميكرومتر.
    2. استخدم 20 ميكرولتر من محلول 80 ميكرومتر GA في آبار الفحص المناسبة (إجمالي حجم بئر الفحص النهائي = 80 ميكرولتر) ، مما يعطي تركيزا نهائيا للبئر يبلغ 20 ميكرومتر. هذا بمثابة تحكم إيجابي.
    3. بالنسبة لمركبات الاختبار ، قم بإعداد المحاليل في DMSO حسب التركيز المطلوب للتقييم.
    4. تحضير 10 ميكرولتر من DMSO في 90 ميكرولتر من الماء للإضافة إلى آبار فارغة (عازلة + ماء + DMSO) وآبار تحكم سلبية (Hsp90 في المخزن المؤقت + الماء + DMSO). تحضير مركبات الاختبار بطريقة مماثلة بتركيز بئر نهائي 100 ميكرومتر.
  5. تصميم لوحات الفحص وترتيب الإضافة
    1. استخدم أربع لوحات رئيسية ، ولوحة مركبة واحدة ، وأربع لوحات إضافة تحتوي على مخزون من الكواشف لإعداد الفحص (الشكل 2 والجدول 4).
    2. بالإضافة إلى ذلك ، اللوحة A ، أضف 90 ميكرولتر من مخزن الفحص في كل بئر ؛ بالإضافة إلى اللوحة B ، أضف 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت مع Hsp90 في كل بئر ؛ بالإضافة إلى اللوحتين C و D ، أضف 90 ميكرولتر من ATP و 90 ميكرولتر من كاشف الملكيت الأخضر ، على التوالي ، في كل بئر (الجدول 5 والجدول 6).
    3. من لوحة الإضافة A واللوحة B ، قم بنقل 40 ميكرولتر من المحلول من كل بئر إلى اللوحة الرئيسية 1 و 2 ، و 3 و 4 ، على التوالي ، باستخدام نظام توزيع آلي متعدد القنوات. هنا ، تم استخدام محطة عمل أتمتة مختبر Biomek (R) FXP (الشكل 2 والجدول 6).
    4. من كل بئر من الصفيحة المركبة ، انقل 20 ميكرولتر من المحلول إلى الألواح الرئيسية 1 و 2 و 3 و 4 (الشكل 2). هز لوحات لمدة 1 دقيقة في شاكر (200 دورة في الدقيقة).
    5. من كل بئر من لوحة الإضافة C (ATP) ، انقل 20 ميكرولتر من المحلول إلى الألواح الرئيسية 1 و 2 و 3 و 4 (الشكل 2). هز لوحات لمدة 1 دقيقة في شاكر (200 دورة في الدقيقة).
    6. احتضان الألواح لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    7. تحضير كاشف الملكيت الأخضر وفقا للخطوة 1.7. بعد 3 ساعات ، انقل 20 ميكرولتر من كاشف الملكيت الأخضر من لوحة الإضافة D إلى آبار الألواح الرئيسية 1 و 2 و 3 و 4 (الشكل 2).
    8. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بقياس امتصاص اللوحة عند 620 نانومتر في قارئ اللوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تفسير نتائج الفحص من حيث الامتصاص بسبب تركيز أيونات الفوسفات الحرة. يعتبر الامتصاص بواسطة الفوسفات الحر بسبب التحلل المائي ATP بواسطة الخميرة Hsp90 عند 620 نانومتر نشاطا بنسبة 100٪ ATPase ، أو تثبيط البروتين بنسبة صفر. يؤدي تثبيط البروتين إلى وقف التحلل المائي ATP (فوسفات أقل حرية). وهو ما ينعكس من حيث انخفاض الامتصاص عند 620 نانومتر.

نتائج مقايسة الملكيت الخضراء على نطاق المختبر
التمثيل البياني القياسي لمعيار الفوسفات موضح في الشكل 3. يتم قياس نشاط Hsp90 من حيث قدرته على تحلل ATP إلى ADP والفوسفات غير العضوي (Pi). يؤدي ارتفاع تركيز الفوسفات الحر إلى زيادة التكوين المعقد مع أخضر الملكيت ، مما يؤدي إلى لون أخضر كثيف يمكن اكتشافه عند 620 نانومتر (الشكل 4).

يتم حساب النسبة المئوية للتثبيط بالمعادلة التالية:

٪ تثبيط Equation 1

Equation 2

تم اعتبار امتصاص Hsp90 بمثابة تثبيط نسبة صفرية (نشاط ATPase بنسبة 100٪). يتم استخدام النسبة المئوية لنشاط ATPase لقياس تثبيط البروتين المعتمد على الجرعة بواسطة GA. لوحظ أن GA يثبط البروتين بطريقة تعتمد على الجرعة ، بقيمة IC50 تبلغ 0.85 ميكرومتر (الشكل 5 والجدول 7).

تم استخدام نهج المنحنى السيني لبرنامج الرسوم البيانية لتحديد قيمة IC 50 (التركيز الذي تظهر فيه الجزيئات50 ٪ من نشاط Hsp90 ATPase).

نتائج الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لمثبطات Hsp90 بواسطة مقايسة الملكيت الأخضر
تم تنفيذ HTS مع مركبات الاختبار (الرموز من 3 إلى 96) في نسختين عن طريق أخذ GA (تركيز البئر النهائي 20 ميكرومتر) كمعيار مرجعي. لم يكن الامتصاص عند 620 نانومتر للمركبات معروفا ، وبالتالي تم تسجيل امتصاص المركبات وحدها (اللوحتان الرئيسيتان 1 و 2 ؛ الشكل 6). قيمة الامتصاص لكل بئر من اللوحات الرئيسية 3 و 4 (مع Hsp90 ؛ الشكل 7) تم خصمه من الامتصاص المقابل في اللوحتين 1 و 2 (المركب وحده). تم اعتبار امتصاص Hsp90 كنشاط ATPase بنسبة 100٪.

تم حساب النسبة المئوية للتثبيط باستخدام الصيغة التالية:

٪ تثبيط Equation 3

Equation 4

أظهر تركيز GA 20 ميكرومتر تثبيطا بنسبة 75.82٪. أظهر 100 ميكرومتر من المركب 82 تثبيطا بنسبة 100٪ لبروتين الخميرة Hsp90 ، بينما أظهر المركبان 6 و 95 تثبيطا بنسبة 73.07٪ و 62.88٪ ، على التوالي ، عند 100 ميكرومتر (الجدول 8). المركبات الأخرى قمعت البروتين بنسبة أقل من 50 ٪ عند 100 ميكرومتر واعتبرت غير نشطة.

Figure 1
الشكل 1: تفاعلات كاشف الملكيت الأخضر (MG). أ: تركيب أخضر الملكيت. (ب) تفاعلات كاشف الملكيت الأخضر A (موليبدات الأمونيوم في 3 M HCl) مع Pi ، والتفاعل اللاحق مع الكاشف B (أخضر الملكيت في كحول البولي فينيل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط تجريبي لبروتوكول HTS. يوضح الشكل ترتيب إضافة الكواشف إلى لوحة الفحص الرئيسية من لوحات الإضافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط قياسي لتركيز الفوسفات القياسي. يمثل المحور X تركيز Pi في الميكرومولار ، ويتم تصوير الامتصاص عند 620 نانومتر على المحور Y. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف بين رقمي العينة (n = 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تطور اللون بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر. يصبح اللون الأخضر أكثر كثافة مع تركيز الفوسفات العالي والمزيد من نشاط ATPase. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: حساب IC50 لجيلداناميسين ضد الخميرة Hsp90. كل نقطة هي متوسط تحديدين (n = 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تطور اللون بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر. (أ) تطور اللون في اللوحة الرئيسية 1. يرجع اللون الوردي في بئر A11 إلى اللون المركب. (ب) تطور اللون في اللوحة الرئيسية 2. يرجع اللون الوردي في بئر A11 إلى الطبيعة الملونة للكمبوند. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تطور اللون بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر. تطور اللون بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر. (أ) تطور اللون في اللوحة الرئيسية 3. (ب) تطور اللون في اللوحة الرئيسية 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل الأسهم المخروط النهائي. التخفيف (نهائي / مخزون) الكمية المطلوبة لمخزون 100 مل (التخفيف × الحجم الإجمالي)
1000 مللي متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 200 مللي متر 0.2 20 مل
1000 مللي متر كيلوكل 40 مللي متر 0.04 4 مل
1000 مللي متر MgCl2 12 مللي متر 0.012 1.2 مل
مياه فائقة النقاء غير متوفر غير متوفر أضف إلى إجمالي حجم 100 مل

الجدول 1: إعداد المخزن المؤقت للفحص.

#  1 2 3 4 5
A مياه فائقة النقاء مياه فائقة النقاء خلبي خلبي
B 4 ميكرومتر PB 4 ميكرومتر PB السيطرة السلبية السيطرة السلبية
C 8 ميكرومتر PB 8 ميكرومتر PB GA (100 ميكرومتر) + Hsp90 GA (100 ميكرومتر) + Hsp90
D 12 ميكرومتر PB 12 ميكرومتر PB GA (20 ميكرومتر) + Hsp90 GA (20 ميكرومتر) + Hsp90
E 16 ميكرومتر PB 16 ميكرومتر PB GA (4 ميكرومتر) + Hsp90 GA (4 ميكرومتر) + Hsp90
F 24 ميكرومتر PB 24 ميكرومتر PB GA (0.8 ميكرومتر) + Hsp90 GA (0.8 ميكرومتر) + Hsp90
G 32 ميكرومتر PB 32 ميكرومتر PB GA (0.16 ميكرومتر) + Hsp90 GA (0.16 ميكرومتر) + Hsp90
H 40 ميكرومتر PB 40 ميكرومتر PB GA (0.032 ميكرومتر) + Hsp90 GA (0.032 ميكرومتر) + Hsp90
ملاحظه: إجمالي حجم البئر 80 ميكرولتر. PB = معيار عازلة الفوسفات.

الجدول 2: تخطيط لوحة 96 بئر.

# خلبي السيطرة السلبية خميرة Hsp90 + GA
المخزن المؤقت للفحص 40 ميكرولتر 32 ميكرولتر 32 ميكرولتر
دمسو 2 ميكرولتر 2 ميكرولتر -
جي إيه - - 2 ميكرولتر
هسب90 - 8 ميكرولتر 8 ميكرولتر
ATP (4 مللي متر) 4 ميكرولتر 4 ميكرولتر 4 ميكرولتر
مياه فائقة النقاء 34 ميكرولتر 34 ميكرولتر 34 ميكرولتر
الحجم الكلي 80 ميكرولتر 80 ميكرولتر 80 ميكرولتر

الجدول 3: مكون كل بئر.

معرف اللوحة تفسير
1 اللوحة الرئيسية التي تحتوي على مركب
2 اللوحة الرئيسية التي تحتوي على مركب (نسخة مكررة من اللوحة 1)
3 اللوحة الرئيسية مع Hsp90 ومركب
4 اللوحة الرئيسية مع Hsp90 والمركب (نسخة مكررة من اللوحة 3)
أ ب الحل المركب
A حل العازلة
B حل المخزن المؤقت مع Hsp90
C حل ATP
D محلول كاشف الملكيت الأخضر
ملاحظة: جميع اللوحات شفافة 96 جيدا. اللوحة الرئيسية: الألواح التي يحدث فيها تفاعل ATPase النهائي. اللوحة CP و A و B و C و D هي لوحات إضافة تحتوي على كواشف محددة.

الجدول 4: أنواع اللوحات المستخدمة في فحص HTS.

# 1 2 3 4 أ ب A B C D
محلول مركب / GA في 1:10 DMSO: ماء 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر 90 ميكرولتر - - - -
حل Hsp90: محلول عازل (1: 4) - - 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر - - 90 ميكرولتر - -
حل العازلة 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر - - - 90 ميكرولتر - - -
ATP (0.8 مللي مول) 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر 20 ميكرولتر - - - 90 ميكرولتر -
كاشف الملكيت الأخضر - - - - - - - - 90 ميكرولتر
الحجم الكلي 80 ميكرولتر 80 ميكرولتر 80 ميكرولتر 80 ميكرولتر 90 ميكرولتر 90 ميكرولتر 90 ميكرولتر 90 ميكرولتر 90 ميكرولتر
ملاحظه: GA = جيلداناميسين. بالنسبة للوحات الإضافة CP و A و B و C و D ، يتم أخذ 10 ميكرولتر إضافية للنقل المثالي للحلول إلى الألواح الرئيسية.

الجدول 5: مكون كل بئر في بروتوكول HTS.

# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A DMSO + W 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89
B جي إيه 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90
C 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91
D 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92
E 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93
F 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94
G 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95
H 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
ملاحظة: 3-96 هي رموز مركبة لتقييم إمكانات تثبيط Hsp90. GA = جيلداناميسين. W = ماء فائق النقاء

الجدول 6: وضع لوحة جيدة للوحة الرئيسية 1 و 2 (بدون Hsp90) ، و 3 و 4 (مع Hsp90).

التأسيسية بشكل جيد ٪ نشاط ATPase * ٪ تثبيط
هسب90 100 0.00
GA (100 ميكرومتر) 17.46 82.55
GA (20 ميكرومتر) 17.77 82.23
GA (4 ميكرومتر) 18.27 81.73
GA (0.8 ميكرومتر) 58.43 41.57
GA (0.16 ميكرومتر) 91.38 8.62
GA (0.032 ميكرومتر) 92.86 7.14
* وسيلة لاثنين من التحديد المستقل

الجدول 7: تثبيط النسبة المئوية ونشاط ATPase من geldanamycin.

التأسيسية بشكل جيد عبس (أ) التأسيسية بشكل جيد القيمة المطلقة (ب) ب-أ ٪ نشاط ATPase * ٪ تثبيط
خلبي 0.281 السيطرة السلبية 0.663 0.383 100 0
GA (20 ميكرومتر) 0.295 GA (20 ميكرومتر) + Hsp90 0.388 0.093 24.18 75.82
مركب 6 (100 ميكرومتر) 0.3 مركب 6 (100 ميكرومتر) + Hsp90 0.403 0.103 26.93 73.07
مركب 82 (100 ميكرومتر) 0.49 مركب 82 (100 ميكرومتر) + Hsp90 0.462 -0.028 -7.32 107.32
مركب 95 (100 ميكرومتر) 0.327 مركب 95 (100 ميكرومتر) + Hsp90 0.469 0.142 37.12 62.88

الجدول 8: تثبيط النسبة المئوية ونشاط ATPase من geldanamycin والمركبات المختارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hsp90 هو هدف مهم لاكتشاف جزيئات الأدوية الجديدة المضادة للسرطان. منذ تأسيس قابليتها للدواء في عام 199410 ، وصلت جزيئات 18 إلى التجارب السريرية. في الوقت الحاضر ، توجد سبعة جزيئات في مراحل مختلفة من التجارب السريرية ، إما بمفردها أو مجتمعة22. كل هذه الجزيئات الصغيرة هي مثبطات ربط ATP الطرفية N. الوسائل الأخرى لتثبيط المرافق (مثبطات C-terminal ، مثبطات المجال الأوسط) لم تستمر بالسرعة التي تعمل بها مثبطات N-terminal. ومن ثم ، فإن مركبات مثبطات ربط ATP الطرفية N لا تزال تبشر بالتقدم إلى جزيء قابل للتسويق سريريا. علاوة على ذلك ، فإن مثبط Hsp90 الوحيد ، الذي تمت الموافقة عليه في يونيو 2022 (Pimitespib لعلاج GIST في اليابان) ، هو جزيء N-terminalATP 9. ومع ذلك ، فإن جزيء واحد ، حتى الآن ، لم يصل إلى مرحلة قابلة للتسويق في أجزاء أخرى من العالم23,24. هناك عدة أسباب رئيسية لهذا الفشل ، بما في ذلك قضايا الصياغة ، وتكلفة إنتاج الجزيئات بالإضافة إلى السمية مثل السمية الأذنية ، والسمية القلبية المرتبطة بمركبات قليلة. للتغلب على هذه الآثار الضارة ، يتم الآن استكشاف مثبطات Hsp90 N-terminal الانتقائية (ألفا وبيتا)25،26،27. كل المناقشة المذكورة أعلاه تستدعي فحص HTS للمركبات ، والتي من شأنها قمع نشاط Hsp90 عن طريق الارتباط بشق ربط ATP.

يجب أن تكون فحوصات اكتشاف الأدوية سريعة وفعالة من حيث التكلفة وحساسة وسهلة التكرار وتستخدم مواد كيميائية و / أو ظروف أقل خطورة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتم تنفيذه بشكل ملائم على نطاق المختبر وكذلك في إعداد HTS. تم إجراء تحليل مفصل للمقايسات المثبطة Hsp90 ATPase المتاحة ، ووجد أن مقايسة الفوسفات الأخضر الملكيت هي الأنسب بين الجميع في الإعداد المؤسسي المحدد. لم تكن أنظمة الفحص الأخرى صديقة للأتمتة في نظام HTS (إنزيم مقترن بهيدروجيناز البيروفات / اللاكتات)28,29; باهظة الثمن مثل مقايسة الاستقطاب الفلوري30 ، ومقايسات القرب من التلألؤ ، ومقايسة رنين البلازمون السطحي ، ونقل طاقة الرنين الفلوري الذي تم حله زمنيا (TR-FRET) 28,29 ؛ تستغرق وقتا طويلا مثل (TR-FRET)28,29; أو تمتلك مخاطر الإشعاع مثل مقايسات القرب التلألؤ28,29. لذلك ، يتم تقديم اختبار أخضر بسيط من الملكيت كمقياس مختبري أو HTS لتحديد مثبطات ربط ATP الطرفية Hsp90 N-terminal الجديدة في هذا البروتوكول.

الشاغل الرئيسي في هذا الفحص هو تلوث المخازن المؤقتة والمستخلصات النباتية التي سيتم تقييمها بأيونات الفوسفات ، مما قد يؤدي إلى نتائج خاطئة. قد يؤدي التحلل المائي غير الأنزيمي ل ATP عند تفاعل الأس الهيدروجيني أيضا إلى نتائج خاطئة. تم حل المشاكل المذكورة أعلاه باستخدام المخازن المؤقتة الخالية من الفوسفات (درجة الحموضة 7.4). بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء فراغ باستخدام المخزن المؤقت + الماء + DMSO ، وبعد ذلك طرح قيمة الامتصاص لمركبات التحكم / العينة الإيجابية من القيمة الفارغة. من الاحتياطات التي يجب اتباعها في إجراء الفحص هذا الالتزام الصارم بإضافة الكواشف ، مثل إضافة ATP في وقت واحد إلى كل بئر عبر ماصة متعددة القنوات. وذلك بحيث يبدأ التفاعل في نفس الوقت في كل بئر ، ونفس وقت الحضانة ، وبعد ذلك في نفس قياس الامتصاص بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر. تفاعل ATPase حساس للغاية للوقت ، وبالتالي فإن التغيير الطفيف في وقت بدء التفاعل وإنهائه ، ووقت الحضانة ، ووقت تسجيل الامتصاص يمكن أن يؤثر بشكل كبير على نتائج الفحص. علاوة على ذلك ، فإن إضافة 10 ميكرولتر من محلول سترات الصوديوم بنسبة 34٪ (المستخدم لإخماد تفاعل ATPase) يؤثر على خطية المنحنى القياسي ، وبالتالي لم يتم تضمينه في بروتوكول الفحص الخاص بنا.

القيد الوحيد لهذا الفحص هو تقييم المركبات التي تظهر امتصاصا أعلى مما هو موضح في الفوسفات الحر المنبعث من ATP بواسطة الخميرة Hsp90 عند 620 نانومتر. قد ينتج عن إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة في حالة هذه المركبات. ومع ذلك ، فإن فرص مواجهة مثل هذه المركبات نادرة جدا. يمكن أن يكون هذا مشكلة في تقييم المستخلصات النباتية و / أو كسورها على وجه الخصوص ، حيث يوجد خليط من المركبات.

في الختام ، تم إجراء التوسع من نطاق المختبر إلى HTS بنجاح باستخدام الخميرة Hsp90. سيساعد بروتوكول الفحص التدريجي على نطاق المختبر وكذلك في HTS العلماء في جميع أنحاء العالم على اعتماد هذا الإجراء لاكتشاف مثبطات Hsp90 الجديدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول لاكتشاف مثبطات ATPase ضد البروتينات الأخرى المعتمدة على ATP مثل Hsp70 و Grp94 و Lon protease و Protease Ti و AAA proteases وما إلى ذلك31،32،33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا توجد مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج زمالة كوريا البحثية (KRF) ، زميل ما بعد الدكتوراه في المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (NRF-2019H1D3A1A01102952). يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمنحة KIST الداخلية ومنحة وزارة المحيطات ومصايد الأسماك رقم 2MRB130 لتقديم المساعدة المالية لهذا المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Tags

قيمة فارغة، العدد 191، Hsp90، أخضر الملكيت، HTS، جيلداناميسين
مقايسة الملكيت الأخضر لاكتشاف مثبطات بروتين الصدمة الحرارية 90
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S.,… More

Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S., Lee, J. W., Park, J. S., Prodromou, C., Pan, C. H. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter