Summary
Malakitgrönt analysprotokoll är en enkel och kostnadseffektiv metod för att upptäcka värmechockprotein 90 (Hsp90) suppressorer, liksom andra inhibitorföreningar mot ATP-beroende enzymer.
Abstract
Värmechockprotein 90 (Hsp90) är ett lovande anticancermål på grund av dess chaperoning effekt på flera onkogena proteiner. Aktiviteten hos Hsp90 är beroende av dess förmåga att hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) till adenosindifosfat (ADP) och fritt fosfat. ATPas-aktiviteten hos Hsp90 är kopplad till dess chaperoningsfunktion; ATP binder till N-terminaldomänen för Hsp90, och att störa dess bindning visade sig vara den mest framgångsrika strategin för att undertrycka Hsp90-funktionen. ATPas-aktiviteten kan mätas med en kolorimetrisk malakitgrön analys, som bestämmer mängden fritt fosfat bildat genom ATP-hydrolys. Här beskrivs ett förfarande för bestämning av ATPas-aktiviteten hos jäst Hsp90 med hjälp av malakitgrönt fosfatanalyssats. Vidare ges detaljerade instruktioner för upptäckten av Hsp90-hämmare genom att ta geldanamycin som en autentisk hämmare. Slutligen diskuteras tillämpningen av detta analysprotokoll genom high-throughput screening (HTS) av inhibitormolekyler mot jäst Hsp90.
Introduction
Värmechockprotein 90 (Hsp90) är en molekylär chaperon som upprätthåller stabiliteten hos proteiner som är ansvariga för utveckling och progression av cancer. Dessutom är proteiner som är ansvariga för utvecklingen av resistens mot antineoplastiska medel också kunder av Hsp901. Hsp90 överuttrycks allestädes närvarande i alla cancercelltyper (>90% av cellulära proteiner), jämfört med normala celler där det kan utgöra mindre än 2% av det totala proteinet. Dessutom finns Hsp90 av cancerceller i ett komplex med co-chaperoner, medan det i en normal cell huvudsakligen förekommer i ett fritt, okomplext tillstånd 2,3. Under de senaste åren har flera Hsp90-hämmare visat sig ha senolytiska effekter i in vitro- och in vivo-studier, där de signifikant har förbättrat livslängden hos möss 4,5,6. Alla ovannämnda fynd bekräftar det faktum att Hsp90-hämmare kan vara effektiva i flera cancertyper, med färre biverkningar och minskad risk att utveckla resistens. Chaperoneringsfunktionen för Hsp90 åstadkoms genom att binda ATP vid N-terminaldomänen för Hsp90 och hydrolysera den till ADP och fritt fosfat7. Små molekyler som kompetitivt binder till ATP-bindningsfickan av Hsp90 visade sig framgångsrikt undertrycka proteinets chaperoningseffekt. Hittills är detta fortfarande den bästa strategin för Hsp90-hämning, vilket stöds av det faktum att sådana hämmare har nått kliniska prövningar8. En av dem, Pimitespib, godkändes i Japan för behandling av gastrointestinal stromacellstumör (GIST) i juni 20229. Detta är den första Hsp90-hämmaren som godkänts sedan chaperonens drogbarhet etablerades 199410.
Den malakitgröna analysen är en enkel, känslig, snabb och billig procedur för detektion av oorganiskt fosfat, lämplig för automatisering och screening med hög genomströmning (HTS) av föreningar mot dess önskade mål11. Analysen har framgångsrikt använts för screening av Hsp90-hämmare i små laboratorieskalor, liksom i en HTS 12,13,14,15,16,17. Analysen använder en kolorimetrisk metod som bestämmer det fria oorganiska fosfatet bildat på grund av ATPas-aktiviteten hos Hsp90. Grunden för denna kvantifiering är bildningen av ett fosfomolybdatkomplex mellan fritt fosfat och molybden, som därefter reagerar med malakitgrön för att generera en grön färg (figur 1). Denna snabba färgbildning mäts på en spektrofotometer, eller på en plattläsare, mellan 600-660 nm18,19.
I detta protokoll beskrivs förfarandet för att utföra en malakitgrön analys med jäst Hsp90 och efterföljande identifiering av hämmare mot chaperonen. Den naturliga produktmolekylen, geldanamycin (GA), med vilken läkemedelsbarheten för Hsp90 först fastställdes, togs som en autentisk hämmare10. HTS har blivit en integrerad del av det nuvarande läkemedelsupptäcktsprogrammet på grund av tillgången på ett stort antal molekyler för testning. Denna teknik har fått större betydelse under de senaste 2 åren på grund av det akuta behovet av återanvändning av läkemedel för behandling av Covid-19-infektion20,21. Därför presenteras en detaljerad översikt för HTS av molekyler mot jäst Hsp90-protein genom att anta malakitgrön analysmetod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratorieskala malakitgrön analys
- Beredning av analysbuffert
- Bered analysbufferten enligt den sammansättning och beredning som presenteras i tabell 1.
- Framställning av fosfatstandarder
- Använd 1 mM fosfatstandard, som tillhandahålls i malakitgrönt analysfosfatanalyskit (lagrat vid 4 °C).
- Pipettera 40 μL 1 mM fosfatstandard i 960 μL ultrarent vatten för erhållande av 40 μM fosfatlösning (förblandningslösning). Tillsätt förblandningslösningen med ultrarent vatten, enligt tillverkarens anvisningar, för att bilda en serieutspädning av fosfat från 0 till 40 μM.
- Framställning av jäst Hsp90
- Använd jäst Hsp90 med en glycerolhaltkoncentration på 0,66 mg / ml. Tina på is strax före användning.
- Använd 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) jäst Hsp90 för mätbar ATPas-aktivitet. Kontrollera att skillnaden i optisk densitet mellan blindprovet och den positiva kontrollen efter tillsats av malakitgrönt reagens är minst 0,5 och mindre än 1,0. Här befanns absorbansskillnaden mellan blindprovet (utan Hsp90) och den positiva kontrollen (med Hsp90) vara 0,510.
- Framställning av ATP
- Överför 1 mg ATP till en injektionsflaska innehållande 453,39 μl ultrarent vatten för att erhålla 4 mM stamlösning. Utför viktberäkningar baserade på vattenfri ATP (molekylvikt [m.w.] = 551,14). Förbered ATP färskt, eftersom det spontant kan hydrolysera över tiden.
- Tillsätt 4 μL ATP-stamlösning till varje brunn för att ge en slutlig brunnskoncentration på 0,2 mM (slutlig total analysbrunnsvolym på 80 μl). Tillsätt ATP som den sista komponenten i reaktionen med en flerkanalig pipett så att alla reaktioner startar samtidigt.
- Beredning av geldanamycin (GA)
- Bered ett 10 mM lager GA genom att lösa upp 1 mg i 178,37 μL DMSO (m.w. = 560,64). Bereda 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM och 0,00128 mM lösning i DMSO genom serieutspädning med stamlösningen.
- Tillsätt 2 μL av dessa stamlösningar till varje brunn för att erhålla en slutlig brunnskoncentration på 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM respektive 0,000032 mM.
- Förbered brunnarna enligt beskrivningen i tabell 2 och tabell 3, med brunnarna som innehåller blindprovet (buffert + vatten + DMSO) och negativ kontroll (Hsp90 i buffert + vatten + DMSO). Brunnarna som innehåller GA (Hsp90 i buffert + vatten + GA) fungerar som positiv kontroll.
- Beredning av brunnsplattor och tillsatsordning
- Förbered 96-brunnsplattor med layouten som presenteras i tabell 2. För föreningar som visar absorbans vid 620 nm, förbered en separat brunn för registrering av absorbansen vid denna våglängd. Bered inte en separat brunn för GA, eftersom GA inte visar absorbans vid 620 nm för den koncentration som används i analysen.
- Bered varje beståndsdel med den totala volymen av varje beståndsdel enligt tabell 3.
- Ställ in analysbrunnar genom att tillsätta ultrarent vatten till varje brunn. Därefter tillsätt den erforderliga mängden analysbuffert och en sammansatt lösning (till exempel GA-lösning).
- Tillsätt sedan Hsp90 till lämpliga brunnar och skaka plattorna i 2 minuter på en plattskakare vid rumstemperatur.
- Tillsätt 4 μL ATP-lösning med en flerkanalig pipett. Slå in plattan i aluminiumfolie och skaka i 2 minuter på en plattskakare (200 rpm) vid rumstemperatur. Inkubera plattan vid 37 °C i 3 timmar.
- Beredning och tillsats av malakitgrönt reagens
- Det malakitgröna reagenset består av reagenserna A (ammoniummolybdat i 3M HCl) och B (malakitgrönt och polyvinylalkohol). Ta reagenset till rumstemperatur före användning. Blanda reagenserna A och B i förhållandet 100:1 (1 000 μl:10 μl). Förbered detta inom 3 timmar före användning, eftersom det är instabilt och börjar sönderdelas efter 3 timmar.
- Efter 3 timmar av steg 1.6.5, stoppa reaktionen genom att tillsätta 20 μL malakitgrönt reagens, tillsatt i samma ordning som ATP, med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Efter en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur, mät plattans absorbans vid 620 nm i en plattläsare.
2. Screening med hög genomströmning av Hsp90-hämmare genom malakitgrön analys
OBS: Protokollet för screening med hög genomströmning liknar laboratorieskalningsmetoden. Den slutliga brunnsvolymen i varje fall är 80 μL. Det finns emellertid en liten skillnad i ordningen för tillsats av reagens. I den labskalabaserade metoden finns det fem steg av lösningstillsats (34 μL vatten, 32 μL buffert, 2 μL förening i DMSO, 8 μL Hsp90 och slutligen 4 μL ATP-lösning). Däremot finns det med HTS tre tillsatssteg (40 μL buffertlösning innehållande jäst Hsp90, 2 μL DMSO i 18 μL vatten innehållande föreningarna och slutligen 20 μL ATP upplöst i vatten). Den minsta mängd lösning som kan pipetteras exakt i HTS-installationen är 20 μl. Därför observeras en skillnad i pipettering mellan laboratorie- och HTS-skalor.
- Beredning av analysbuffert (pH 7,4)
- Använd samma buffert i HTS som för malakitgrön analys i labskala (tabell 1).
- Framställning av jäst Hsp90
- Använd protein med en glycerollagerkoncentration på 0,66 mg / ml. Tina på is strax före användning.
- Använd 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) jäst Hsp90 i varje brunn, vilket ger mätbar ATPas-aktivitet.
- Späd proteinet (8 μl) i buffert (32 μl) för varje brunn. Den slutliga totala arbetsvolymen för varje brunn är 40 μL i en total analysvolym på 80 μl.
- Framställning av 0,8 mM ATP
- Lös 1 mg ATP i 2 267 μl destillerat vatten så att en 0,8 mM lösning erhålls. Den totala arbetsvolymen för varje brunn är 20 μl i en total analysvolym på 80 μl.
- Beredning av geldanamycin (GA)/testföreningar
- Förbered ett 0,8 mM lager av GA i DMSO, som i steg 1.5. Späd 10 μL av GA-stammen med 90 μl vatten så att en slutlig koncentration på 80 μM erhålls.
- Använd 20 μl av 80 μM GA-lösningen i lämpliga analysbrunnar (slutlig total analysbrunnsvolym = 80 μl), vilket ger en slutlig brunnskoncentration på 20 μM. Detta fungerar som en positiv kontroll.
- För testföreningar, förbered lösningar i DMSO enligt önskad koncentration för utvärdering.
- Bered 10 μL DMSO i 90 μL vatten för tillsats till blindprov (buffert + vatten + DMSO) och negativa kontrollbrunnar (Hsp90 i buffert + vatten + DMSO). Bered testföreningarna på liknande sätt vid en slutlig koncentration på 100 μM i brunnen.
- Design av analysplattor och tillsatsordning
- Använd fyra huvudplattor, en sammansatt platta och fyra tilläggsplattor som innehåller lager av reagenser för att ställa in analysen (figur 2 och tabell 4).
- Dessutom tillsätts 90 μl analysbuffert i varje brunn på platta A. Dessutom platta B, tillsätt 90 μL buffert med Hsp90 i varje brunn. Dessutom tillsätts plattorna C och D 90 μL ATP respektive 90 μL malakitgrönt reagens i varje brunn (tabell 5 och tabell 6).
- Från tillsatsplatta A och platta B överförs 40 μl lösning från varje brunn till huvudplatta 1 och 2 respektive 3 och 4 med hjälp av ett automatiserat flerkanaligt doseringssystem. Här användes Biomek(R) FXP laboratorieautomationsarbetsstation (figur 2 och tabell 6).
- Överför 20 μl av lösningen från varje brunn på den sammansatta plattan till huvudplattorna 1, 2, 3 och 4 (figur 2). Skaka plattorna i 1 minut i en shaker (200 rpm).
- Överför 20 μl lösning från varje brunn på tillsatsplattan C (ATP) till huvudplattorna 1, 2, 3 och 4 (figur 2). Skaka plattorna i 1 minut i en shaker (200 rpm).
- Inkubera plattorna i 3 timmar vid 37 °C.
- Bered det malakitgröna reagenset enligt steg 1.7. Efter 3 timmar överförs 20 μl malakitgrönt reagens från tillsatsplatta D till brunnarna på huvudplattorna 1, 2, 3 och 4 (figur 2).
- Efter en 15 min inkubation vid rumstemperatur, mät plattans absorbans vid 620 nm i en plattläsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av analysen tolkas i termer av absorbans på grund av fri fosfatjonkoncentration. Absorbansen med fritt fosfat på grund av ATP-hydrolys av jästen Hsp90 vid 620 nm anses vara 100% ATPas-aktivitet eller nollprocentig proteinhämning. Hämningen av protein leder till att ATP-hydrolys upphör (mindre fritt fosfat). vilket återspeglas i termer av minskad absorbans vid 620 nm.
Resultat av malakitgrön analys i labskala
Standarddiagrammet för fosfatstandarden visas i figur 3. Aktiviteten hos Hsp90 mäts med avseende på dess förmåga att hydrolysera ATP till ADP och oorganiskt fosfat (Pi). En högre fri fosfatkoncentration leder till en ökning av komplex bildning med malakitgrön, vilket orsakar en intensiv grön färg detekterbar vid 620 nm (figur 4).
Den procentuella hämningen beräknas med följande ekvation:
% hämning 
Absorbansen av Hsp90 betraktades som nollprocentig hämning (100 % ATPas-aktivitet). Den procentuella ATPas-aktiviteten används för att mäta den dosberoende hämningen av proteinet av GA. Det observerades att GA hämmade proteinet på ett dosberoende sätt, med ett IC50-värde på 0,85 μM (figur 5 och tabell 7).
Sigmoidalkurvmetoden för grafprogramvara användes för att bestämma IC 50-värdet (koncentration vid vilken molekylerna uppvisar50 % av Hsp90 ATPas-aktiviteten).
Resultat av high-throughput screening (HTS) av Hsp90-hämmare genom malakitgrön analys
HTS utfördes med testföreningar (koderna 3–96) i två exemplar genom att GA (20 μM slutlig brunnskoncentration) användes som referensstandard. Absorbansen vid 620 nm av föreningarna var inte känd och därför registrerades absorptionen av föreningarna ensam (huvudplattorna 1 och 2; Figur 6). Absorbansvärdet för varje brunn på huvudplattorna 3 och 4 (med Hsp90; Figur 7) drogs av från motsvarande absorbans i plattorna 1 och 2 (förening ensam). Absorbansen av Hsp90 betraktades som 100% ATPas-aktivitet.
Den procentuella hämningen beräknades med följande formel:
% hämning
Koncentrationen 20 μM GA visade 75,82% hämning. En 100 μM förening 82 visade 100% hämning av jäst Hsp90-proteinet, medan föreningarna 6 och 95 uppvisade 73,07% respektive 62,88% hämning vid 100 μM (tabell 8). De andra föreningarna undertryckte proteinet med mindre än 50% vid 100 μM och ansågs vara inaktiva.
Figur 1: Reaktioner av malakitgrönt (MG) reagens. (A) Struktur av malakitgrön. B) Reaktioner mellan malakitgrönt reagens A (ammoniummolybdat i 3 M HCl) och Pi och efterföljande reaktion med reagens B (malakitgrönt i polyvinylalkohol). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Experimentellt schema för HTS-protokoll. Figuren visar ordningen för tillsats av reagens till huvudanalysplattan från tillsatsplattorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Standarddiagram för standardfosfatkoncentration. X-axeln representerar Pi-koncentrationen i mikromolar, och absorbansen vid 620 nm avbildas på Y-axeln. Felstaplarna representerar avvikelsen mellan de två provnumren (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Färgutveckling efter tillsats av malakitgrönt reagens. Den gröna färgen blir mer intensiv med hög fosfatkoncentration och mer ATPas-aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: IC50-beräkning för geldanamycin mot jäst Hsp90. Varje punkt är ett medelvärde av två bestämningar (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Färgutveckling efter tillsats av malakitgrönt reagens. (A) Färgutveckling i huvudplatta 1. Den rosa färgen i A11-brunnen beror på den sammansatta färgen. (B) Färgutveckling i huvudplatta 2. Den rosa färgen i A11-brunnen beror på föreningens färgade natur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Färgutveckling efter tillsats av malakitgrönt reagens. Färgutveckling efter tillsats av malakitgrönt reagens. (A) Färgutveckling i huvudplatta 3. (B) Färgutveckling i huvudplatta 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Stamlösning | Slutlig konc. | Utspädning (slutlig/lager) | Mängd som krävs för 100 ml buljong (spädning × total volym) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Ultrarent vatten | NA | NA | Lägg till 100 ml total volym |
Tabell 1: Beredning av analysbuffert.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Ultrarent vatten | Ultrarent vatten | Blank | Blank | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Negativ kontroll | Negativ kontroll | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Not: Den totala brunnsvolymen är 80 μl. PB = Fosfatbuffertstandard. | |||||
Tabell 2: Layouten på 96-brunnsplattan.
| # | Blank | Negativ kontroll | Jäst Hsp90 + GA |
| Analysbuffert | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Ultrarent vatten | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Total volym | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabell 3: Beståndsdel i varje brunn.
| Skylt-ID | Förklaring |
| 1 | Huvudplatta innehållande förening |
| 2 | Huvudplatta innehållande förening (duplikat av platta 1) |
| 3 | Huvudplatta med Hsp90 och förening |
| 4 | Huvudplatta med Hsp90 och förening (dubblett av platta 3) |
| CP | Sammansatt lösning |
| A | Buffertlösning |
| B | Buffertlösning med Hsp90 |
| C | ATP-lösning |
| D | Grönagets lösning för malakit |
| Obs: Alla plattor är 96-brunns transparenta. Huvudplatta: plattor där den slutliga ATPas-reaktionen äger rum. Platta CP, A, B, C och D är tilläggsplattor som innehåller specifika reagens. | |
Tabell 4: Typer av plattor som används i HTS-analysen.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | A | B | C | D | ||
| Förening / GA-lösning i 1:10 DMSO: vatten | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90-lösning: buffertlösning (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Buffertlösning | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Malakitgrönt reagens | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Total volym | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Not: GA = Geldanamycin. För tillsatsplattorna CP, A, B, C och D tas ytterligare 10 μL för perfekt överföring av lösningar till huvudplattorna. | |||||||||||
Tabell 5: Beståndsdel för varje brunn i HTS-protokollet.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Obs: 3-96 är sammansatta koder för utvärdering av Hsp90-hämningspotential. GA = Geldanamycin. W=Ultrarent vatten | ||||||||||||
Tabell 6: Brunnsplatta läggs ut för huvudplatta 1 och 2 (utan Hsp90) och 3 och 4 (med Hsp90).
| Tja beståndsdel | % ATPas-aktivitet* | % hämning |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Ett medelvärde av två oberoende bestämningar | ||
Tabell 7: Procentuell hämning och ATPas-aktivitet av geldanamycin.
| Tja beståndsdel | Abs (A) | Tja beståndsdel | Abs (B) | B-A | % ATPas-aktivitet* | % hämning |
| Blank | 0.281 | Negativ kontroll | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Förening 6 (100 μM) | 0.3 | Förening 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Förening 82 (100 μM) | 0.49 | Förening 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Förening 95 (100 μM) | 0.327 | Förening 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabell 8: Procentuell hämning och ATPas-aktivitet av geldanamycin och utvalda föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90 är ett viktigt mål för upptäckten av nya läkemedelsmolekyler mot cancer. Sedan dess läkemedelsförmåga etablerades 199410, 18 molekyler har nått kliniska prövningar. För närvarande befinner sig sju molekyler i olika faser av kliniska prövningar, antingen ensamma eller i kombination22. Alla sådana små molekyler är N-terminala ATP-bindande hämmare. De andra sätten att hämma chaperonen (C-terminala hämmare, mellandomänhämmare) har inte gått lika snabbt som N-terminala hämmare. Därför har de N-terminala ATP-bindande inhibitorföreningarna fortfarande löfte om progression till en kliniskt marknadsförbar molekyl. Vidare är den enda Hsp90-hämmaren, godkänd i juni 2022 (Pimitespib för behandling av GIST i Japan), en N-terminal ATP-bindande molekyl9. En enda molekyl har dock hittills inte nått ett säljbart stadium i andra delar av världen23,24. Det finns flera huvudorsaker till detta misslyckande, inklusive formuleringsproblem, kostnaden för att producera molekyler utöver toxicitet såsom ototoxicitet och kardiotoxicitet associerad med få föreningar. För att övervinna dessa biverkningar undersöks nu Hsp90 N-terminala selektiva hämmare (alfa och beta)25,26,27. All ovannämnda diskussion motiverar HTS-screening av föreningar, som kommer att undertrycka Hsp90-aktivitet genom att binda till dess ATP-bindningsklyfta.
Analyser för upptäckt av läkemedel måste vara snabba, kostnadseffektiva, känsliga, lätt reproducerbara och använda mindre farliga kemikalier och / eller förhållanden. Dessutom bör det bekvämt utföras i labbskala såväl som i en HTS-installation. En detaljerad analys av tillgängliga Hsp90 ATPas-hämmande analyser genomfördes, och malakitgrönt fosfatanalys befanns vara den mest lämpliga bland alla i den givna institutionella strukturen. De andra analyssystemen var inte automatiseringsvänliga i ett HTS-system (pyruvat/laktatdehydrogenaskopplat enzym)28,29; dyra som fluorescenspolarisationsanalys30, scintillationsnärhetsanalyser, ytplasmonresonansanalys och tidsupplöst fluorescensresonansenergiöverföring (TR-FRET)28,29; tidskrävande som (TR-FRET)28,29; eller hade strålningsrisker som scintillation, närhetsanalyser,28,29. Därför presenteras en enkel malakitgrön analys som en laboratorieskala eller HTS för identifiering av nya Hsp90 N-terminala ATP-bindningshämmare i detta protokoll.
Det största problemet i denna analys är kontaminering av buffertar och växtextrakt som ska utvärderas med fosfatjoner, vilket kan leda till falska resultat. Den icke-enzymatiska hydrolysen av ATP vid reaktionens pH kan också leda till falska resultat. De ovan nämnda problemen löstes med hjälp av fosfatfria buffertar (pH 7,4). Dessutom utfördes ett blindprov med buffert + vatten + DMSO och subtraherade därefter absorbansvärdet för de positiva kontroll-/provföreningarna från blindvärdet. En försiktighetsåtgärd som måste följas i denna analysprocedur är strikt efterlevnad av tillsats av reagens, som tillsats av ATP samtidigt till varje brunn via flerkanalig pipett. Detta är så att reaktionen startar samtidigt i varje brunn, samma inkubationstid, och därefter vid samma mätning av absorbansen efter tillsats av malakitgrönt reagens. ATPas-reaktionen är mycket tidskänslig, och därför kan en liten förändring i reaktionens initierings- och avslutningstid, inkubationstid och tid för registrering av absorbans drastiskt påverka analysresultaten. Vidare påverkar tillsatsen av 10 μL 34% natriumcitratlösning (som används för att släcka ATPas-reaktionen) linjäriteten hos standardkurvan och inkluderades därför inte i vårt analysprotokoll.
Den enda begränsningen av denna analys är utvärderingen av föreningar som visar absorbans högre än vad som visas av fritt fosfat frisatt från ATP av jästen Hsp90 vid 620 nm. Ett falskt positivt eller falskt negativt resultat kan uppstå i fallet med sådana föreningar. Chanserna att stöta på sådana föreningar är emellertid mycket sällsynta. Detta kan vara problematiskt vid utvärdering av växtextrakt och/eller fraktioner av dessa, särskilt när en blandning av föreningar förekommer.
Sammanfattningsvis genomfördes uppskalning från labbskala till HTS framgångsrikt med jäst Hsp90. Det stegvisa analysprotokollet på laboratorieskala såväl som i HTS kommer att hjälpa forskare över hela världen att anta denna procedur för upptäckten av nya Hsp90-hämmare. Dessutom kan protokollet anpassas för upptäckt av ATPas-hämmare mot andra ATP-beroende proteiner som Hsp70, Grp94, Lon-proteas, Proteas Ti, AAA-proteaser, etc31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoktor vid National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Författarna är tacksamma för KIST intramural grant och Ministry of Oceans and Fisheries grant nummer 2MRB130 för att ge ekonomiskt stöd till detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
