Summary
在这里，我们描述了一个易于实施的标准化的微生理系统，该系统反映了人体骨髓 体内 结构的复杂性，为精细研究广泛的正常和病理事件提供了一个相关的模型。
Abstract
髓质生态位是一个复杂的生态系统，对于维持常驻细胞的体内平衡至关重要。事实上，骨髓包括复杂的细胞外基质和各种细胞类型，如间充质干细胞、成骨细胞和内皮细胞，通过直接的细胞间相互作用以及细胞因子的产生，深入参与造血干细胞的调节。为了密切模拟这种 体内 结构并进行反映人类骨髓反应的实验，已经创建了几种基于生物材料的3D模型，主要依赖于原代基质细胞。在这里，描述了一种协议以获得易于设置并提供骨髓样结构特征的最小和标准化系统，该系统结合了包括内皮细胞在内的不同细胞群，并反映了 体内 骨髓组织的异质性。这种3D骨髓样结构 - 使用磷酸钙颗粒和人类细胞系组装而成，代表骨髓微环境 - 允许通过组合或替换系统内不同的原代细胞群来监测各种生物过程。然后，可以在固定、石蜡包埋和组织学/免疫组织化学染色后收集最终的 3D 结构以进行图像分析，以便在系统内定位细胞，或者解离以收集每个细胞成分以进行分子或功能表征。
Introduction
骨髓 （BM） 存在于中轴骨和长骨以及小梁扁平骨的中央腔内，包含各种不同的细胞和非细胞成分。在结构水平上，它由造血组织岛（也称为“血细胞”）1，2 和散布在小梁骨内的血管窦包围的脂肪细胞组成3。在长而扁平的骨骼中，骨骼和骨髓的血液供应通过血管内膜网络相互连接4。隐藏在这个坚实的保护网络中，BM宿主浸泡在海绵状基质中的非常未成熟的细胞，并构成常驻间充质干细胞（MSC）和造血干细胞（HSC）分化的位置5。事实上，除了通过产生成骨细胞来更新骨组织外，BM的主要已知功能之一在于造血发育6。
BM造血组织包括多种细胞类型，即HSC、前体细胞和分化的血细胞，如淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板7。造血细胞不是随机排列在BM空间中，而是在造血生态位内显示特定的组织，包括许多不同来源的细胞类型（成骨细胞，破骨细胞，MSC，脂肪细胞，正窦内皮和血管周围基质细胞，免疫细胞，神经细胞和不同的成熟造血细胞），形成复杂的结构以确保正常的造血8.造血生态位的生物学功能包括通过不同的机制（细胞-细胞和细胞-基质相互作用、可溶性因子的产生、缺氧）调节HSC存活、粘附、静止、归巢和分化，以响应多种生理或非生理应激3，6。尽管这些造血生态位最初被认为是同质实体，但单细胞和成像分析等技术进步已逐渐揭示其复杂性，动力学和适应性特性9，10，11。
更换和减少使用动物来破译人类生理和病理过程的迫切需要带来了新的机遇和挑战11，12。在新描述的体外工具中，已经提出了比经典二维（2D）培养物更好地模拟体内人类BM的三维（3D）模型13，14，15，16，17。因此，3D建模似乎是观察细胞-细胞和细胞-基质相互作用的一种有前途的方法，更接近体内发生的相互作用。使用各种这些模型，一些团队已经证明了HSC18，19的存活和增殖。有几种3D模型可用，最常见的方法是使用基于支架的3D生物材料，例如水凝胶，胶体或胶原蛋白，与MSCs相关的利用其成骨细胞谱系分化能力20，21，22。然而，尚未达成全球同意以用户友好和标准化的方式满足人类细胞研究的所有要求23，特别是因为这些当前的3D系统主要依赖于原代基质细胞，因此对原始样品的访问，组织可用性和异质性有限。
此外，应引入内皮细胞区室，因为这些细胞是细胞间相互作用的主要组成部分，并参与白血病24 和转移25中的干细胞命运和BM疾病的发展。我们之前报道过，在标准化的人类3D骨髓模型中添加病理元素概括了在患者样本中观察到的特征，例如细胞外基质（ECM）改变26。为了更好地了解人类BM微环境与常驻细胞之间的动力学和相互作用，我们为用户友好和标准化的系统提供了一个详细的协议，以建立一个最小的，组织良好的BM样结构。该系统由三种人骨髓细胞类型组成 - 代表微环境的内皮细胞和基质细胞以及HSC。通过使用特定的珠子作为支架和成骨细胞分化培养基，获得的3D结构将模仿人类髓质壁龛，从而可以方便地研究人类骨髓。
Protocol
注意：为了制备骨髓样骨架结构，该协议依赖于将珠子与双相磷酸钙（BCP）珠上的HMEC-1内皮细胞和HS27A基质细胞相结合。BCP珠子将用作支架，允许使用特定介质进行3D结构塑造。
1.珠子的制备和灭菌
- 称取 35-40 mg BCP 珠 （HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm），用于 1.5 mL 管中的每个插入物（底部有聚碳酸酯膜的小圆柱形塑料培养皿）（参见 材料表）。称量珠子后，用干净的针头在1.5mL管的顶部钻一个小孔，以避免盖子在高压灭菌器循环（121°C60分钟）期间弹出，并将管垂直放置在封闭的无菌盒中。
2.3D 在无菌罩下插入制剂
- 将无菌聚碳酸酯细胞培养插入物放入 6 孔板的孔中。将无菌 BCP 珠从 1.5 mL 管中倒入插入物中。通过在插入物内滴入 350 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 仔细洗涤珠子，然后将 4.5 mL 的 1x PBS 加入孔中。使用真空或 5 mL 移液器将吸头放在孔的一角，取出并丢弃 PBS。重复洗涤步骤两次。
- 洗涤珠子后，使用补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 1x PBS 来阻断系统。小心地将 350 μL 封闭溶液加入插入物中，将 4.5 mL 加入孔中，并将整个板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中过夜。
注意：步骤2.1和2.2有助于在细胞接种前最大限度地减少BCP磁珠的离子释放。
3. 细胞系收获和3D维护
注意：在此孵育步骤之后，加入微环境细胞以形成3D结构骨架。该系统基于使用HMEC-1，用SV40的大T抗原永生化的人微血管内皮细胞和HS27A，用人瘤病毒永生化的人骨髓基质细胞，因为它们能够形成固体BM样结构并且与内皮细胞的相容性。
- 在将细胞添加到系统中之前，请准备以下培养基：
- 对于 50 mL 完全骨分化培养基 （ODM），混合 45 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） + 5 mL FBS + 0.5 mL青霉素-链霉素 + 8 × 10-4 mg/L 地塞米松 + 2.16 g/L β-甘油磷酸盐 + 44 mg/L 抗坏血酸。
- 对于 50 mL 的完整 HMEC-1 培养基，混合 45 mL MCDB 131 + 5 mL FBS + 0.5 mL 青霉素-链霉素 + 1% 谷氨酰胺替代品 + 1 mg/L 氢化可的松 + 10 μg/L EGF。
- 从系统中卸下阻塞溶液。在 15 mL 管中混合 1 × 106 个 HMEC-1 细胞（代表血管区室）和 2 × 10个 6 HS27A 细胞（代表间充质基质细胞区室），并在室温下以 1，575 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入 175 μL HMEC-1 培养基（HMEC-1 细胞生长的特定培养基）和 175 μL ODM（HS27A 骨分化的特异性培养基）。
- 在每个插入物内倒入 350 μL 含有 3 × 106 个总细胞的悬浮液。然后，将 4.5 mL 不含细胞的组合培养基（2.25 mL HMEC-1 培养基 + 2.25 mL ODM）倒入板孔中。用 1 mL 微量移液器轻轻吸出并分配混合物数次，以使插入物内的细胞和 BCP 磁珠均质化。分配整个混合物以沉淀在插入物的底部。
注意：如果培养多个插入片段，建议使用一个死体积的混合物制剂。例如，如果培养了四个插入片段，请始终准备五个插入片段所需的体积。 - 一旦内皮细胞和间充质细胞在插入物内匀浆，将6孔板保持在37°C，5%CO2 的培养箱内3周。使用 1 mL 微量移液器小心地从插入物中取出培养基，并将吸头放在插入物内壁上，以避免干扰插入物的角落，每周更换 2 次插入物和孔内的培养基。
注意：检索到的上清液可以在任何步骤中储存在-80°C，以便以后进行蛋白质定量。
4. 将感兴趣的细胞添加到系统中
注意：HMEC-1和HS27A培养3周后，HS27A细胞的骨分化使系统僵化。在此步骤中，在插入物中添加感兴趣的血液学细胞（添加的细胞数可以从1×104 到1×106不等）。添加的细胞是转染 BCR-ABL 癌基因的TF1细胞和来自急性髓系白血病患者或健康供体的原代单核CD34 + 细胞。
- 在此步骤中更改培养基成分，因为ODM化合物对血液学细胞有毒，一旦系统刚化完成，就无需继续添加。例如，为了支持造血维持，用完全RPMI代替造血细胞系的ODM培养基（补充有10%的FBS和1%的青霉素-链霉素的RPMI）或原代造血细胞的IMDM。准备一批 50% 完整的 HMEC-1 培养基和 50% 完整的 RPMI/IMDM 培养基，用于 3D 培养基（两次）每周更换。
- 将感兴趣的血液细胞重悬于该组合培养基中，并将其添加到插入物中。如果需要药物治疗方案，请在治疗前添加感兴趣的细胞后等待24小时，让它们有时间粘附在骨样结构上。
- 根据要求调整3D细胞培养的周期。每周两次刷新培养基（50% HMEC-1 完全培养基 + 50% RPMI 完全培养基）。
注意：在3D细胞培养过程中，一些贴壁细胞可能会泄漏到插入物之外的孔底部，从而增加培养基消耗。在显微镜下检查插入物以外的细胞分散情况，并在需要时在无菌罩下更换插入物到新的6孔板中。
5.3D骨髓样实验结果
注意：在3D培养之后，可以根据实验目标获得几个结果。
- 蛋白质分析
注意：在3D实验过程中，可以收集骨髓样结构中存在的细胞分泌的蛋白质以进行进一步分析。- 当每周更换培养基2次时，将从插入物内部取出的上清液储存在-80°C，以评估系统内目标蛋白质的产生。
- 将细胞与3D结构分离（如果需要分选细胞，则在无菌罩下）
注意：可以在3D骨髓样系统中培养的细胞可以检索，分类和进一步分析。- 在实验结束时，在15mL管中，将4.5mL RPMI与补充有0.4mg / mL胶原酶的0.5mLFBS混合，并在37°C下加热溶液10分钟。
- 将插入物倒置（顶部白色膜面）放在无菌 6 孔板盖上以正确切出膜。使用无菌手术刀从侧面切开膜，从而取回白色固体椎间盘。将圆盘放入步骤5.2.1中制备的温热的15 mL管中。
- 将试管置于37°C培养箱中的活性轮中并孵育10分钟以使消化（与胶原酶接触）。对所有膜应用相同的孵育时间，以避免分析偏斜。
- 10分钟后，在室温下以1，575× g 离心15mL管5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于5mL温热的1x PBS中。注意：在此步骤中，由于聚碳酸酯膜通常漂浮在上清液级分中，因此可以使用无菌移液器吸头将其丢弃。如果膜仍包含在沉淀中，请将其保留并在下一步结束时将其取出。
- 将沉淀重悬于300μL温热胰蛋白酶中，涡旋管10秒，并将其置于37°C水浴中1分钟。
- 通过添加 1 mL 温热的纯 FBS 停止酶消化。使用 1 mL 微量移液器，机械吸出并分配培养基以完全解离光盘。
注意：吸液/分液步骤必须非常快，否则珠子会沉淀在吸头内。 - 以1，575 ×g离心管5分钟。将沉淀重悬于补充有 10% FBS 的 3 mL 1x PBS 中。
- 将珠子沉淀5秒，然后收集上清液并通过放置在收集管上的35μm细胞过滤器过滤。将回收的滤液以1，575× g离心5分钟。用台盼蓝计数细胞以评估活力并进行流式细胞术分析。
注意：台盼蓝孵育后检索到的活细胞数量为~1-2×每个消化的插入物105 个细胞。
- 回收细胞的流式细胞术标记
注意：从3D骨髓样结构中取出的细胞可以通过流式细胞术进行标记和进一步分析。使用抗体混合物检测3D解离后的不同隔室。在这里，CD45（对感兴趣的血液细胞进行染色）、CD31（对血管室进行染色）和CD73（对成骨细胞室进行染色）在50μL的PBS + 2%FBS中以1μL使用。在整个过程中，将所有准备好的细胞和抗体放在冰（4°C）上，远离光线。- 将沉淀重悬于抗体混合物中，并在冰上避光孵育30-40分钟。
- 加入 1 mL PBS + 2% FBS 洗涤细胞并以 1，575 × g 离心 5 分钟。
- 将回收的沉淀重悬于 200 μL 1x PBS + 10% FBS 中，并补充有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，稀释 1：2，000）。
- 使用以下参数分析细胞仪中的管： FSC 297 PnV;SSC 220 PnV;DAPI 400 PnV;CD45 APC 505 PnV.使用 FSC-H 与 FSC-W 图来控制单重态总体。在单重态部分中，使用 DAPI-A 与 FSC-A 图来确定活细胞群（DAPI 阴性）。对于先前门控的 DAPI 阴性群体，使用 APC-A 与 FSC-A 图来确定 CD45 阳性群体。
- 固定3D骨髓样结构
注意：通常进行3D BM样结构的固定以进行免疫组织化学或免疫荧光，以原 位 可视化细胞并进行进一步的特异性染色。- 为了固定BM样结构，将插入物（步骤4.3）从旧板转移到填充有1x PBS的新6孔板中。然后，用 1x PBS 轻轻更换插入物内的培养基。
注意：不要用PBS冲洗成型的结构;液体的压力可能会损害3D结构。 - 清洗插入物后，将其放入新的 6 孔板中，并用新打开的 4% 多聚甲醛 （PFA）（在 1x PBS 中稀释 16%）填充孔和插入物。
- 让固定过程在室温下远离光线进行4小时。
- 在固定过程结束时，用1x PBS洗涤插入物一次，并将其储存在4°C远离光线。
- 按照步骤5.2.2中所述切割插入物底部的膜以取回实心盘。
- 将圆盘在EDTA（0.5M，pH 8）中孵育4x48小时，以使结构脱钙。
- 将结构嵌入石蜡中并切片 4 μm 厚的切片。
- 使用自动免疫染色器，用抗 CD45、抗 CD73 和 Ki67 抗体孵育切片。用抗兔或鼠萝卜过氧化物酶 （HRP） 和 3，3'-二氨基联苯胺作为显色底物可视化染色，并用吉尔苏木精复染。
- 为了固定BM样结构，将插入物（步骤4.3）从旧板转移到填充有1x PBS的新6孔板中。然后，用 1x PBS 轻轻更换插入物内的培养基。
Representative Results
使用该协议，可以概括一个最小的体 外3D 人类BM样微环境，从中可以检索来自三个不同细胞区室的活细胞（图1）。实际上，在所需的曝光后，可以解离3D BM样结构，并且可以使用流式细胞术评估/表征MSC，内皮细胞和造血细胞（图2A）。到目前为止，结果表明，在检索活细胞之前，可以在3D模型中将血液学细胞维持至少6周（图2B）。但是，需要将来进行研究以估计此3D模型的极限。此外，如果需要，可以在这种3D BM样模型中用原代正常骨髓（NBM）MSC或急性髓性白血病（AML）MSC替换HS27A细胞系（图2C）或用原代HSC替换造血细胞系（图2D）。此外，当分析细胞区室之间的相互作用或特定目标标记的定位时，可以通过石蜡包埋和免疫化学固定并进一步处理3D BM样结构。例如，使用这些3D模型对CD45（血液学）或CD73（MSC）内容物进行分析（图3）。
图 1：类人类 3D BM 系统的初始设置示意图。 共培养3周后，可以收集固体BM样组织或接种造血细胞（如示例中）或其他细胞类型。如果需要，一旦细胞贴壁，可以添加治疗并每周更换两次培养基。在实验结束时，BM样结构可以固定并进一步处理以进行定位研究，也可以解离以评估细胞内容物。缩写：BCP = 双相磷酸钙;BM = 骨髓。 请点击此处查看此图的大图。
图2：在BM样3D模型中培养后从不同区室中回收活细胞。 （A）从具有9.84%活细胞（DAPI-）的一种解离的BM样结构中恢复细胞的典型模式。3D解离后恢复的造血细胞（CD45+为66.6%）、MSC/成骨细胞（CD45-群体中为88.6%CD73+细胞）和内皮细胞（CD45-群体内为22.1%CD31+细胞）的代表性图。（B）3D系统允许在培养后6周内维持活造血细胞（CD45 +）。（C）由来自NBM或AML的初级MSC与HMEC-1（在本例中用Kusabira-Orange着色）制成的3D系统可以原位维持HSC（3.88%CD45 + DAPI-细胞）（D）。缩写：BM = 骨髓;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;MSC = 间充质干细胞;NBM = 正常骨髓;AML = 急性髓系白血病;HSC = 造血干细胞;FSC = 前向散射。请点击此处查看此图的大图。
图 3：类 BM 3D 模型中细胞相互作用和增殖的可视化。在与HS27A和HMEC-1进行3D共培养3周后收集系统，并在1周后加入造血细胞。使用抗兔或鼠萝卜过氧化物酶观察IHC的典型免疫组织化学染色（棕色可视化），并以3，3′-二氨基联苯胺作为显色底物观察，并用吉尔苏木精复染，显示CD45造血细胞的存在（左图），CD73基质细胞（中图）或KI67所有细胞增殖（右图）。比例尺 = 50 μm。缩写：BM = 骨髓;IHC = 免疫组织化学。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
目前人类生理和相关病理问题研究面临的挑战之一是缺乏准确模拟人体器官复杂功能的模型。在人类BM 3D模型的情况下，许多模型使用水凝胶并部分复制BM，说明了与传统2D培养相比，3D培养条件在确保例如更好的成骨细胞分化方面的力量27，28。然而，尽管具有良好的可重复性和易用性，但这些系统不能模仿人类BM 3D结构和架构，这可能会对进一步的分析产生重大影响。技术进步使科学家能够使用基于灌注的生物反应器系统更好地再现天然人类成骨细胞生态位环境，以保持某些HSC特性29。微流体装置的发展导致了复制相关骨髓样结构的新方法，但迄今为止仅实现了骨髓的有限特征，因此限制了应用30，31，32，33。
材料科学的进步促进了各种天然或合成生物材料的开发，可用于开发相关的3D骨培养系统。然而，这种系统有时很难在没有生物物理学内部技能的标准生物实验室中开发。此外，在大多数情况下，这些系统实现了模拟人体骨骼3D结构（包括BM微环境）的有限能力，并且使用了大量的细胞因子和生长因子，从而创建了人工丰富的培养基34。
选择诱导成骨细胞分化而不是脂肪细胞分化是基于以下事实：成骨细胞前和成骨细胞已被描述为内膜生态位的一部分35。这确定了成骨细胞作为骨和骨髓的要求成分。在骨髓的细胞成分中，内皮细胞和基质细胞占据了微环境的很大一部分。此外，这两种细胞类型产生细胞外基质的结构非细胞成分和参与调节稳态和分化的细胞因子，这里要求产生钙化结构。因此，这证明了使用内皮细胞和基质细胞以及我们选择的细胞系以允许轻松访问并提高实验室之间的可重复性。随着HMEC-1系的培养随着时间的推移更加稳定，该细胞系被保留用于3D系统的开发。对于基质细胞，我们在2D培养中比较了来自正常骨髓的基质细胞系的成骨细胞分化能力：HS5和HS27A。我们发现HS5系的分化程度不如使用任一细胞系生成的3D系统中的HS27A系。在这方面，试图用HS5系列取代HS27A电池导致生产出刚性较低的结构，这表明HS27A更合适。
HS27A和HMEC-1细胞系都以不同的培养基组合培养，其中一种引起HMEC-1的最佳刚性结构和沿成骨细胞结构的排列，从而使细胞外基质的产生为基本结构带来相对刚性。对D14分化进展的分析表明，D21分化更先进（BSP的测量，晚期成骨细胞标志物），HMEC-1：HS27A的比例为1：2，当引入2×106 HS27A时，结果更好。内皮细胞在调节稳态和分化（除其他外通过细胞因子的供应）方面也起着重要作用。HMEC-1细胞维持在这个系统中的事实表明它们至少可以发挥这一作用，这有助于我们模型的合法性。对于HMEC-1内皮系，重要的是尽早引入它，以便它可以正确地整合到结构中，并希望这些细胞能够在结构内形成对齐甚至管。HS27A和HMEC-1的共培养试验是通过在不同阶段引入后者来进行的：D0，D7，D14;无论是在基质细胞的分化还是内皮细胞的维持或定位方面，都没有观察到显着差异。因此，这些细胞是在过程开始时引入的。造血细胞是在成骨细胞分化发展到足以有利于细胞间相互作用的时候引入的。这种选择还受到这样一个事实的限制，即这种成骨细胞分化是由使用培养基决定的，根据我们的测试，培养基不能完全支持造血细胞的维持。血液学细胞可以是细胞系或原代 BM CD45 造血细胞。
从这个3D模型中，我们可以设想用正常或病理的原代细胞替换每种细胞类型，甚至可以添加其他细胞类型来增强仿生特性，例如免疫细胞，脂肪细胞或成纤维细胞26。事实上，HS27A细胞系已被低传代的原代BM MSCs所取代。同样，血液学细胞系被原代BM造血细胞取代。然而，原代内皮细胞替代HMEC-1细胞尚未经过测试。目前，该模型仍然可以在脉管系统表征方面进行改进，因为即使存在内皮细胞并与微环境中的其他细胞（例如造血细胞）正确相互作用，它们也不会形成结构化血管，从而排除了流动灌注以模拟功能性血管。总体而言，这可能会逐渐增加当前最小3D模型的复杂性和代表性。添加其他细胞类型可能有助于研究其他问题，例如局部BM炎症的重要性或对免疫疗法的耐药性。
然而，这种3D系统需要3周才能添加感兴趣的细胞，血液细胞或上皮癌细胞，如果转移过程被评估，可以添加。需要保持无菌条件，因为每周更换两次培养基有时会导致培养基污染。此外，由于一些细胞可能通过插入物的孔迁移并开始分散到孔中，导致培养基消耗增加，因此建议定期监测。
我们在这里描述了一种允许成骨细胞分化的3D支架，并开发了一种相关的体 外3D 人类BM样微环境。该系统允许 原位 分析和最终活细胞检索。该系统提供了一种新的高度灵活的工具，可重复且用户友好，具有广泛的应用，用于研究人类BM微环境中的相互作用和机制。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢来自CRCL细胞术平台的P. Battiston-Montagne和A. Jambon以及来自Léon Bérard中心转化研究与创新系研究病理学平台的N. Gadot和C. Leneve。作者感谢B. Manship的英文版。这项工作由Inserm和FI-LMC资助给V.M.S.，S.L.K.A.和L.B.得到法国Hématologie协会的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
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