Summary
Papperet nedan presenterar ett protokoll för mätning av frögroning, planttillväxt och fysiologiska index för två pepparsorter med salthaltstoleransskillnader som svar på sex blandade saltkoncentrationer. Detta protokoll kan användas för att utvärdera salttoleransen för pepparsorter.
Abstract
För att bestämma salttoleransen och den fysiologiska mekanismen för peppar (Capsicum annuum L.) vid groningsstadiet används sorterna Hongtianhu 101 och Xinxiang 8, som har stora skillnader i salttolerans, som studiematerial. Sex blandade saltkoncentrationer på 0, 3, 5, 10, 15 och 20 g / L härledda med lika molförhållanden av Na2CO3,NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4 ochNa2SO4 används. För att bestämma deras effekter mäts de relaterade indexen för frögroning, planttillväxt och fysiologi, och salttolerans utvärderas omfattande med hjälp av medlemskapsfunktionsanalys. Resultaten visar att när den blandade saltkoncentrationen ökar minskar grobarheten, grobarhetsindexet, grobarheten, frögroningskraftindexet, rotlängden och rotfärskvikten hos de två sorterna avsevärt, medan den relativa salthastigheten gradvis ökar. Hypokotyllängden och färskvikten ovan jord ökar först och minskar sedan, medan malondialdehyd (MDA), prolin (Pro) innehåll, katalas (CAT), peroxidas (POD) och superoxiddismutas (SOD) aktivitet minskar och ökar sedan. Groningspotentialen, grobarhetsindexet, grobarhetshastigheten, frögroningskraftindex, rotlängd, rotfärskvikt, MDA- och Pro-innehåll och CAT-aktivitet för Hongtianhu 101-fröna är högre än för Xinxiang 8 för alla saltkoncentrationer som används här. Hypokotyllängd, färskvikt ovan jord och relativ salthastighet är dock lägre i Hongtianhu 101 än i Xinxiang 8. Den omfattande utvärderingen av salttolerans avslöjar att de totala viktade värdena för de två medlemskapsfunktionsindexen ökar först och sedan minskar när den blandade saltkoncentrationen ökar. Jämfört med 5 g / L, som har det högsta medlemskapsfunktionsvärdet, minskar indexet under saltkoncentrationer på 3 g / L, 10 g / L och 15 g / L med 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% respektive 41,4% -45,1%. Denna studie ger teoretisk vägledning för avel av salttoleranta pepparsorter och en analys av de fysiologiska mekanismerna som är involverade i salttolerans och salttolerant odling.
Introduction
Salthalt är en viktig begränsande faktor för grödans produktivitet över hela världen1. För närvarande påverkas nästan 19,5% av världens bevattnade mark och 2,1% av torr mark av salthalt, och cirka 1% av jordbruksmarken degenererar till saltlösning-alkalimark varje år. År 2050 förväntas 50% av åkermarken påverkas av försaltning 2,3. Förutom naturliga faktorer, såsom naturlig bergförväxling och salt regnvatten nära eller runt kusten, har snabb ytavdunstning, låg nederbörd och orimliga jordbruksmetoder förvärrat processen för markförsaltning. Jordförsaltning hämmar tillväxten av växtrötter och minskar absorptionen och transporten av vatten och näringsämnen från växtrötterna till bladen. Denna hämning resulterar i fysiologisk vattenbrist, näringsmässiga obalanser och jontoxicitet, vilket leder till minskad grödproduktivitet och en fullständig förlust av avkastning. Försaltningen av odlad mark blir gradvis en av de mest kritiska abiotiska stressfaktorerna som påverkar den globala jordbruksproduktionen4. Saltstress minskar den åkermark som är tillgänglig för jordbruk, vilket kan leda till en betydande obalans mellan utbud och efterfrågan på framtida jordbruksprodukter. Att utforska effekterna av markförsaltning på grödans tillväxt och fysiologiska och biokemiska mekanismer bidrar därför till att odla salttoleranta sorter, hållbart utnyttjande av saltlösning och säkerheten för jordbruksprodukter.
Peppar (Capsicum annuum L.) planteras över hela världen på grund av dess höga näringsmässiga och medicinska värde. Till exempel är capsaicin en alkaloid som är ansvarig för den kryddiga smaken av peppar. Capsaicin kan användas för smärtlindring, viktminskning, förbättra kardiovaskulära, mag-tarmkanalen, och andningsorganen, och i flera andra tillämpningar5. Peppar är också rik på bioaktiva ämnen, särskilt olika antioxidantföreningar (karotenoider, fenoler och flavonoider) och vitaminC 6. För närvarande rapporteras peppar vara grönsaksgrödan med det största odlingsområdet i Kina, med en årlig planteringsareal på mer än 1,5 x 106 ha, vilket står för 8% -10% av den totala grönsaksplanteringsarealen i Kina. Pepparindustrin har blivit en av de största grönsaksindustrierna i Kina och har det högsta produktionsvärdet7. Pepparodling utsätts emellertid ofta för en mängd olika biologiska (skadedjur och svampar) och abiotiska påfrestningar, särskilt saltstress, vilket har en direkt negativ inverkan på frögroning, tillväxt och utveckling, vilket resulterar i minskning av pepparfruktutbytet och kvaliteten8.
Frösprutning är det första steget i interaktion mellan växter och miljö. Frögroning är mycket känslig för fluktuationer i omgivande medier, särskilt marksaltstress, som kan utöva omvända effekter på fysiologi och metabolism och så småningom störa den normala tillväxten, utvecklingen och morfogenesen av grödor9. I tidigare studier undersöktes pepparfrögroning och planttillväxt under saltstress i stor utsträckning; De flesta studier använde dock NaCl som det enda saltet för stressinduktion10,11,12. Marksaltskador beror emellertid huvudsakligen på Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-, CO3 2- ochSO42- jontoxicitet genererad genom dissociation av natrium-, kalcium- och magnesiumsalter. På grund av synergin och antagonismen mellan joner kan effekterna av blandat salt och enstaka salt på grödans tillväxt och utveckling vara helt olika. Motsvarande egenskaper hos pepparfrögroning och tillväxt i blandat salt är emellertid fortfarande oklara. Därför används två pepparsorter med anmärkningsvärda skillnader i salttolerans som material i denna studie. Analys av effekterna av olika saltkoncentrationer på pepparfrögroning, tillväxt och fysiologiska och biokemiska index efter ekvimolär blandning av sju salter kan avslöja responsmekanismen för pepparfrögroning till salthaltsstress. Det kan också ge en teoretisk grund för odling av starka pepparplantor, liksom hög avkastning och högkvalitativ odling i saltlösning odlad mark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma svarsegenskaperna och interna mekanismer för pepparfrögroning och planttillväxt under olika blandade saltspänningar, vilket kan fungera som referensmetod för utvärdering av frösalttolerans.
1. Experimentell förberedelse
- Förbered grödor för sorter-Hongtianhu 101 med stark salttolerans och Xinxiang 8 med låg tolerans.
- Förbered 0,2% KMnO4-lösning som ett frödesinfektionsreagens. Väg först 4,0 g KMnO4 och tillsätt sedan 2 000 ml destillerat vatten.
OBS: Kaliumpermanganat är vanligtvis instabilt på grund av dess starka oxidation; Följaktligen bereds den omedelbart före användning. - Förbered de blandade salterna med sju salter, inklusive natriumkarbonat, natriumbikarbonat, natriumklorid, kalciumklorid, magnesiumklorid, magnesiumsulfat och natriumsulfat13. Tillsätt samma molära mängd av varje, som successivt står för 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% respektive 19,8% av det totala massförhållandet för de blandade salterna.
- Förbered petriskålar (engångsbruk) och filterpapper (medelhastighetskvalitativt filterpapper), båda med en diameter av 9 cm.
OBS: Materialet i petriskålen kan ändras; Diametern på petriskålen och filterpapperet måste dock vara densamma.
2. Fröblötläggning och förberedelse för spiring
- För fröoptimering, välj pepparfrön med jämn storlek och fulla partiklar från varje sort, med en genomsnittlig diameter på 4,2 mm respektive 3,7 mm för Hongtianhu 101 respektive Xinxiang 8 frön. Beräkna det totala antalet frön som valts enligt testarbetsbelastningen.
- För frödesinfektion, blötlägg utvalda pepparfrön i 0,2% KMnO4-lösning i 15 minuter och skölj sedan fem gånger med destillerat vatten.
- För fröblötläggning, överför de steriliserade fröna till destillerat vatten och låt dem suga i 24 timmar. Skölj frön flera gånger med destillerat vatten och torka för vidare användning.
OBS: Blötläggningstiden för frön för olika grödor kan variera.
3. Frögroning och tillväxt av plantor
- Bered sex koncentrationer av de blandade salterna: 0 (kontroll), 3, 5, 10, 15 och 20 g / L. Mät saltlösningens konduktivitet med hjälp av en konduktivitetsmätare; EC-värdena för lösningskonduktivitet är 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 respektive 15,22 ms / cm.
- För fröberedning, placera jämnt 40 pepparfrön i en petriskål med två lager filterpapper. Förbered fröna för sex experimentella behandlingar och upprepa varje behandling fem gånger.
- För frögroning, tillsätt en lämplig mängd av de sex blandade saltkoncentrationerna till petriskålen för att säkerställa att filterpapperet hålls fuktigt. Placera fröna i en luftinkubator vid 28 °C och 80% luftfuktighet för groning i mörkret.
- Efter frögroning, låt plantorna fortsätta växa i ljus (ljusintensitet på cirka 450 lux; ljuscykel på 12/12 timmar) i inkubatorn i 14 dagar efter sådd. Temperaturen och fuktigheten vid plantans tillväxtstadium måste vara desamma som de som används vid groningssteget.
- Fyll på lösningen i odlingsskålen var 12: e timme för att behålla ett fuktigt filterpapper och tvätta filterpapperet helt var 24: e timme med motsvarande koncentration av den blandade saltlösningen för att hålla en konstant blandad saltkoncentration i petriskålen.
OBS: Mängden saltlösning som tillsätts till våta frön kan justeras enligt frögronings- och tillväxtstadierna. Många metoder finns tillgängliga för att upprätthålla en konstant koncentration av saltlösningar i odlingsrätter. Förutom de metoder som beskrivs i detta experiment kan strategin att tillsätta destillerat vatten i vikt användas.
4. Mätning och beräkning av indikatorer
- Bestämning av frögroningsindex
- Bestäm groningshastigheten dagligen efter sådd, med radikelbrytande fröbeläggning som når halva frödiameterlängden som groningsmarkör.
- Beräkna grobarhet, grobarhet, relativ salthastighet, grobarhetsindex och frögroningskraftindex med hjälp av följande formler:
Grobarhet (%) = (antal normala groddfrön dag 7 efter sådd/antal testade frön) × 100
Grobarheten (%) = (antal normalt grodda frön dag 3 efter sådd/antal testade frön) × 100
Relativ salthastighet (%) = (kontrollgroningshastighet - behandlingsgroningshastighet)/kontrollgroningshastighet × 100
beräknas med hjälp av frösprutningshastigheten på dag 7 efter sådd
Grobarhetsindex (GI) = ∑ [Gt/Dt]
där Gt avser antalet frögroningar vid en tidsperiod (t) efter sådd och Dt avser motsvarande grodagar
Frögroningskraftindex (VI) = GI x S
där S är rotlängden
- Bestämning av tillväxtindex för plantor
- På dag 14 efter sådd väljer du slumpmässigt 10 representativa plantor från varje petriskål och mäter rotlängden och hypokotyllängden.
- Använd en kniv för att dela pepparplantorna i två delar: radikel och ovanjordiska delar. Ta bort vattnet från plantorna genom att torka och väga plantorna separat för att bestämma färskvikten.
- Bestäm antioxidantenzymaktiviteten, malondialdehyd (MDA) -nivån och prolinhalten (Pro) i peppar enligt följande.
- För att bevara pepparplantorna, välj representativa hela pepparplantor (ca 24,0 g) från varje behandling på dag 14 efter sådd. Efter avlägsnande av ytvattnet, frys omedelbart plantorna i flytande kväve i 1 minut och förvara dem i kylskåp vid en extremt låg temperatur (-80 °C).
OBS: Provantalet pepparplantor som lagras i kylskåpet med ultralåg temperatur bör vara tillräckligt, om vissa indikatorer behöver testas igen. - Hämta cirka 1,0 g plantprov från varje behandling som samlats in i tre exemplar. Placera plantprovet i ett centrifugrör, tillsätt flytande kväve och slipa provet med en slipstång för att bestämma plantornas fysiologiska index. De fastställda indexen och mätschemat visas nedan.
- Bestäm plantans skyddande enzymaktivitet (peroxidas [POD], katalas [CAT], superoxiddismutas [SOD]), malondialdehyd (MDA) och prolin (Pro) innehåll med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (spektrofotometribaserat) för varje faktor14.
OBS: Tidigare observationer visade ingen skillnad i saltspänning mellan 15 och 20 g / L blandade saltkoncentrationer. Som ett resultat mäts endast fem saltkoncentrationer (0, 3, 5, 10 och 15 g / L).
- För att bevara pepparplantorna, välj representativa hela pepparplantor (ca 24,0 g) från varje behandling på dag 14 efter sådd. Efter avlägsnande av ytvattnet, frys omedelbart plantorna i flytande kväve i 1 minut och förvara dem i kylskåp vid en extremt låg temperatur (-80 °C).
- Omfattande utvärdering av salttolerans med hjälp av medlemskapsfunktionsmetoden
OBS: Medlemskapsfunktionen använder en fuzzy matematikmetod, som omvandlar kvalitativ utvärdering till kvantitativ utvärdering15, för att utvärdera en mängd olika fysiologiska index som påverkas av saltskador.- Beräkna värdet på medlemskapsfunktionen med följande formel av Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Om en egenskap är negativt korrelerad med salttolerans, beräkna den inversa medlemskapsfunktionen med:
Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Ackumulera medlemskapsvärdena för varje fysiologiskt index, där Xi är det uppmätta värdet för en viss egenskap, Xmax och Xmin är maximi- respektive minimivärdena för Xi och Ri är medlemsvärdet för den egenskapen. - Inkludera följande relevanta indikatorer: frögroningsegenskaper (grobarhet, grobarhet, grobarhetsindex och frögroningskraftindex), plantornas tillväxtegenskaper vid groningsstadiet (rotlängd, hypokotyllängd, rotfärskvikt och färskvikt ovan jord), MDA, Pro och skyddande enzymaktivitet (CAT, POD, SOD) för beräkning av medlemskapsfunktionsvärde. Värdena för medlemskapsfunktionen hämtas från varje indikator.
- Beräkna värdet på medlemskapsfunktionen med följande formel av Zhoubin Liu et al.15:
- Använd kalkylblad och SPSS-programvara (version 22.0) för att analysera och bearbeta testdata och tillämpa LSD-metoden (least significant difference) för flera jämförelser för att identifiera signifikanta skillnader. Använd Pearsons korrelationsanalys för att undersöka korrelationen mellan frögroning och plantorfysiologiska index för peppar under sammansatt saltstress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Egenskaper för frösprutning
När den blandade saltkoncentrationen ökar minskar spridningspotentialen och grobarhetsindexet för Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 avsevärt. Båda sorterna har en kraftig minskning av saltkoncentrationerna från 0-3 g / L och en långsam och stadig nedgång för saltkoncentrationer från 3-20 g / L (figur 1A, B). Groningshastigheten för de två sorterna minskar gradvis när de blandade saltkoncentrationerna ökar och den relativa salthastigheten för sorterna ökar gradvis. Det finns ingen signifikant skillnad i grobarhetshastighet och relativ salthastighet vid saltkoncentrationer på 3-15 g / L. Skillnaden är dock signifikant vid alla andra saltkoncentrationer (figur 1C,D). När det gäller salttolerans mellan de två sorterna är grobarheten, grobarhetsindexet och grobarheten för Hongtianhu 101-frön med ökande blandade saltkoncentrationer högre än för Xinxiang 8, medan den relativa salthastigheten är lägre än för Xinxiang 8.
När den blandade saltkoncentrationen ökar (0-15 g / L) minskar frögroningskraftindexet för de två sorterna avsevärt. När den blandade saltkoncentrationen är 15 g / L minskar frögroningskraftindexet för Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 med 91,0% respektive 94,6% jämfört med kontrollen. Observera att minskningen inte är signifikant när den blandade saltkoncentrationen ökar ytterligare från 15 till 20 g / L. Frögroningskraftindexet för Hongtianhu 101 är högre än för Xinxiang 8 vid varje blandad saltkoncentrationsnivå (figur 1E).
Plantor tillväxt egenskaper
När den blandade saltkoncentrationen ökar (0-15 g / L) minskar rotlängden och rotfärskvikten för Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 avsevärt. När den blandade saltkoncentrationen är 15 g / L minskar rotlängden för Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 med 89,4% respektive 91,1%, och rotfärskvikten minskar med 81,7% respektive 71,2% jämfört med kontrollens. Men när saltkoncentrationen är 15-20 g / L förändras inte rotlängden och rotfärskvikten för de två sorterna signifikant (figur 2A, C). Rotlängden och rotfärskvikten för Hongtianhu 101 är i allmänhet högre än för Xinxiang 8 med ökande blandade saltnivåer, med uppenbara skillnader vid koncentrationer från 0 till 10 g / L.
Hypokotyllängden och färskvikten ovan jord av de två sorterna ökar och minskar sedan med ökande blandad saltkoncentration. Båda indexen når sina högsta värden vid en saltkoncentration på 5 g / L. På samma sätt, när saltkoncentrationen är 15-20 g / L, minskar hypokotyllängden och färskvikten ovan jord för de två sorterna något. Baserat på sortskillnaderna är hypokotyllängden och färskvikten ovan jord för Xinxiang 8 högre än för Hongtianhu 101 vid varje saltkoncentration (figur 2B, D).
Innehåll av membranlipidperoxidation och osmotisk justering
När den blandade saltkoncentrationen ökar minskar MDA- och Pro-innehållet i de två sorterna och ökar sedan. MDA- och Pro-halterna når sina lägsta värden vid koncentrationer på 5 g/l respektive 3 g/l (figur 3A,B). MDA-halten minskar något vid saltkoncentrationer på 0-5 g/L och ökar snabbt vid 10 g/L. Jämfört med 5 g/L-behandlingen ökar MDA-halten efter 10 g/L-behandlingen med 59,9%-64,8% och förblir sedan oförändrad. MDA-halten i Hongtianhu 101 är högre än i Xinxiang 8 vid olika saltkoncentrationer (figur 3A). Minskningen av Pro-innehållet vid 0-3 g / L är inte signifikant och liten skillnad finns mellan de två sorterna. När saltkoncentrationen är 3-15 g / L ökar Pro-innehållet i Xinxiang 8 långsamt och förblir relativt stabilt, medan Pro-innehållet i Hongtianhu 101 ökar snabbt. Jämfört med 3 g / L ökar Pro-innehållet i Hongtianhu 101 signifikant med 440,2% vid 15 g / L (figur 3B).
Skyddande enzymaktivitet
När den blandade saltkoncentrationen ökar minskar CAT-, POD- och SOD-aktiviteterna hos plantorna av Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 och ökar sedan, med de lägsta värdena erhållna vid en koncentration av 3 g / L (figur 4A-C). CAT- och POD-aktiviteterna för de två sorterna varierar något vid saltkoncentrationer på 0-5 g / L, och skillnaden mellan dem är liten. Därefter ökar CAT- och POD-aktiviteterna för de två sorterna avsevärt med ökande saltkoncentration. Vidare är CAT- och POD-aktiviteterna för Hongtianhu 101 högre än för Xinxiang 8, och skillnaden mellan dem ökar gradvis (figur 4A, B). SOD-aktiviteten hos de två sorterna varierar något vid saltkoncentrationer från 0-10 g / L och ökar sedan snabbt. SOD-aktiviteten för Xinxiang 8 är högre än för Hongtianhu 101 vid saltkoncentrationer från 0-10 g / L; för de återstående koncentrationerna är dess aktivitet lägre än för Hongtianhu 101 (figur 4C).
Korrelationsanalys av frögroningsindex för peppar och omfattande utvärdering av saltstress
Korrelationsanalys (tabell 1) avslöjar att rotlängden och rotfärskvikten för plantans tillväxtkaraktäristiska index är signifikant positivt korrelerade med grobarhetsindexen (grobarhetspotential, grobarhetshastighet, grobarhetsindex, frögroningskraftindex etc.); Ingen uttrycklig relevans finns dock mellan hypokotyllängden, färskvikten ovan jord och grobarhetsindex. En signifikant negativ korrelation finns mellan indexen för plantornas tillväxtegenskaper och aktiviteten hos skyddande enzymer (CAT, POD och SOD). En signifikant negativ korrelation finns också mellan hypokotyllängden och innehållet i MDA och Pro, och mellan skottets färskvikt och MDA-innehållet. Med undantag för den signifikanta korrelationen mellan frögronings kraftindex och skyddande enzymaktivitet finns ingen signifikant korrelation mellan grobarhetskarakteristikindex och plantorfysiologiska index (skyddande enzymaktivitet och MDA- och Pro-innehåll).
Salttoleransen för de två pepparsorterna under sammansatt saltstress utvärderas med hjälp av medlemskapsfunktionsmetoden för flera egenskaper. Eftersom pepparplantorna inte utsätts för saltstress när den blandade saltkoncentrationen är 0 g / L, beräknas inte deras medlemsfunktionsvärde. Som ett resultat bedöms endast behandlingen med saltstress med hjälp av medlemskapsfunktionsanalys. MDA har visat sig vara negativt korrelerad med salttoleransen hos pepparplantor och beräknas med hjälp av den inversa medlemskapsfunktionsmetoden; Andra index beräknas med hjälp av medlemskapsfunktionsmetoden. Tabell 2 visar att när koncentrationen av blandat salt ökar ökar och minskar de totala viktade värdena för varje indexfunktion för de två sorterna och når slutligen ett maximum vid en saltkoncentration på 5 g/l. Jämfört med behandlingen med 5 g/l är de värden som erhålls med 3 g/l, 10 g/l, och 15 g / L saltkoncentrationsbehandlingar minskar med 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% respektive 41,4% -45,1%. Därför kan salttoleransen för peppar som utsätts för 5 g / L, 3 g / L, 10 g / L och 15 g / L saltkoncentrationsbehandlingar kategoriseras som bäst, näst bästa, dåliga respektive värsta.
Figur 1: Effekter av ökande blandade saltkoncentrationer på frögroning av peppar . (A), (B), (C), (D) och (E) representerar responsegenskaperna hos pepparfrögroningspotential, grobarhetsindex, grobarhet, relativ salthastighet respektive frögroningskraftindex för sammansatt saltstress. Olika små bokstäver i figuren indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar, som analyseras med Tukeys multipelintervalltest (p < 0,05). Felstaplar indikerar standardavvikelser (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekter av ökande blandade saltkoncentrationer på frögroning och morfologiska index för peppar . (A), (B), (C) och (D) representerar responsegenskaperna hos pepparplantans rotlängd, hypokotyllängd, rotfärskvikt respektive färskvikt ovan jord till sammansatt saltstress. Olika små bokstäver i figuren indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar, som analyseras med Tukeys multipelintervalltest (p < 0,05). Felstaplar indikerar standardavvikelse (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekter av ökande blandade saltkoncentrationer på MDA - och Pro-innehåll av pepparplantor. (A) och (B) representerar responsegenskaperna hos pepparplantans MDA- respektive Pro-innehåll för sammansatt saltstress. Olika små bokstäver i figuren indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar, som analyseras av Tukeys multipelintervalltest (p < 0,05). Felstaplar indikerar standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekter av ökande blandade saltkoncentrationer på CAT-, POD- och SOD-aktiviteter hos pepparplantor. (A), (B) och (C) representerar responsegenskaperna hos pepparplantans CAT-, POD- och SOD-aktiviteter för sammansatt saltstress. Olika små bokstäver i figuren indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar, som analyseras med Tukeys multipelintervalltest (p < 0,05). Felstaplar indikerar standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Korrelationsanalys mellan peppargroning och fysiologiska indikatorer under sammansatt saltstress (n = 30). Pearsons korrelationsanalys används för att undersöka korrelationen mellan frögroning och plantorfysiologiska index för peppar under sammansatt saltstress. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Det viktade medlemskapsfunktionsvärdet för peppargroning och plantors fysiologiska indikatorer under blandad saltstress. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna forskningsmetod består av fyra viktiga steg som påverkar noggrannheten i de experimentella resultaten. För det första, på grund av den dåliga upplösningen av blandade salter orsakad av det ökade lösta innehållet i lösningar med hög saltkoncentration och den låga lösligheten hos reagens såsom kalciumklorid, som är svårare att solubilisera i vatten, måste de vägda reagenserna vara helt malda i en murbruk. Vidare måste reagenserna lösas upp via ultraljudsvågor innan kapaciteten bestäms. För det andra måste den konfigurerade saltlösningen skakas fullständigt varje gång och läggas till petriskålen för användning. För det tredje måste petriskålarna behålla ett lämpligt vattenskikt efter tillsats av saltlösningen, och vattenstatusen för varje petriskål måste vara relativt konsekvent. Slutligen måste ljusförhållandena vara konsekventa efter frösprutning.
I denna studie kan antalet testfrön i en enda petriskål justeras genom att variera diametern på den valda petriskålen. Beroende på den specifika situationen med marksaltstress i olika planteringsområden kan andelen av varje enskild salttillsats justeras för att möjliggöra överensstämmelse med den faktiska situationen med saltstress i den lokala jorden. Även om denna metod är praktisk, för mindre frön (som raps, isväxt och amarant) eller större frön (som svärdbönor och bondbönor), leder problem som operativa svårigheter vid bestämning av plantornas längd och färskvikt, eller tillgången på mycket få frön i en enda odlingsrätt för att upprepa data, till svårigheter att studera salttolerans med denna metod.
Metoden som beskrivs här används för att bestämma frögroningsegenskaper och plantortillväxt under olika blandade saltkoncentrationer och avslöja förändringsmekanismen genom intern fysiologisk enzymaktivitet, vilket är av stor betydelse för objektiv utvärdering av fröns salttoleransegenskaper. Denna teknik kan ge en teknisk referens för utvärdering av salttolerans för andra grödor. Frösprutning och plantortillväxt är de stadier där grödor är mest känsliga för saltstress. Således kan denna metod effektivt ge en referens för salttolerant odling och växtförädling.
I de flesta grödor kan saltstress hämma frögroning och planttillväxt under biotisk stress. Sådan hämning kan bero på en minskning av upptaget av frövatten genom att minska saltlösningens osmotiska potential under saltlösningsförhållanden. Saltjonstress och toxicitet kan förändra aktiviteten hos skyddande enzymer (POD, CAT, SOD, etc.) och proteinmetabolism under frögroning och förstöra endogen hormonbalans11,16. Zhani et al. rapporterade att groningsprocessen huvudsakligen förändrades av en minskad grobarhet och långvarig groning under salt (NaCl) stress. Vidare hittades en signifikant skillnad i grobarheten mellan olika sorter (10% -50%) vid en saltkoncentration av 8 g / L17. Den aktuella studien avslöjar också att när den blandade saltkoncentrationen ökar minskar grobarheten, grobarhetsindexet, grobarhetshastigheten och frögroningskraftindexet för Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 avsevärt och den relativa salthastigheten ökar gradvis. Enligt Patanè et al., även om saltstress förlängde groningstiden för söta sorghumfrön, hade ökad saltstress en negativ effekt på den slutliga groningen av frön18. Relaterade studier tyder dock på att NaCl-behandling kan främja pepparfrögroning och tillväxt19, vilket kan relateras till skillnader i saltkoncentrationsnivåer.
Att öka nivån av saltstress har en signifikant effekt på tillväxten av pepparplantor, och baserat på denna studie minskade rotlängden och rotfärskvikten hos de två sorterna signifikant med ökande blandade saltkoncentrationer. Detta fynd liknar Mirosavljević et al., som föreslog att rotlängd och rotvikt minskade när saltstressen ökade, och skillnaderna mellan behandlingarna var signifikanta20. Detta resultat indikerar att rotsystemet placerades i jordmediet i direkt kontakt med jordlösningen, och rotlängden och rotvikten var mer känsliga för NaCl osmotisk stress. Rotlängd och rotvikt är viktiga indikatorer på växtrespons på saltstress. Enligt denna studie, när saltkoncentrationen ökar, ökar hypokotyllängden och färskvikten hos de ovanjordiska delarna och minskar sedan, med maximala värden uppnådda vid 5 g / L. Khan et al. föreslog också att när salthalten (NaCl) ökar (0-9 ms / cm) ökar skottlängden på peppar först och minskar sedan, med bästa prestanda erhållen vid 3 ms / cm12, 21. Konduktiviteten av saltkoncentrationen i denna studie var 4,73 ms/cm när värdet av plantornas hypokotyllängd och färskvikt ovan jord var högst, vilket är högre än det värde som rapporterats av Khan et al.21. Detta resultat kan bero på den höga toleransen för peppar ovan jord till sammansatt saltstress jämfört med enkel saltstress.
Saltstress hindrar inte bara grödans tillväxt utan orsakar också betydande fysiologiska förändringar i växter. Saltstress kan öka nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS). Om ROS inte rensas i tid kan membranlipidperoxidation och oxidativ stress, vilket kan orsaka allvarliga skador på växtcellmembranet, uppstå. MDA är den slutliga metaboliten av membranlipidperoxidation, och intracellulär MDA-koncentration används ofta som en indikator för att bedöma graden av skador på växter under stress22. I den aktuella studien, när den blandade saltkoncentrationen ökar, minskar MDA-halten i plantorna av de två sorterna först och ökar sedan. Observera att minskningen inte är signifikant vid saltkoncentrationer som sträcker sig från 0-5 g / L. En snabb ökning observeras dock från 5-10 g / L. Därefter förblir värdena oförändrade, vilket indikerar att graden av membranlipidperoxid hos pepparfrön förändras från generell till snabbt ökande till stabil. Saltstress spekuleras ha en allvarlig inverkan på cellmembranets permeabilitet när den blandade saltkoncentrationen är större än 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. rapporterade en liknande slutsats om en minskning och sedan en ökning av membranlipidperoxidnivån i paprikaplantor när NaCl-koncentrationen ökade (0-50 nmol / L). Vidare var nivån av lipidperoxidation lägst vid 25 nmol / L NaCl23.
Växter har utvecklat flera strategier för att hantera saltstress. Å ena sidan förbättrar grödor proteinstabilitet och membranintegritet genom att öka osmotiska justeringsämnen, såsom prolin, och minska förlusten av intracellulärt vatten, vilket förbättrar salttoleransen24. I den aktuella studien, när den blandade saltkoncentrationen ökar, minskar Pro-innehållet i Xinxiang 8 och Hongtianhu 101 plantor först och ökar sedan. Noterbart är att minskningen inte är signifikant vid koncentrationer på 0-3 g / L och skillnaden mellan de två sorterna är inte signifikant, i linje med de experimentella resultaten från Muchate et al25. Pro-innehållet i pepparsorten Hongtianhu 101 med god salttolerans ökar också snabbt vid saltkoncentrationer på 3-15 g / L. Jämfört med 3 g / L ökar Pro-innehållet på 15 g / L signifikant med 440,2%, medan Pro-innehållet i Xinxiang 8 med allmän salttolerans ökar långsamt och upprätthåller en relativt stabil nivå vid saltkoncentrationer på 3-15 g / L. Den rensande effekten av antioxidantenzymerna på ROS inducerad av saltstress har visat sig vara huvudkomponenten i grödans försvarsmekanismer. Aktiviteterna för CAT, POD och SOD har rapporterats öka under olika saltstressmiljöer, vilket förbättrar dess salttolerans25,26. visade att när NaCl-koncentrationen ökar ökar aktiviteterna av SOD, POD och CAT vid groning av tomatfrö gradvis, utan någon signifikant skillnad i varje index efter behandling med 0-50 nmol / L NaCl27. Denna studie visar också att när den blandade saltkoncentrationen ökar minskar aktiviteterna för CAT, POD och SOD i plantorna av Hongtianhu 101 och Xinxiang 8 och ökar sedan. Vid låga saltkoncentrationer (0-3 g / L) förändras inte aktiviteten hos antioxidantenzymer signifikant, och en ytterligare ökning av saltkoncentrationen förbättrar salttoleransen.
Grödornas anpassningsförmåga och responsegenskaper till saltstress återspeglas huvudsakligen i morfologi, struktur, fysiologisk ekologi etc. En omfattande utvärdering av sammansatt saltspänning utförs med hjälp av medlemskapsfunktionsvärdemetoden för flera egenskaper. Denna studie visar att när koncentrationen av blandat salt ökar ökar det totala viktade värdet av funktionsvärdet först och minskar sedan. De två sorterna når ett maximum vid 5 g / L, vilket leder till den bästa salttoleranseffekten. Jämfört med 5 g / L-behandlingen minskar de viktade värdena efter behandling med saltkoncentrationerna på 3 g / L, 10 g / L och 15 g / L med 4,7%, 25,3% respektive 41,4% för Hongtianhu 101 respektive 11,1%, 28,3% respektive 45,1% för Xinxiang 8. Sådana fynd indikerar att salttoleransen för Hongtianhu 101 är högre än för Xinxiang 8.
Denna studie ger en omfattande beskrivning av effekterna av olika koncentrationer av sammansatt saltstress på pepparfrögroning och dess fysiologiska enzymaktiviteter och en teknisk referens för forskning om salttolerans i andra grödor. Pepparplantor påverkas mindre av saltstress under simulerade blandade saltkoncentrationer (0-5 g / L). Frögroning, radikelförlängning och plantmorfogenes av peppar hämmas signifikant under hög saltstress (>5 g / L), vilket orsakar allvarlig membranlipidperoxidation i pepparplantor. Grödor minskar de negativa effekterna av saltstress genom att öka deras Pro-innehåll och förbättra aktiviteten hos skyddande enzymer (CAT, POD och SOD). Under saltstress är prolinhalten och den skyddande enzymaktiviteten hos Hongtianhu 101-plantor högre, graden av membranlipidperoxidation är lägre och frösprutning och planttillväxt är mer uppenbara än för Xinxiang 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av vetenskaps- och teknikavdelningen i Jiangxi-provinsen (20203BBFL63065) och det allmänna projektet för vetenskaps- och teknikforskningsprojekt vid Jiangxi Education Department (GJJ211430). Vi vill tacka Editage (www.editage.cn) för engelskspråkig redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
- Szabolcs, I. Soils sand salinisation. Handbook of Plant and Crop Stress. , Marcel Dekker. New York. 3-11 (1994).
- Global network on integrated soil management for sustainable use of salt effected soils. FAO. , Available from: http://www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm (2005).
- Lakhdar, A., et al. Effectiveness of compost use in salt-affected soil. Journal of Hazardous Materials. 171 (1-3), 29-37 (2009).
- Cheng, Z., Chen, Y., Zhang, F. Effect of cropping systems after abandoned salinized farmland reclamation on soil bacterial communities in arid northwest China. Soil and Tillage Research. 187, 204-213 (2019).
- Shrivastava, P., Kumar, R. Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi Journal of Biological Sciences. 22 (2), 123-131 (2015).
- Fattori, V., Hohmann, M. S., Rossaneis, A. C., Pinho-Ribeiro, F. A., Verri, W. A. Capsaicin: Current understanding of its mechanisms and therapy of pain and other pre-clinical and clinical uses. Molecules. 21 (7), 844-878 (2016).
- Zhao, Z., et al. Investigation, collection and identification of pepper germplasm resources in Guangxi. Journal of Plant Genetic .Resources. 21 (4), 908-913 (2020).
- Zhang, J., et al. Biochar alleviated the salt stress of induced saline paddy soil and improved the biochemical characteristics of rice seedlings differing in salt tolerance. Soil and Tillage Research. 195, 104372-104381 (2019).
- Ashraf, M., Foolad, M. R. Pre-sowing seed treatment-A shotgun approach to improve germination, plant growth, and crop yield under saline and non-saline conditions. Advances in Agronomy. 88, 223-271 (2005).
- Esra, K. O. Ç, Üstün, A. S., İşlek, C., Arici, Y. K. Effect of exogenously applied spermine and putrescine on germination and in vitro growth of pepper (Capsicum annuum l.) seeds under salt stress. Anadolu University Journal of Science and Technology C-Life Sciences and Biotechnology. 3 (2), 63-71 (2014).
- Demir, I., Mavi, K. Effect of salt and osmotic stresses on the germination of pepper seeds of different maturation stages. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51 (5), 897-902 (2008).
- Khan, H. A., et al. Effect of seed priming with NaCl on salinity tolerance of hot pepper (Capsicum annuum L.) at seedling stage. Soil and Environment. 28 (1), 81-87 (2009).
- Zhou, L. L. Effects of salinity stress on cotton (Gossypium hirsutum L.) root growth and cotton field soil micro-ecology. Nanjing Agricultural University. , (2010).
- Ding, D. X., et al. Exogenous zeaxanthin alleviates low temperature combined with low light induced photosynthesis inhibition and oxidative stress in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Current Issues in Molecular Biology. 44 (6), 2453-2471 (2022).
- Liu, Z. B., Yang, B. Z., Ou, L. J., Zou, X. X. The impact of different Ca2+ spraying period on alleviating pepper injury under the waterlogging stress. Acta Horticulturae Sinica. 42 (8), 1487-1494 (2015).
- Aloui, H., Souguir, M., Latique, S., Hannachi, C. Germination and growth in control and primed seeds of pepper as affected by salt stress. Cercetări agronomice în Moldova. 47 (3), 83-95 (2014).
- Zhani, K., Elouer, M. A., Aloui, H., Hannachi, C. Selection of a salt tolerant Tunisian cultivar of chili pepper (Capsicum frutescens). EurAsian Journal of Biosciences. 6, 47-59 (2012).
- Patanè, C., Saita, A., Sortino, O. Comparative effects of salt and water stress on seed germination and early embryo growth in two cultivars of sweet sorghum. Journal of Agronomy and Crop Science. 199 (1), 30-37 (2013).
- Smith, P. T., Cobb, B. G. Accelerated germination of pepper seed by priming with salt solutions and water. Hortscience. 26 (4), 417-419 (2019).
- Mirosavljević, M., et al. Maize germination parameters and early seedlings growth under different levels of salt stress. Ratarstvo i Povrtarstvo. 50 (1), 49-53 (2013).
- Khan, H. A., et al. Hormonal priming alleviates salt stress in hot pepper (Capsicum annuum L.). Soil and Environment. 28 (2), 130-135 (2009).
- Zhang, B. B., et al. Effects of simulated salinization on seed germination and physiological characteristics of muskmelon seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops. 41 (5), 912-920 (2020).
- Guzmán-Murillo, M. A., Ascencio, F., Larrinaga-Mayoral, J. A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (Capsicum annuum L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts. Protoplasma. 250 (1), 33-42 (2013).
- Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., Savoure, A. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany. 115 (3), 433-447 (2015).
- Muchate, N. S., Nikalje, G. C., Rajurkar, N. S., Suprasanna, P., Nikamd, T. D. Physiological responses of the halophyte Sesuvium portulacastrum to salt stress and their relevance for saline soil bio-reclamation. Flora. 224, 96-105 (2016).
- Javed, S. A., et al. Can different salt formulations revert the depressing effect of salinity on maize by modulating plant biochemical attributes and activating stress regulators through improved N supply. Sustainability. 13 (14), 8022-8037 (2021).
- Chen, J., et al. Effects of salt stress on form of polyamine and antioxidation in germinating tomato seed. Acta Pedologica Sinica. 58 (6), 1598-1609 (2021).
