Summary
Här beskriver vi ett lätt att implementera, standardiserat, mikrofysiologiskt system som återspeglar komplexiteten i den mänskliga benmärgens in vivo-struktur , vilket ger en relevant modell för att fint studera ett brett spektrum av normala och patologiska händelser.
Abstract
Den medullära nischen är ett komplext ekosystem som är viktigt för att upprätthålla homeostas för bosatta celler. Faktum är att benmärgen, som innefattar en komplex extracellulär matris och olika celltyper, såsom mesenkymala stamceller, osteoblaster och endotelceller, är djupt involverad i hematopoietisk stamcellsreglering genom direkta cell-cellinteraktioner, såväl som cytokinproduktion. För att nära efterlikna denna in vivo-struktur och genomföra experiment som återspeglar svaren från den mänskliga benmärgen har flera 3D-modeller skapats baserade på biomaterial, främst beroende av primära stromaceller. Här beskrivs ett protokoll för att erhålla ett minimalt och standardiserat system som är lätt att installera och ger funktioner i benmärgsliknande struktur, som kombinerar olika cellpopulationer inklusive endotelceller och återspeglar heterogeniteten hos benmärgsvävnad in vivo . Denna 3D-benmärgsliknande struktur monterad med kalciumfosfatbaserade partiklar och mänskliga cellinjer, representativa för benmärgsmikromiljön- möjliggör övervakning av en mängd olika biologiska processer genom att kombinera eller ersätta olika primära cellpopulationer inom systemet. De slutliga 3D-strukturerna kan sedan antingen skördas för bildanalys efter fixering, paraffininbäddning och histologisk/immunohistokemisk färgning för celllokalisering inom systemet, eller dissocieras för att samla varje cellulär komponent för molekylär eller funktionell karakterisering.
Introduction
Benmärg (BM) finns i både de centrala håligheterna i axiella och långa ben och trabekulära platta ben och innehåller en mängd distinkta cellulära och icke-cellulära komponenter. På strukturell nivå består den av hematopoetiska vävnadsöar (även kallade "hematoner")1,2 och fettceller omgivna av vaskulära bihålor insprängda i trabekulärt ben3. I långa och platta ben är blodtillförseln till ben och benmärg sammankopplade genom ett endostealnätverk av kärl4. Dold i detta solida skyddsnätverk är BM värd för mycket omogna celler nedsänkta i en svampig stroma och utgör platsen för differentiering av bosatta mesenkymala stamceller (MSC) och hematopoetiska stamceller (HSC)5. Bortsett från förnyelsen av benvävnader genom produktion av osteoblaster, ligger en av de viktigaste kända funktionerna hos BM i hematopoiesis utveckling6.
BM-hematopoietisk vävnad innefattar en mängd olika celltyper, nämligen HSC, prekursorer och mer differentierade blodkroppar såsom lymfocyter, neutrofiler, erytrocyter, granulocyter, monocyter och trombocyter7. Hematopoetiska celler är inte slumpmässigt ordnade i BM-utrymmet utan visar en viss organisation inom de hematopoetiska nischerna, som inkluderar många celltyper av olika ursprung (osteoblaster, osteoklaster, MSC, adipocyter, sinusformigt endotel och perivaskulära stromalceller, immunceller, nervceller och distinkta mogna hematopoetiska celler), som bildar en komplex struktur för att säkerställa normal hematopoies8 . De biologiska funktionerna i den hematopoetiska nischen inkluderar reglering av HSC-överlevnad, vidhäftning, quiescence, homing och differentiering genom olika mekanismer (cell-cell- och cell-matrisinteraktioner, produktion av lösliga faktorer, hypoxi) som svar på flera fysiologiska eller icke-fysiologiska påfrestningar 3,6. Även om dessa hematopoetiska nischer ursprungligen uppfattades som homogena enheter, har tekniska framsteg som encells- och avbildningsanalyser gradvis avslöjat deras komplexitet, dynamik och adaptiva egenskaper 9,10,11.
Det avgörande behovet av att ersätta och minska användningen av djur för att dechiffrera mänskliga fysiologiska och patologiska processer leder till nya möjligheter och utmaningar11,12. Bland nyligen beskrivna in vitro-verktyg har tredimensionella (3D) modeller som efterliknar in vivo human BM bättre än klassiska tvådimensionella (2D) kulturer 13,14,15,16,17 föreslagits. 3D-modellering verkar således vara ett lovande tillvägagångssätt för att observera cell-cell- och cell-matrisinteraktioner, närmare de som förekommer in vivo. Med hjälp av en mängd av dessa modeller har vissa team visat överlevnad och spridning av HSC18,19. Flera 3D-modeller finns tillgängliga, det vanligaste tillvägagångssättet är användningen av ställningsbaserade 3D-biomaterial som hydrogeler, kolloider eller kollagener, associerade med MSC som utnyttjar deras osteoblastiska härstamningsdifferentieringskapacitet20,21,22. Ändå har inget globalt samtycke nåtts för att uppfylla alla krav på studier på mänskliga celler på ett användarvänligt och standardiserat sätt23, särskilt eftersom dessa nuvarande 3D-system huvudsakligen förlitar sig på primära stromaceller och därmed lider av begränsad tillgång till primära prover, vävnadstillgänglighet och heterogenitet.
Dessutom bör endotelcellfacket införas eftersom dessa celler representerar en huvudkomponent i cell-cellinteraktioner och är involverade i stamcellsöde och BM-sjukdomsutveckling, både vid leukemi24 och metastaser25. Vi har tidigare rapporterat att tillägget av patologiska element i en standardiserad human 3D-benmärgsmodell rekapitulerar funktioner som observerats i patientprover såsom extracellulära matrisförändringar (ECM)26. För att bättre förstå dynamiken och interaktionerna mellan den mänskliga BM-mikromiljön och de bosatta cellerna tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för ett användarvänligt och standardiserat system för att bygga en minimal, välorganiserad, BM-liknande struktur. Detta system består av tre mänskliga benmärgscelltyper-endotelceller och stromaceller, som representerar mikromiljön och HSC. Genom att använda specifika pärlor som en byggnadsställning och ett osteoblastiskt differentieringsmedium kommer den erhållna 3D-strukturen att efterlikna den mänskliga medullarnischen, vilket möjliggör en praktisk studie av mänsklig benmärg.
Protocol
OBS: För att förbereda den benmärgsliknande ryggradsstrukturen förlitar sig detta protokoll på att kombinera pärlor med HMEC-1-endotelceller och HS27A-stromaceller på bifasiska kalciumfosfatpärlor (BCP). BCP-pärlorna kommer att fungera som en byggnadsställning som möjliggör, med ett specifikt medium, 3D-strukturell formning.
1. Pärlberedning och sterilisering
- Väg upp 35–40 mg BCP-pärlor (HA/β-TCP 60/40; 45–75 μm) för varje insats (liten, cylindrisk plastskål med ett polykarbonatmembran i botten) i ett rör på 1,5 ml (se materialförteckning). Efter att ha vägt pärlorna, borra ett litet hål med en ren nål genom toppen av 1,5 ml röret för att undvika att locket öppnas under autoklavcykeln (121 ° C i 60 minuter) och placera rören i vertikalt läge i en sluten steril låda .
2.3D sätt in preparatet under en steril huva
- Sätt sterila polykarbonatcellodlingsinsatser i brunnarna på en 6-brunnsplatta. Häll sterila BCP-pärlor från ett 1,5 ml rör i insatsen. Tvätta pärlorna försiktigt genom att droppa 350 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) inuti insatsen och tillsätt sedan 4,5 ml 1x PBS till brunnen. Ta bort och kassera PBS antingen med vakuum eller en 5 ml pipett genom att placera spetsen i ett hörn av brunnen. Upprepa tvättsteget två gånger.
- När pärlorna har tvättats, använd 1x PBS kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) för att blockera systemet. Tillsätt försiktigt 350 μl av blockeringslösningen till insatsen och 4,5 ml till brunnen och placera hela plattan i en inkubator vid 37 °C, 5%CO2 över natten.
Steg 2.1 och 2.2 hjälper till att minimera jonfrisättning från BCP-pärlor före cellsådd.
3. Cellinjeskörd och 3D-underhåll
OBS: Efter detta inkubationssteg tillsätts mikromiljöceller för att bilda 3D-strukturens ryggrad. Detta system är baserat på användningen av HMEC-1, humana mikrovaskulära endotelceller förevigade med stort T-antigen från SV40 och HS27A, humana benmärgsstromaceller förevigade med humant papillomvirus, på grund av deras förmåga att bilda en solid BM-liknande struktur och deras kompatibilitet med införandet av endotelceller.
- Innan du lägger till celler i systemet, förbered följande inkubationsmedium:
- För 50 ml komplett osteodifferentieringsmedium (ODM), blanda 45 ml av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 8 × 10-4 mg / L dexametason + 2,16 g / L beta-glycerofosfat + 44 mg / L askorbinsyra.
- För 50 ml komplett HMEC-1-medium, blanda 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 1% glutaminsubstitut + 1 mg / L hydrokortison + 10 μg / L EGF.
- Ta bort blockeringslösningen från systemet. Blanda 1 × 10 6 HMEC-1-celler (som representerar kärlfacket) och 2 × 106 HS27A-celler (som representerar det mesenkymala stromacellfacket) i ett 15 ml rör och centrifugera i 5 minuter vid 1 575 × g vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tillsätt 175 μL HMEC-1-medium (specifikt medium för HMEC-1-celltillväxt) med 175 μL ODM (specifikt medium för HS27A-osteodifferentiering).
- Häll 350 μL av denna suspension innehållande 3 × 106 celler totalt inuti varje insats. Häll sedan 4,5 ml av det kombinerade mediet (2,25 ml HMEC-1-medium + 2,25 ml ODM) utan celler i plattans brunnar. Aspirera försiktigt och dosera blandningen flera gånger med en 1 ml mikropipett för att homogenisera cellerna och BCP-pärlorna i insatsen. Tilldela hela blandningen för att sätta sig i botten av insatsen.
OBS: Ett blandningspreparat med en död volym rekommenderas om flera skär odlas. Till exempel, om fyra skär odlas, förbered alltid den volym som krävs för fem skär. - När endotel- och mesenkymala celler har homogeniserats inuti insatsen, håll 6-brunnsplattan inuti en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 i 3 veckor. Byt medium inuti insatsen och brunnen 2x i veckan genom att försiktigt ta bort mediet från insatsen med en 1 ml mikropipett och placera spetsen vid den inre insatsväggen för att undvika att störa skärets hörn.
OBS: Den hämtade supernatanten kan lagras vid -80 °C när som helst för senare proteinkvantifiering.
4. Tillägg av celler av intresse i systemet
OBS: Efter 3 veckors HMEC-1- och HS27A-odling möjliggjorde osteodifferentieringen av HS27A-celler styvningen av systemet. I detta steg lägger du till hematologiska celler av intresse (antalet tillsatta celler kan variera från 1 × 104 till 1 × 106) i insatsen. De tillsatta cellerna var TF1-celler transfekterade med BCR-ABL-onkogen och primära mononukleerade CD34 + -celler som kommer antingen från patienter med akut myeloisk leukemi eller friska givare.
- Ändra mediekompositionen i detta steg, eftersom ODM-föreningen är giftig för hematologiska celler och det inte finns något behov av att fortsätta lägga till det när systemstyvningen är klar. Till exempel, för att stödja hematopoetiskt underhåll, ersätt ODM-medium med komplett RPMI för hematopoetiska cellinjer (RPMI kompletterat med 10% av FBS och 1% av penicillin-streptomycin) eller IMDM för primära hematopoetiska celler. Förbered en sats med 50 % komplett HMEC-1-medium och 50 % komplett RPMI/IMDM-medium för 3D-medelstora (två gånger) veckovisa ändringar.
- Återsuspendera de hematologiska cellerna av intresse i detta kombinationsmedium och lägg till det i insatsen. Om ett läkemedelsbehandlingsprotokoll krävs, vänta 24 timmar efter att ha tillsatt cellerna av intresse innan du behandlar, vilket ger dem tid att hålla sig till den benliknande strukturen.
- Anpassa perioden för 3D-cellodling enligt kraven. Uppdatera mediet (50% HMEC-1 komplett medium + 50% RPMI komplett medium) två gånger i veckan.
OBS: Under 3D-cellodlingen kan vissa vidhäftande celler läcka utanför insatsen i botten av brunnarna, vilket ökar medelförbrukningen. Kontrollera under mikroskopet för celldispersion bortom insatsen och byt ut insatsen i en ny 6-brunnsplatta under en steril huva om det behövs.
5.3D benmärgsliknande experimentella resultat
OBS: Efter 3D-odling kan flera resultat uppnås enligt experimentets mål.
- Protein analys
OBS: Under 3D-experimentet kan de proteiner som utsöndras av cellerna som finns i benmärgsliknande strukturen samlas in för ytterligare analyser.- När odlingsmediet byts 2x i veckan, förvara den hämtade supernatanten från insidan av insatsen vid -80 ° C för att utvärdera produktionen av proteiner av intresse inom systemet.
- Dissociera celler från 3D-strukturen (under en steril huva om celler behöver sorteras)
OBS: Cellerna som odlas i det 3D-benmärgsliknande systemet kan hämtas, sorteras och analyseras ytterligare.- I slutet av experimentet, i ett 15 ml rör, blanda 4,5 ml RPMI med 0,5 ml FBS kompletterat med 0,4 mg/ml kollagenas och värm lösningen vid 37 °C i 10 minuter.
- Placera insatsen upp och ner (vit membransida ovanpå) på ett sterilt 6-brunns plattskydd för att skära ut membranet ordentligt. Använd en steril skalpell för att skära membranet från sidorna och därmed hämta en vit fast skiva. Placera skivan inuti det varma 15 ml röret som förberetts i steg 5.2.1.
- Placera röret i ett aktivt hjul i en 37 °C inkubator och inkubera i 10 minuter för att möjliggöra uppslutning (i kontakt med kollagenas). Applicera samma inkubationstid för alla membran för att undvika en skev analys.
- Efter 10 min, centrifugera 15 ml röret i 5 min vid 1,575 × g vid rumstemperatur, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml varm 1x PBS. OBS: I detta steg, eftersom polykarbonatmembranet i allmänhet flyter i supernatantfraktionen, kan det kasseras med hjälp av en steril pipettspets. Om membranet fortfarande ingår i pelleten, lämna det och ta bort det i slutet av nästa steg.
- Återsuspendera pelleten i 300 μl varmt trypsin, virvla röret i 10 s och placera det i ett 37 °C vattenbad i 1 min.
- Stoppa den enzymatiska matsmältningen genom att tillsätta 1 ml varm ren FBS. Med en 1 ml mikropipett, aspirera mekaniskt och dispensera mediet för att helt dissociera skivan.
VARNING: Aspirations-/doseringssteget måste vara mycket snabbt, annars kommer pärlorna att sedimentera inuti spetsen. - Centrifugera röret i 5 min vid 1 575 × g. Återsuspendera pelleten i 3 ml 1x PBS kompletterat med 10% FBS.
- Låt pärlorna sedimentera i 5 s innan du samlar supernatanten och filtrerar den genom en 35 μm cellsil placerad på ett uppsamlingsrör. Centrifugera det hämtade filtratet i 5 min vid 1 575 × g. Räkna cellerna med trypanblå för att utvärdera livskraften och fortsätt till flödescytometrianalyser.
OBS: Antalet livskraftiga celler som hämtas efter trypanblå inkubation är ~ 1-2 × 105 celler per smält insats.
- Flödescytometrimärkning av hämtade celler
OBS: Cellerna som hämtas från den 3D-benmärgsliknande strukturen kan märkas och analyseras ytterligare med flödescytometri. Använd en blandning av antikroppar för att detektera de olika facken efter 3D-dissociation. Här användes CD45 (fläckar de hematologiska cellerna av intresse), CD31 (fläckar kärlfacket) och CD73 (fläckar det osteoblastiska facket) vid 1 μL i 50 μL PBS + 2% FBS. Håll alla beredda celler och antikroppar på is (4 °C) borta från ljus under hela processen.- Återsuspendera pelletsen i antikroppsblandningen och inkubera i 30-40 min på is bort från ljus.
- Tillsätt 1 ml PBS + 2% FBS för att tvätta cellerna och centrifugera i 5 minuter vid 1 575 × g.
- Återsuspendera den hämtade pelleten i 200 μL 1x PBS + 10% FBS kompletterat med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, utspädd 1:2,000).
- Analysera rören i en cytometer med följande parametrar: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Använd ett FSC-H kontra FSC-W-diagramdiagram för att porta singletpopulationen. I singlet-fraktionen använder du ett DAPI-A kontra FSC-A-diagramdiagram för att bestämma den livskraftiga cellpopulationen (DAPI-negativ). Med den DAPI-negativa populationen tidigare gated, använd en APC-A kontra FSC-A-grafdiagram för att bestämma den CD45-positiva populationen.
- Fixering av den 3D-benmärgsliknande strukturen
OBS: Fixering av den 3D BM-liknande strukturen utförs vanligtvis för immunhistokemi eller immunofluorescens för att visualisera celler in situ och för ytterligare specifik färgning.- För att fixa den BM-liknande strukturen, överför insatsen (steg 4.3) från den gamla plattan till en ny 6-brunnsplatta fylld med 1x PBS. Byt sedan försiktigt ut mediet inuti insatsen med 1x PBS.
OBS: Spola inte den bildade strukturen med PBS; vätskans tryck kan försämra 3D-strukturen. - När insatsen har tvättats, placera den i en ny 6-brunnsplatta och fyll både brunnen och insatsen med nyöppnad paraformaldehyd (PFA) 4% (utspädd 16% i 1x PBS).
- Låt fixeringsprocessen fortsätta i 4 timmar vid rumstemperatur borta från ljus.
- I slutet av fixeringsprocessen, tvätta insatsen en gång med 1x PBS och förvara den vid 4 ° C borta från ljus.
- Skär membranet längst ner på skäret enligt beskrivningen i steg 5.2.2 för att hämta den fasta skivan.
- Inkubera skivan 4x i 48 timmar i EDTA (0,5 M, pH 8) för att avkalka strukturen.
- Bädda in strukturen i paraffin och skiva 4 μm tjocka sektioner.
- Använd en automatiserad immunstainer och inkubera sektionerna med anti-CD45, anti-CD73 och Ki67-antikroppar. Visualisera färgningen med ett anti-kanin eller -mus häst rädisperoxidas (HRP) och med 3,3'-diaminobenzidin som kromogent substrat och motfärga med Gill's-hematoxylin.
- För att fixa den BM-liknande strukturen, överför insatsen (steg 4.3) från den gamla plattan till en ny 6-brunnsplatta fylld med 1x PBS. Byt sedan försiktigt ut mediet inuti insatsen med 1x PBS.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att rekapitulera en minimal, in vitro, 3D, human BM-liknande mikromiljö, från vilken livskraftiga celler från tre olika cellfack kan hämtas (figur 1). Efter den önskade exponeringen kan faktiskt 3D BM-liknande strukturer dissocieras och MSC: erna, endotelcellerna och hematopoetiska celler kan utvärderas / karakteriseras med hjälp av flödescytometri (figur 2A). Hittills tyder resultaten på att det är möjligt att behålla hematologiska celler i minst 6 veckor inom 3D-modellen innan man hämtar livskraftiga celler (figur 2B). Framtida undersökningar krävs dock för att uppskatta gränsen för denna 3D-modell. Dessutom är det vid behov möjligt att ersätta HS27A-cellinjen med primär normal benmärg (NBM) MSC eller akut myeloisk leukemi (AML) MSC i denna 3D BM-liknande modell (figur 2C) eller ersätta den hematopoetiska cellinjen med primära HSC (figur 2D). Dessutom, när man analyserar interaktionerna mellan cellfack eller lokalisering av specifika markörer av intresse, kan 3D BM-liknande strukturer fixeras och bearbetas vidare med paraffinbäddning och immunkemi. Till exempel utfördes analysen av CD45 (hematologiskt) eller CD73 (MSC) innehåll med hjälp av dessa 3D-modeller (Figur 3).
Figur 1: Schematiskt diagram över den ursprungliga installationen av det mänskliga 3D BM-liknande systemet. Efter 3 veckors samodling kan fast BM-liknande vävnad samlas in eller utsädes med hematopoetiska celler (som i exemplet) eller andra celltyper. Vid behov, när cellerna är vidhäftande, kan behandling tillsättas och medelstora förändringar utförs två gånger i veckan. I slutet av experimentet kan BM-liknande strukturer antingen fixeras och bearbetas ytterligare för lokaliseringsstudier eller dissocieras för att utvärdera cellinnehållet. Förkortningar: BCP = bifasiskt kalciumfosfat; BM = benmärg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Återvinning av livskraftiga celler från olika fack efter odling i den BM-liknande 3D-modellen. (A) Typiskt mönster för cellåtervinning från en dissocierad BM-liknande struktur med 9,84% av livskraftiga celler (DAPI-). Representativa diagram av hematopoetiska (66,6% CD45+), MSC/osteoblastceller (88,6% CD73+ -celler inom CD45-populationen) och endotelceller (22,1% CD31+ -celler inom CD45-populationen) återhämtade sig efter 3D-dissociation. (B) 3D-systemet möjliggör underhåll av livskraftiga hematopoetiska celler (CD45+) upp till 6 veckor efter odling. (C) 3D-system tillverkade av primära MSC från NBM eller AML tillsammans med HMEC-1 (färgade med Kusabira-Orange i detta exempel) kan upprätthålla HSC (3,88% CD45 + DAPI-celler) på plats (D). Förkortningar: BM = benmärg; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MSC = mesenkymal stamcell; NBM = normal benmärg; AML = akut myeloisk leukemi; HSC = hematopoetiska stamceller; FSC = framåtspridning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering av cellinteraktioner och proliferation inom den BM-liknande 3D-modellen. System samlades in efter 3 veckors 3D-samodling med HS27A och HMEC-1 och tillsats av hematopoetiska celler efter 1 vecka. Typisk immunohistokemifärgning (visualiserad i brunt) av IHC visualiserades med hjälp av ett antikanin- eller mushästrädisperoxidas och visualiserades med 3,3′-diaminobenzidin som ett kromogent substrat och motarbetades med Gills-hematoxylin och visar närvaron av antingen hematopoetiska celler med CD45 (vänster panel), stromaceller med CD73 (mittpanel) eller proliferation av alla celler med KI67 (höger panel). Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: BM = benmärg; IHC = immunohistokemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
En av de nuvarande utmaningarna för studier om mänskliga fysiologiska och associerade patologiska problem är bristen på modeller som exakt efterliknar de mänskliga organens komplexa funktioner. När det gäller mänskliga BM 3D-modeller använder många modeller hydrogeler och reproducerar delvis BM, vilket illustrerar kraften i 3D-odlingsförhållanden jämfört med klassiska 2D-kulturer för att säkerställa till exempel en bättre osteoblastisk differentiering27,28. Trots god reproducerbarhet och användarvänlighet efterliknar dessa system inte den mänskliga BM 3D-strukturen och arkitekturen, vilket kan påverka ytterligare analyser avsevärt. Tekniska framsteg har gjort det möjligt för forskare att bättre reproducera den inhemska mänskliga osteoblastiska nischmiljön med hjälp av ett perfusionsbaserat bioreaktorsystem för att upprätthålla vissa HSC-egenskaper29. Utvecklingen av mikrofluidiska anordningar har lett till nya metoder för att reproducera en relevant benmärgsliknande struktur, men har hittills endast uppnått begränsade egenskaper hos benmärgen och har därför begränsade tillämpningar30,31,32,33.
Framsteg inom materialvetenskap har bidragit till utvecklingen av ett brett spektrum av naturliga eller syntetiska biomaterial, som kan användas för att utveckla relevanta 3D-benodlingssystem. Sådana system är dock ibland svåra att utveckla i vanliga biologiska laboratorier utan interna färdigheter i biofysik. Dessutom uppnår dessa system i de flesta fall en begränsad förmåga att efterlikna 3D-strukturen hos det mänskliga benet, inklusive BM-mikromiljön, och har använt stora mängder cytokiner och tillväxtfaktorer, vilket skapar ett artificiellt rikt odlingsmedium34.
Valet att inducera osteoblastisk differentiering snarare än adipocytisk differentiering baserades på det faktum att preosteoblaster och osteoblaster har beskrivits som en del av endostealnischen35. Detta identifierade osteoblastiska celler som begärda komponenter i både ben och benmärg. Bland benmärgens cellulära komponenter upptar endotel- och stromaceller en stor del av mikromiljön. Dessutom producerar dessa två celltyper strukturella icke-cellulära komponenter i den extracellulära matrisen och cytokiner som är involverade i reglering av homeostas och differentiering, som här begärs för att generera en förkalkad struktur. Således motiverar detta användningen av endotel- och stromaceller och vårt val av cellinjer för att möjliggöra enkel åtkomst och öka reproducerbarheten mellan laboratorier. Eftersom kulturen av HMEC-1-linjen var mer stabil över tiden behölls denna cellinje för utvecklingen av 3D-systemet. För stromaceller jämförde vi i 2D-odling osteoblastdifferentieringskapaciteten hos de stromala cellinjerna härledda från normal benmärg: HS5 och HS27A. Vi fann att HS5-linjen inte differentierade lika mycket som HS27A-linjen i 3D-systemet som genererades med någon av cellinjerna. I detta avseende har försök att ersätta HS27A-celler med HS5-linjen resulterat i produktion av en mindre styv struktur, vilket tyder på att HS27A är mer lämpliga.
Både HS27A- och HMEC-1-cellinjer odlades i olika mediekombinationer, där man framkallar den bästa styva strukturen och inriktningarna av HMEC-1 längs osteoblaststrukturer så att produktionen av den extracellulära matrisen ger en relativ styvhet till grundstrukturen. Analys av utvecklingen av differentiering vid D14 visade att differentieringen var mer avancerad vid D21 (mätning av BSP, sen osteoblastisk markör), med ett förhållande 1: 2 för HMEC-1: HS27A och med bättre resultat när 2 × 106 HS27A introducerades. Endotelceller har också en viktig roll för att reglera homeostas och differentiering (bland annat genom tillförsel av cytokiner). Det faktum att HMEC-1-celler upprätthålls i detta system indikerar att de åtminstone kan uppfylla denna roll, och detta bidrar till legitimiteten för vår modell. För HMEC-1-endotellinjen var det viktigt att introducera den tillräckligt tidigt så att den kunde integreras ordentligt i strukturen och med hopp om att dessa celler kunde bilda inriktningar eller till och med rör i strukturen. Samodlingstester av HS27A och HMEC-1 utfördes genom att introducera den senare i olika steg: D0, D7, D14; Ingen märkbar skillnad observerades, varken i differentieringen av stromaceller eller i underhållet eller positioneringen av endotelcellerna. Således introducerades dessa celler i början av processen. Hematopoetiska celler introducerades vid en tidpunkt då osteoblastisk differentiering skulle vara tillräckligt avancerad för att gynna cell-cellinteraktioner. Detta val var också betingat av det faktum att denna osteoblastiska differentiering är konditionerad av användningen av ett medium, vilket enligt våra tester inte helt stöder underhållet av de hematopoetiska cellerna. Hematologiska celler kan vara antingen cellinjer eller primära BM CD45 hematopoetiska celler.
Från denna 3D-modell kan vi tänka oss att ersätta varje celltyp med primära celler, normala eller patologiska, eller till och med att lägga till andra celltyper för att öka biomimetiska egenskaper, såsom immunceller, adipocyter eller fibroblaster26. Faktum är att HS27A-cellinjen har ersatts med primära BM MSC med låg passaging. På liknande sätt ersattes hematologiska cellinjer med primära BM-hematopoetiska celler. Ersättningen av HMEC-1-celler med primära endotelceller har dock inte testats ännu. För närvarande kan denna modell fortfarande förbättras när det gäller vaskulaturrepresentation, eftersom även om endotelceller är närvarande och korrekt interagerar med andra celler från mikromiljön (t.ex. hematopoetiska celler), bildar de inte strukturerade kärl, vilket utesluter flödesperfusion för att efterlikna funktionella blodkärl. Sammantaget kan detta gradvis öka komplexiteten och representativiteten hos den nuvarande minimala 3D-modellen. Tillägg av andra celltyper kan underlätta studier som undersöker andra frågor, såsom vikten av lokal BM-inflammation eller resistens mot immunterapi.
Detta 3D-system behöver dock 3 veckor innan celler av intresse, hematologiska celler eller epitelcancerceller om metastaseringsprocessen utvärderas, kan läggas till. Sterila förhållanden måste upprätthållas, eftersom medelstora förändringar två gånger i veckan ibland kan leda till medium kontaminering. Vidare, eftersom vissa celler kan migrera genom inläggets porer och börja sprida sig i brunnen, vilket leder till ökad medelförbrukning, rekommenderas regelbunden övervakning.
Vi beskrev här en 3D-ställning som möjliggör osteoblastisk differentiering och utvecklade en relevant, in vitro , 3D, mänsklig BM-liknande mikromiljö. Detta system möjliggör in situ-analys och ultimat hämtning av levande celler. Detta system ger ett nytt och mycket flexibelt verktyg, reproducerbart och användarvänligt, med ett brett spektrum av applikationer för att studera interaktioner och mekanismer inom den mänskliga BM-mikromiljön.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar P. Battiston-Montagne och A. Jambon från CRCL-cytometriplattformen och N. Gadot och C. Leneve från Research Pathology Platform, Institutionen för translationell forskning och innovation, Centre Léon Bérard. Författarna är tacksamma mot B. Manship för den engelska upplagan. Detta arbete finansierades av Inserm och FI-LMC till V. M. S., och S. L. K. A. och L. B. stöddes av ett bidrag från Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S.
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
