Summary
वर्तमान अध्ययन में, फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल (एफआईटीसी) डेक्सट्रान को मौखिक गैवेज के माध्यम से चूहों को विवो और प्लाज्मा और फेकल नमूनों दोनों में आंतों की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए प्रशासित किया जाता है। चूंकि कई रोग प्रक्रियाओं में आंत बाधा समारोह प्रभावित होता है, इस प्रत्यक्ष और मात्रात्मक परख का उपयोग विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में किया जा सकता है।
Abstract
आंत बाधा अखंडता आंतों के स्वास्थ्य की एक पहचान है। जबकि आंत बाधा अखंडता का मूल्यांकन अप्रत्यक्ष मार्करों जैसे प्लाज्मा भड़काऊ मार्करों के माप और प्लीहा और लिम्फ नोड्स में जीवाणु स्थानांतरण का उपयोग करके किया जा सकता है, स्वर्ण मानक सीधे प्रणालीगत परिसंचरण की ओर आंत म्यूकोसल परत को पार करने के लिए चयनित अणुओं की क्षमता को निर्धारित करता है। यह लेख एक गैर-इनवेसिव, लागत प्रभावी और कम बोझ वाली तकनीक का उपयोग करता है ताकि फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) का उपयोग करके चूहों में आंतों की पारगम्यता को वास्तविक समय में निर्धारित और पालन किया जा सके। एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ मौखिक पूरक से पहले, चूहों को उपवास किया जाता है। फिर उन्हें फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में पतला एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ जोड़ा जाता है। गैवेज के एक घंटे बाद, चूहों को आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके सामान्य संज्ञाहरण के अधीन किया जाता है, और विवो फ्लोरेसेंस को एक इमेजिंग कक्ष में देखा जाता है। इस तकनीक का उद्देश्य पेट की गुहा और यकृत अपटेक में अवशिष्ट प्रतिदीप्ति का आकलन करना है, जो फ्लोरोसेंट जांच के पोर्टल माइग्रेशन का संकेत है। मौखिक गैवेज के 4 घंटे बाद रक्त और मल के नमूने एकत्र किए जाते हैं, और चूहों की बलि दी जाती है। पीबीएस में पतला प्लाज्मा और फेकल नमूने तब चढ़ाए जाते हैं, और प्रतिदीप्ति दर्ज की जाती है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान की एकाग्रता की गणना तब एक मानक वक्र का उपयोग करके की जाती है। पिछले शोध में, विवो इमेजिंग में दिखाया गया है कि प्रतिदीप्ति कम फाइबर आहार से प्रेरित कमजोर आंत बाधा के साथ चूहों में यकृत में तेजी से फैलती है, जबकि आंत बाधा को मजबूत करने के लिए फाइबर के साथ पूरक चूहों में, फ्लोरोसेंट सिग्नल ज्यादातर जठरांत्र संबंधी मार्ग में बरकरार रहता है। इसके अलावा, इस अध्ययन में, नियंत्रण चूहों ने प्लाज्मा फ्लोरेसेंस को ऊंचा किया था और मल में प्रतिदीप्ति को कम किया था, जबकि विपरीत, इनुलिन-पूरक चूहों में आंत में प्रतिदीप्ति संकेतों का उच्च स्तर और प्लाज्मा में निम्न स्तर था। सारांश में, यह प्रोटोकॉल आंत के स्वास्थ्य के लिए मार्कर के रूप में आंतों की पारगम्यता के गुणात्मक और मात्रात्मक माप प्रदान करता है।
Introduction
आंत बाधा स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके लिए आवश्यक पोषक तत्वों को आंतों के लुमेन से परिसंचरण में प्रवेश करने की अनुमति देने के बीच एक जटिल संतुलन की आवश्यकता होती है, जबकि साथ ही साथ रोगजनकों या एंटीजन जैसे प्रो-भड़काऊ अणुओं के प्रवेश कोरोका जाता है। बढ़ी हुई पारगम्यता कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों के कारण हो सकती है, जैसे कि यकृत रोग या सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) 2,3। उदाहरण के लिए, अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी), एक आईबीडी में, पुरानी सूजन तंग जंक्शनों के टूटने, आंत बाधा के बाद के विघटन और बैक्टीरिया के स्थानांतरण की ओर ले जाती है, संभावित रूप से म्यूकोसल और प्रणालीगत सूजनको बनाए रखती है।
इसलिए, आंत बाधा अखंडता आंत स्वास्थ्य का एक महत्वपूर्ण मार्कर है। हालांकि, आंतों की पारगम्यता के माप के लिए वर्तमान तरीकों में कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा भड़काऊ मार्करों या प्लीहा और लिम्फ नोड्स में जीवाणु स्थानांतरण को मापने के तरीके अप्रत्यक्ष 5,6 हैं। अन्य तरीके आक्रामक और समय-गहन हो सकते हैं। यह लेख एक गैर-इनवेसिव और लागत प्रभावी परख का वर्णन करता है जो सीधे और मात्रात्मक रूप से आंतों की पारगम्यता को मापता है। यह परख विवो में प्रतिदीप्ति को मापकर वास्तविक समय में आंतों की पारगम्यता का पालन करने के लिए फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) का उपयोग करती है। इसके अलावा, प्लाज्मा और मल में एफआईटीसी-डेक्सट्रान के स्तर को मापने से आंतों की पारगम्यता निर्धारित होती है (चित्रा 1)।
एफआईटीसी-डेक्सट्रान पारगम्यता परख का उपयोग पहले कई अलग-अलग संदर्भों में किया गया है, जिसमें पार्किंसंस रोग7, सेप्सिस8, इस्केमिक स्ट्रोक9 और बर्न इंजरी10 के पशु मॉडल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, इस परख का उपयोग हाल ही में यह समझने में सहायता के लिए किया गया है कि आंत माइक्रोबायोम को विभिन्न रोग प्रक्रियाओं में कैसे फंसाया जा सकता है और इसे संभावित चिकित्सीय के रूप में कैसे लक्षित या हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उम्र बढ़ने 11, आईबीडी12, कोलोरेक्टल कैंसर13 और ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकार11 में माइक्रोबायोम और माइक्रोबायोम-आधारित चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। चूंकि आंत बाधा समारोह स्वास्थ्य और बीमारी के कई पहलुओं में फंसा हुआ है, इस परख का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इसकी सापेक्ष सादगी और कम समय का बोझ इसे आंत बाधा अखंडता को बदलने के लिए संदिग्ध विवो स्थितियों के परीक्षण के लिए आदर्श बनाता है। इसके मात्रात्मक परिणाम संभावित उपचार की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए उपयोगी हैं।
इस अध्ययन में, आंत बाधा समारोह पर आहार के प्रभाव का मूल्यांकन एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का उपयोग करके किया गया था। एक नियंत्रण आहार प्राप्त करने वाले चूहों की आंतों की पारगम्यता और इनुलिन-पूरक आहार प्राप्त करने वाले चूहों की आंतों की पारगम्यता की तुलना की गई थी। इनुलिन एक लाभकारी ऑलिगोसेकेराइड है जिसे आंत बाधा समारोह12,13 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। विवो फ्लोरेसेंस माप (पृष्ठभूमि) में, एक अतिरिक्त अनुपचारित माउस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था और एफआईटीसी-डेक्सट्रान के बजाय पीबीएस प्राप्त किया गया था। यह प्रयोग दर्शाता है कि एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंतों की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।
Protocol
सीआरसीएचयूएम की संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदन के बाद पशु देखभाल दिशानिर्देशों पर कनाडाई परिषद का पालन करते हुए सभी प्रक्रियाएं की गईं। आठ सप्ताह की मादा बीएएलबी / सी चूहों, एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त ( सामग्री की तालिका देखें), वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किया गया था। जानवरों को 2 सप्ताह के लिए 10% इनुलिन डब्ल्यूटी / डब्ल्यूटी के साथ आहार पूरक प्राप्त हुआ। एक नियंत्रण समूह को इनुलिन पूरक की कमी वाले समान आहार प्राप्त हुए। चूहों के पास आहार तक सीमित लिबिटम पहुंच थी। परख का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है।
चित्रा 1: एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का योजनाबद्ध। टी -4- 4 घंटे पहले, भोजन की पहुंच को हटा दिया गया था। टी0- एफआईटीसी-डेक्सट्रान को मौखिक गैवेज के माध्यम से प्रशासित किया गया था। टी 1 - 1 एच गैवेज के बाद, विवो फ्लोरेसेंस का मूल्यांकन किया गया था। टी 4- 4 एच गैवेज के बाद, फेकल और प्लाज्मा नमूने एकत्र किए गए थे, और प्रतिदीप्ति को मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
1. एफआईटीसी-डेक्सट्रान का प्रशासन
- एफआईटीसी-डेक्सट्रान को प्रशासित करने से पहले, पानी तक एड लिबिटम पहुंच बनाए रखते हुए चूहों को 4 घंटे के लिए उपवास करें।
नोट: उपवास अधिमानतः प्रकाश चक्र (सुबह में) की शुरुआत में शुरू किया जाना चाहिए। चूहों को कोप्रोफैगी को सीमित करने के लिए उपवास के दौरान बिस्तर के बिना एक नए पिंजरे में स्थानांतरित किया जा सकता है। - बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (प्रति माउस) में पतला 80 mg-mL−1 4 kDA FITC-dextran ( सामग्री की तालिका देखें) का 200 μL तैयार करें। प्रशासन से तुरंत पहले नमूने तैयार करें, और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखें।
- बॉल- या नाशपाती के आकार की नोक के साथ 38 मिमी 22 जी निष्फल, घुमावदार गैवेज सुई का उपयोग करके प्रत्येक माउस को मौखिक गैवेज के माध्यम से एफआईटीसी-डेक्सट्रान निलंबन के 200 μL का प्रबंधन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पहले गैवेज के बाद टाइमर शुरू करें, और अगले माउस को विवो माप (चरण 2) में अनुमति देने से पहले 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, हमेशा 1 घंटे पोस्ट गैवेज बनाए रखें। मानक वक्र के लिए शेष एफआईटीसी-डेक्सट्रान निलंबन रखें।
नोट: गैवेज के तुरंत बाद, मल के गठन को सुनिश्चित करने के लिए भोजन को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
2. विवो फ्लोरेसेंस माप में
- 2.5% आइसोफ्लुरेन या वैकल्पिक एनेस्थेटिक का उपयोग करके गैवेज के 1 घंटे बाद चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पुष्टि करें कि जानवर को पैर की अंगुली या पूंछ को चुटकी मारकर उचित रूप से एनेस्थेटाइज किया जाता है और यह सुनिश्चित किया जाता है कि जानवर प्रतिक्रिया नहीं करता है।
- एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके पेट के क्षेत्र से फर को हटा दें, और सूखने से रोकने के लिए आंखों पर उदारतापूर्वक नेत्र स्नेहन मरहम लागू करें। फिर, चूहों को व्यक्तिगत रूप से इमेजिंग कक्ष में रखें जो पृष्ठीय रूप से पड़े हुए हैं।
नोट: एक नियंत्रण माउस को शामिल किया जाना चाहिए जो विवो इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि के लिए एफआईटीसी-डेक्सट्रान के बजाय पीबीएस या खारा प्राप्त करता है।
- एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके पेट के क्षेत्र से फर को हटा दें, और सूखने से रोकने के लिए आंखों पर उदारतापूर्वक नेत्र स्नेहन मरहम लागू करें। फिर, चूहों को व्यक्तिगत रूप से इमेजिंग कक्ष में रखें जो पृष्ठीय रूप से पड़े हुए हैं।
- प्रतिदीप्ति इमेजिंग कक्ष का उपयोग करके चूहों की छवि (सामग्री की तालिका देखें)। पेट क्षेत्र की छवियां प्राप्त करें, लेजर लंबाई 470 एनएम और रिज़ॉल्यूशन 2.0 मिमी पर सेट करें।
- प्रारंभ बटन पर क्लिक करके और दबाकर मशीन और सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें. सिस्टम को गर्म होने दें।
नोट: सिस्टम को गर्म करने के लिए 20 मिनट या उससे अधिक की आवश्यकता हो सकती है, इसलिए मशीन को जल्दी शुरू किया जाना चाहिए ताकि गैवेज के बाद 1 घंटे में चूहों की इमेजिंग में हस्तक्षेप न हो। - डिवाइस स्थिति पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि सभी कॉन्फ़िगर किए गए डिवाइस आगे बढ़ने से पहले "ठीक" दिखाते हैं।
- यदि आवश्यक हो, तो लेजर नियंत्रण पर क्लिक करके और फिर वांछित लेजर के लेजर नाम बटन पर क्लिक करके उपयुक्त लेजर को गर्म करें।
- नए अध्ययन पर क्लिक करके एक नया अध्ययन शुरू करें। इच्छित नाम के साथ उपयुक्त फ़ाइल के तहत सहेजें।
- अध्ययन विकल्पों पर क्लिक करें, फिर नमूना आईडी दर्ज करें, और सही लेजर चुनें और प्रयोग करें।
- इमेजिंग कक्ष खोलें और जानवर को स्कैनिंग प्लेट पर पृष्ठीय रूप से रखें। टेप के साथ अंगों और पूंछ को सुरक्षित करें, और सुनिश्चित करें कि नाक और मुंह संज्ञाहरण ट्यूब में अच्छी तरह से फिट हों, 2.5% आइसोफ्लुरेन को बनाए रखें।
- स्कैनिंग प्लेट की ऊंचाई समायोजित करें ताकि स्कैनिंग क्षेत्र जानवर की मध्य रेखा से थोड़ा उदर हो। इमेजिंग कक्ष के अंदर समायोजन नॉब को मोड़कर प्लेट को समायोजित करें। इमेजिंग कक्ष के दरवाजे को बंद और लॉक करें।
- ड्रा उपकरण का उपयोग करके स्कैन किए जाने वाले क्षेत्र का चयन करें। यकृत के ठीक ऊपर से मलाशय तक पेट की पूरी चौड़ाई शामिल करें। एक बार खींचे गए क्षेत्र को समायोजित करने के लिए संशोधित उपकरण पर क्लिक करें।
- स्कैन रिज़ॉल्यूशन को 2.0 मिमी पर सेट करें, और उसके बाद अगला पर क्लिक करें। एक बार पावर ऑटोमेशन पूरा हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स सही हैं, और आवश्यक कोई समायोजन करें। स्कैन शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
- एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, जानवर को इमेजिंग कक्ष से हटा दें, और संज्ञाहरण से उबरने के दौरान शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए इसे इनक्यूबेटर में रखें।
- सेटिंग्स को बनाए रखने के लिए अध्ययन जारी रखें पर क्लिक करें, और फिर चरण 2.2.5-2.2.10 को दोहराएं जब तक कि सभी चूहों को स्कैन नहीं किया जाता है।
- पावर बटन पर क्लिक करें और इमेजिंग कक्ष को पावर डाउन करने के लिए इसे 3 सेकंड तक रखें।
- प्रारंभ बटन पर क्लिक करके और दबाकर मशीन और सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें. सिस्टम को गर्म होने दें।
- उपयोग की गई इमेजिंग प्रणाली से जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग करके समान रूप से स्केल की गई छवियों पर प्रत्येक जानवर और नियंत्रण माउस के पेट की प्रतिदीप्ति की तुलना करके प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- छवि फ़ाइलों को चुने हुए फ़ाइल नाम के तहत ढूँढकर खोलें. उन सभी फ़ाइलों को खोलें जिन्होंने एक ही समय में सेटिंग्स सिंक्रनाइज़ की हैं.
- छवि सेटिंग्स टूलबार का उपयोग करके, छवियों के लिए सेटिंग्स सिंक करने के लिए सिंक छवि और सिंक स्केल बटन का उपयोग करें, जिससे सटीक तुलना की जा सके।
- छवियों को उनके समायोजित तराजू के साथ सहेजें।
3. फेकल नमूने और प्लाज्मा में प्रतिदीप्ति माप
- गैवेज के 4 घंटे बाद एक बाँझ ट्यूब में प्रत्येक माउस से एक फेकल गोली एकत्र करें। ट्यूबों को बर्फ पर अंधेरे में रखें।
- एमएल पेंटोबार्बिटल सोडियम (कमजोर पड़ने, 1: 100; सामग्री की तालिका देखें) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चूहों को एनेस्थेटाइज करें। 0.03 एमएल / जी शरीर के वजन की खुराक पर प्रशासित करें।
- रेट्रो-ऑर्बिटल प्लेक्सस14 में ग्लास केशिका ट्यूब डालकर थक्के को रोकने के लिए हेपरिन या ईडीटीए युक्त प्लाज्मा संग्रह के लिए बनाई गई ट्यूब में कम से कम 700 μL के रक्त के नमूने एकत्र करें (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: रक्त संग्रह के लिए वैकल्पिक तरीकों में कार्डियक पंचर या पूंछ की नस से वापसी शामिल है। चूंकि यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है, चूहों को ग्रीवा अव्यवस्था या वैकल्पिक मानवीय विधि के माध्यम से इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है। इच्छामृत्यु के लिए स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों का पालन करें।
- रेट्रो-ऑर्बिटल प्लेक्सस14 में ग्लास केशिका ट्यूब डालकर थक्के को रोकने के लिए हेपरिन या ईडीटीए युक्त प्लाज्मा संग्रह के लिए बनाई गई ट्यूब में कम से कम 700 μL के रक्त के नमूने एकत्र करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 9,390 x g पर रक्त के नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्लाज्मा को एक नई बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ पर अंधेरे में रखें।
- 1x PBS के 200 μL में 50 मिलीग्राम फेकल नमूनों को पतला करें और 1x PBS के साथ प्लाज्मा 1: 2 को पतला करें। फ्लोरेसेंस सिग्नल की तीव्रता के आधार पर कमजोर पड़ने के अनुपात को संशोधित किया जा सकता है।
- 1x PBS में FITC-dextran के सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग करके एक मानक वक्र उत्पन्न करें। 20 mgl-1 FITC dextran की उच्चतम सांद्रता के साथ शुरू होता है, 1: 1 के कारक से क्रमिक रूप से 7-10 बार पतला होता है।
नोट: इस प्रकार, सांद्रता को 20 mgl-1, 10 mg-mL-1, 5 mg-mL-1, 2.5 mg/mL-1, 1.25 mg/mL-1, 0.625 mg/mL-1, 0.3125 mgmL-1 आदि को पढ़ना चाहिए। - एक अपारदर्शी काले 96-वेल प्लेट में प्लेट 100 μL नमूने और मानक। कोई PBS रिक्त स्थान शामिल करें. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर प्रतिदीप्ति पढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें) 530 एनएम पर अवशोषण और 485 एनएम पर उत्तेजना के साथ।
नोट: नमूने और मानकों को डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में चढ़ाया जा सकता है, और फिर उनके प्रतिदीप्ति मूल्यों का औसत निकाला जाता है। - प्रतिदीप्ति की तुलना मानक वक्र की ज्ञात सांद्रता से करके प्रति नमूना एफआईटीसी-डेक्सट्रान की एकाग्रता निर्धारित करें। नमूनों में, तनुकरण कारक (चरण 3.5) से एकाग्रता को गुणा करें।
Representative Results
विवो फ्लोरेसेंस के विश्लेषण से पता चला है कि जिन चूहों को केवल नियंत्रण आहार प्राप्त हुआ था, उनमें इनुलिन-पूरक आहार प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में पेट की गुहा में एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उच्च यकृत सेवन और अवशिष्ट प्रतिदीप्ति का उच्च स्तर था (चित्रा 2 ए)। इनुलिन आहार प्राप्त करने वाले चूहों के सीकम में कुछ प्रतिदीप्ति दिखाई दे रही थी, लेकिन कोई यकृत सेवन नहीं था, यह दर्शाता है कि ये आहार आंतों की पारगम्यता में वृद्धि के खिलाफ संरक्षित थे।
प्लाज्मा और फेकल नमूनों में प्रतिदीप्ति स्तर विवो समकक्षों में उनके सुदृढ़ और मात्रा निर्धारित करने के लिए काम करते हैं। इनुलिन-पूरक आहार प्राप्त करने वाले चूहों में केवल नियंत्रण आहार प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में उनके प्लाज्मा में एफआईटीसी-डेक्सट्रान का स्तर काफी कम था (चित्रा 2 बी)। यह इंगित करता है कि उन्होंने आंत बाधा समारोह में सुधार किया था क्योंकि कम एफआईटीसी-डेक्सट्रान परिसंचरण में आंतों की बाधा को पार कर सकता था। सहमति से, इनुलिन आहार प्राप्त करने वाले चूहों में केवल नियंत्रण आहार प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में उनके मल में एफआईटीसी-डेक्सट्रान का स्तर काफी अधिक था (चित्रा 2 सी)। यह इस बात को पुष्ट करता है कि उनके पास बरकरार आंत बाधा समारोह था क्योंकि एफआईटीसी-डेक्सट्रान उत्सर्जन तक बृहदान्त्र में बना रहा, जैसा कि सामान्य माना जाता है। नियंत्रित चूहों के मल में एफआईटीसी-डेक्सट्रान के निचले स्तर से संकेत मिलता है कि यह उचित रूप से उत्सर्जित होने के बजाय परिसंचरण में आंतों की बाधा के माध्यम से व्याप्त हो गया। प्लाज्मा में एफआईटीसी-डेक्सट्रान के उच्च स्तर इस खोज को मजबूत करते हैं।
चित्र 2: इनुलिन के साथ आहार अनुपूरक आंत अवरोध के माध्यम से एफआईटीसी-डेक्सट्रान के स्थानांतरण को कम करता है। (ए) एफआईटीसी-डेक्सट्रान के अवशिष्ट प्रतिदीप्ति और यकृत उत्थान। लाल = उच्चतम तीव्रता; गहरा बैंगनी = सबसे कम तीव्रता। 2.15 x 103 की अधिकतम प्रतिदीप्ति, 0.378 की न्यूनतम प्रतिदीप्ति। (बी) एफआईटीसी-डेक्सट्रान की प्लास्मोटिक एकाग्रता। P = 0.010 (सी) एफआईटीसी-डेक्सट्रान की फेकल एकाग्रता। P = 0.00003 N = 4 प्रति समूह। डेटा को एसईएम के माध्य के रूप ± दर्शाया जाता है। प्रत्येक बिंदु एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है। अप्रकाशित छात्र का टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
आंत बाधा समारोह कई अलग-अलग रोग प्रक्रियाओं का एक अभिन्न अंग है। इस प्रकार, पशु मॉडल में इन बीमारियों का सटीक प्रतिनिधित्व करने के लिए एक गैर-आक्रामक, लागत प्रभावी और मात्रात्मक तरीके से आंतों की पारगम्यता का आकलन करना आवश्यक है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख इस प्रतिनिधित्व के लिए संभावना प्रदान करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं जिन्हें विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए सटीक रूप से पूरा किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उचित आकार के एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग सुनिश्चित करना आवश्यक है। विवो पारगम्यता में जांच के लिए, 4 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान इष्टतम आणविक भार है, और जैसे ही आणविक भार बढ़ता है, पारगम्यता15 कम हो जाती है। इस प्रकार, एक अलग आणविक भार के एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग भ्रामक या अविश्वसनीय परिणाम प्रदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक गैवेज के समय को नोट करना और विवो डेटा संग्रह और तदनुसार प्लाज्मा और मल के संग्रह के लिए समय बिंदुओं को समायोजित करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि दो चूहों को 10 मिनट की दूरी पर रखा जाता है, तो विवो फ्लोरेसेंस रीडिंग और मल और प्लाज्मा का संग्रह भी 10 मिनट अलग होना चाहिए। एक ही समय बिंदुओं पर प्रतिदीप्ति की तुलना करने से पारगम्यता में अंतर का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व होता है। इसके अलावा, जिस क्रम में विभिन्न समूहों के जानवरों का परीक्षण किया जाता है, उसे समय के कारण क्लस्टरिंग प्रभाव को रोकने के लिए वैकल्पिक किया जाना चाहिए। पहले समूह ए में सभी जानवरों का परीक्षण करने के बजाय, फिर समूह बी सेकंड (एएएबीबीबी) में सभी जानवरों का परीक्षण करने के बजाय, समूह को प्रत्येक जानवर (एबीएबीबी) के बाद स्विच करने की सिफारिश की जाती है।
इमेजिंग मशीन तक पहुंच की कमी होने पर इस परख को केवल प्लाज्मा और फेकल नमूनों के मूल्यांकन को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि विवो में प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग यकृत सेवन और अवशिष्ट पेट प्रतिदीप्ति के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, प्लाज्मा और फेकल नमूनों में प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन अभी भी आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक माप प्रदान करता है। इसके अलावा, जैसा कि वर्णित प्रयोग द्वारा प्रदर्शित किया गया है, प्लाज्मा और मल में प्रतिदीप्ति स्तर विवो इमेजिंग के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। इसके अतिरिक्त, इस परख को केवल विवो इमेजिंग में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह जानवरों को अन्य मापदंडों का परीक्षण जारी रखने या निगरानी करने के लिए जीवित रखने की अनुमति देता है कि समय के साथ आंतों की पारगम्यता कैसे बदलती है। इस परख को संशोधित करने की क्षमता, इसलिए, इसे सुलभ बनाती है, फिर भी मात्रात्मक है। अंत में, प्रत्येक माउस को दिए गए 80 mg.mL-1 FITC-dextran के 200 μL की खुराक का उपयोग पहले किया गया था और शरीर के वजन16 में छोटे अंतर वाले चूहों में प्रभावी दिखाया गया था। इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले सभी चूहों का वजन लगभग 20 ग्राम था, जिससे प्रत्येक माउस के लिए एक ही खुराक का उपयोग किया जा सकता था। शरीर के वजन में अंतर के लिए, हालांकि, एफआईटीसी-डेक्सट्रान को 0.6-0.8 मिलीग्राम / जी शरीर के वजन की खुराक पर प्रशासित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए17। महत्वपूर्ण रूप से, उपयोग की जाने वाली खुराक के बावजूद, जटिलताओं या असुविधा को रोकने के लिए प्रत्येक माउस में गाव की मात्रा को 10 एमएल-किलो -1 से कम तक सीमित करना महत्वपूर्णहै।
हालांकि एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंत बाधा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएं हैं। इस मॉडल की एक सीमा यह है कि इसके लिए चूहों को कई घंटों तक उपवास करने की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि इन परिणामों की तुलना उन चूहों से करना अविश्वसनीय है जिन्हें उपवास नहीं किया गया है। इसके अतिरिक्त, उपवास कुछ मॉडलों में परिणामों को प्रभावित कर सकता है जिनके लिए सख्त भोजन कार्यक्रम की आवश्यकता होती है, जैसे कि मधुमेह के लिए पशु मॉडल में रक्त शर्करा को मापते समय।
इन सीमाओं के बावजूद, एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंतों की पारगम्यता का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका बना हुआ है क्योंकि यह मात्रात्मक, बहुमुखी, लागत प्रभावी और कई शास्त्रीय तरीकों की तुलना में कम आक्रामक है। उदाहरण के लिए, आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली सामान्य जांच छोटे सैकराइड जांच या सीआर-ईडीटीए हैं, जिनकेकुछ फायदे हैं। हालांकि, कुछ सैकराइड जांच में केवल क्षेत्र-विशिष्ट पारगम्यता होती है। चूंकि वे छोटी आंत के बाहर के हिस्से में हाइड्रोलाइज्ड होते हैं, इसलिए वे कोलोनिक पारगम्यता19 में कोई अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं। दूसरी ओर, सीआर-ईडीटीए कोलोनिक पारगम्यता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है लेकिन 24 घंटे के लिए माप की आवश्यकता होती है, जिससे इस विधि का समय बोझ एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख20 की तुलना में बहुत अधिक हो जाता है। इसके अलावा, इनमें से कोई भी विधि इस परख के विवो इमेजिंग में प्रत्यक्ष प्रदान नहीं करती है। इसलिए, आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों की तुलना में एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख अपेक्षाकृत सरल, प्रत्यक्ष और प्रभावी विकल्प प्रदान करती है।
अंत में, रोग प्रक्रियाओं जैसे आईबीडी4, अल्जाइमर रोग21, और यकृत रोग2 में, आंतों की पारगम्यता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जिसे अध्ययन में सुधार के लिए एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का उपयोग करके मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, आईबीडी के लिए इम्यूनोथेरेपी जैसे नए उपचार विकसित करने में, इस परख का उपयोग आंत बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए चिकित्सीय की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यह देखते हुए कि बिगड़ा हुआ आंत बाधा समारोह यूसी में पुरानी सूजन को बनाए रखने में फंसाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, यह जांचना कि एक चिकित्सीय बढ़ी हुई पारगम्यता के खिलाफ कितनी अच्छी तरह से रक्षा करता है, महत्वपूर्ण है। यह केवल एक उदाहरण है, लेकिन एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख कई अलग-अलग क्षेत्रों और अनुसंधान के पहलुओं में आंतों की पारगम्यता को मापने का एक सुलभ और मात्रात्मक तरीका है।
Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एमएमएस को आरजीपीआईएन-2018-06442 अनुदान) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम सीआरसीएचयूएम में पशु सुविधा और कार्डियोवैस्कुलर फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म से डॉ जुनझेंग पेंग को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
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