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Biology

रूपात्मक अवलोकन और बैक्टीरियल सेल क्षति विश्लेषण के लिए एक त्वरित तकनीक के रूप में संपर्क मोड परमाणु बल माइक्रोस्कोपी

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/64823
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Centro Universitario de los Lagos, Universidad de Guadalajara, 2Centro Nacional de Recursos Genéticos, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Summary

यहां, हम जीवाणु लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और तेज़ विधि के रूप में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के आवेदन को प्रस्तुत करते हैं और बैक्टीरिया के आकार और आकार, बैक्टीरियल कल्चर बायोफिल्म और जीवाणुनाशकों के रूप में नैनोकणों की गतिविधि जैसे विवरणों का विश्लेषण करते हैं।

Abstract

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए आवश्यक उपकरणों में से एक है। हालांकि, अवलोकन के लिए नमूना तैयार करने के कारण प्रक्रिया जटिल और महंगी है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) तीन आयामों में इसके उच्च रिज़ॉल्यूशन के कारण और वैक्यूम और नमूना चालकता के लिए किसी भी आवश्यकता की अनुपस्थिति के कारण एक बहुत ही उपयोगी लक्षण वर्णन तकनीक है। एएफएम विभिन्न टोपोग्राफऔर विभिन्न प्रकार की सामग्रियों के साथ विभिन्न प्रकार के नमूनों की छवि बना सकता है।

एएफएम एंगस्ट्रॉम स्तर से माइक्रोन पैमाने तक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी स्थलाकृति जानकारी प्रदान करता है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के विपरीत, एएफएम एक नमूने की सतह स्थलाकृति की छवि उत्पन्न करने के लिए एक जांच का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल में, इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया के रूपात्मक और कोशिका क्षति लक्षण वर्णन के लिए सुझाया जाता है। स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एटीसीसी 25923), एस्चेरिचिया कोलाई (एटीसीसी 25922), और स्यूडोमोनास हुनानेंसिस (लहसुन बल्ब के नमूनों से अलग) के उपभेदों का उपयोग किया गया था। इस काम में, बैक्टीरिया कोशिकाओं को विशिष्ट संस्कृति मीडिया में उगाया गया था। सेल क्षति का निरीक्षण करने के लिए, स्टेफिलोकोकस ऑरियस और एस्चेरिचिया कोलाई को नैनोकणों (एनपी) की विभिन्न सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किया गया था।

बैक्टीरियल सस्पेंशन की एक बूंद को ग्लास सपोर्ट पर तय किया गया था, और अलग-अलग पैमानों पर एएफएम के साथ छवियां ली गई थीं। प्राप्त छवियों ने बैक्टीरिया की रूपात्मक विशेषताओं को दिखाया। इसके अलावा, एएफएम को नियोजित करते हुए, एनपी के प्रभाव के कारण सेलुलर संरचना को होने वाले नुकसान का निरीक्षण करना संभव था। प्राप्त छवियों के आधार पर, संपर्क एएफएम का उपयोग एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। एएफएम बैक्टीरिया पर एनपी के प्रभावों की जांच के लिए भी एक उपयुक्त उपकरण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में, एएफएम एक सस्ती और उपयोग में आसान तकनीक है।

Introduction

विभिन्न जीवाणु आकृतियों को पहली बार 17वीं शताब्दी में एंटनी वैन लीउवेनहोक द्वारा नोट किया गया था। बैक्टीरिया प्राचीन काल से आकार की एक बड़ी विविधता में मौजूद हैं, जो गोले से लेकर शाखाओं की कोशिकाओं तकहैं। सेल आकार बैक्टीरियल टैक्सोनॉमिस्टों के लिए प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों का वर्णन और वर्गीकरण करने के लिए एक मौलिक स्थिति है, मुख्य रूप से ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव फ़ाइला3 के रूपात्मक पृथक्करण के लिए। कई तत्व बैक्टीरिया सेल रूपों को निर्धारित करने के लिए जाने जाते हैं, जिनमें से सभी सेल कवर में शामिल होते हैं और सेल की दीवार और झिल्ली के घटकों के साथ-साथ साइटोस्केलेटन में भी समर्थन करते हैं। इस तरह, वैज्ञानिक अभी भी रासायनिक, जैव रासायनिक और भौतिक तंत्र और प्रक्रियाओं को स्पष्ट कर रहे हैं जो बैक्टीरिया कोशिका रूपों को निर्धारित करने में निहित हैं, जिनमें से सभी जीन के समूहों द्वारा परिभाषित किए जाते हैं जो बैक्टीरिया के आकार 2,4 को परिभाषित करते हैं।

इसके अतिरिक्त, वैज्ञानिकों ने दिखाया है कि रॉड का आकार संभवतः बैक्टीरिया कोशिकाओं का पैतृक रूप है, क्योंकि यह सेल आकार सेल-महत्वपूर्ण मापदंडों में इष्टतम दिखाई देता है। इस प्रकार, कोकी, सर्पिल, विब्रियो, फिलामेंटस और अन्य रूपों को विभिन्न वातावरणों के अनुकूलन के रूप में माना जाता है; दरअसल, विशेष आकृति विज्ञान स्वतंत्र रूप से कई बार विकसित हुए हैं, यह सुझाव देते हुए कि बैक्टीरिया के आकार विशेष वातावरण 3,5 के अनुकूलन हो सकते हैं। हालांकि, बैक्टीरिया कोशिका जीवन चक्र के दौरान, कोशिका का आकार बदल जाता है, और यह हानिकारकपर्यावरणीय परिस्थितियों के लिए आनुवंशिक प्रतिक्रिया के रूप में भी होता है। बैक्टीरियल सेल आकार और आकार बैक्टीरिया की कठोरता, मजबूती और सतह-से-मात्रा अनुपात को दृढ़ता से निर्धारित करते हैं, और इस विशेषता का उपयोग जैवप्रौद्योगिकी प्रक्रियाओं के लिए किया जा सकता है।

इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग उच्च आवर्धन के कारण जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जिसे प्रकाश-आधारित माइक्रोस्कोप से परे पहुंचा जा सकता है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकें हैं; हालांकि, नमूनों को उचित चित्र प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखने से पहले कुछ उपचारों की आवश्यकता होती है। नमूने पर एक सोने के कवर की आवश्यकता होती है, और कुल छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाने वाला समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए। इसके विपरीत, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) एक तकनीक है जिसका व्यापक रूप से सतहों के विश्लेषण में उपयोग किया जाता है, लेकिन जैविक नमूनों के अध्ययन में भी नियोजित किया जाता है।

सतह विश्लेषण में कई प्रकार के एएफएम मोड का उपयोग किया जाता है, जैसे संपर्क मोड, गैर-संपर्क मोड या टैपिंग, चुंबकीय बल माइक्रोस्कोपी (एमएफएम), प्रवाहकीय एएफएम, पीजोइलेक्ट्रिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (पीएफएम), पीक फोर्स टैपिंग (पीएफटी), संपर्क अनुनाद और बल की मात्रा। प्रत्येक मोड का उपयोग सामग्री के विश्लेषण में किया जाता है और सामग्री की सतह और उनके यांत्रिक और भौतिक गुणों के बारे में अलग-अलग जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, कुछ एएफएम मोड का उपयोग इन विट्रो में जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए किया जाता है, जैसे कि पीएफटी, क्योंकि पीएफटी एक तरल माध्यम7 में कोशिकाओं पर स्थलाकृतिक और यांत्रिक डेटा प्राप्त करने की अनुमति देता है।

इस काम में, हमने हर पुराने और सरल एएफएम मॉडल में शामिल सबसे बुनियादी मोड का उपयोग किया- संपर्क मोड। एएफएम 100 μm से कम क्षेत्रों को स्कैन करने के लिए एक तेज जांच (लगभग <50 एनएम व्यास) का उपयोग करता है। नमूने से जुड़े बल क्षेत्रों के साथ बातचीत करने के लिए जांच को नमूने के साथ संरेखित किया गया है। बल को स्थिर रखने के लिए सतह को जांच के साथ स्कैन किया जाता है। फिर, कैंटिलीवर की गति की निगरानी करके सतह की एक छवि उत्पन्न की जाती है क्योंकि यह सतह के पार चलती है। एकत्रित जानकारी सतह के नैनो-मैकेनिकल गुण प्रदान करती है, जैसे आसंजन, लोच, चिपचिपाहट और कतरनी।

एएफएम संपर्क मोड में, कैंटिलीवर को एक निश्चित विक्षेपण पर नमूने में स्कैन किया जाता है। यह नमूने (जेड) की ऊंचाई निर्धारित करने की अनुमति देता है, और यह अन्य इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप तकनीकों पर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। एएफएम सॉफ्टवेयर टिप और नमूना सतह के बीच बातचीत द्वारा 3 डी छवि स्कैन की पीढ़ी की अनुमति देता है, और टिप विक्षेपण एक लेजर और एक डिटेक्टर के माध्यम से नमूने की ऊंचाई से संबंधित है।

स्थिर बल के साथ स्थैतिक मोड (संपर्क मोड) में, आउटपुट दो अलग-अलग छवियां प्रस्तुत करता है: ऊंचाई (जेड स्थलाकृति) और विक्षेपण या त्रुटि संकेत। स्थैतिक मोड एक मूल्यवान, सरल इमेजिंग मोड है, विशेष रूप से हवा में मजबूत नमूनों के लिए जो स्थैतिक मोड द्वारा लगाए गए उच्च भार और मरोड़ बलों को संभाल सकते हैं। विक्षेपण या त्रुटि मोड निरंतर बल मोड में संचालित होता है। हालांकि, सतह संरचना में विक्षेपण संकेत जोड़कर स्थलाकृति छवि को और बढ़ाया जाता है। इस मोड में, विक्षेपण संकेत को त्रुटि संकेत के रूप में भी जाना जाता है क्योंकि विक्षेपण प्रतिक्रिया पैरामीटर है; इस चैनल में दिखाई देने वाली कोई भी विशेषता या आकृति विज्ञान फीडबैक लूप में "त्रुटि" के कारण है या, बल्कि, निरंतर विक्षेपण सेटपॉइंट बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रतिक्रिया लूप के कारण है।

एएफएम का अनूठा डिजाइन इसे कॉम्पैक्ट बनाता है - टेबलटॉप पर फिट होने के लिए काफी छोटा - जबकि परमाणु चरणों को हल करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन भी है। एएफएम उपकरण में अन्य इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप के लिए उपकरणों की तुलना में कम लागत है, और रखरखाव लागत न्यूनतम है। माइक्रोस्कोप को विशेष परिस्थितियों जैसे कि एक साफ कमरे या एक पृथक स्थान के साथ एक प्रयोगशाला की आवश्यकता नहीं होती है; इसे केवल एक कंपन-मुक्त डेस्क की आवश्यकता होती है। एएफएम के लिए, नमूनों को अन्य तकनीकों (गोल्ड कवर, स्लिमिंग) की तरह विस्तृत तैयारी से गुजरने की आवश्यकता नहीं है; केवल एक सूखा नमूना नमूना धारक के साथ संलग्न किया जाना है।

हम बैक्टीरिया आकृति विज्ञान और एनपी के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए एएफएम संपर्क मोड का उपयोग करते हैं। एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया की आबादी और सेलुलर आकृति विज्ञान को देखा जा सकता है, साथ ही बैक्टीरिया प्रजातियों पर नैनोकणों द्वारा उत्पादित सेलुलर क्षति भी। एएफएम संपर्क मोड द्वारा प्राप्त छवियां पुष्टि करती हैं कि यह एक शक्तिशाली उपकरण है और अभिकर्मकों और जटिल प्रक्रियाओं तक सीमित नहीं है, जिससे यह बैक्टीरिया के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल, तेज और किफायती तरीका बन जाता है।

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Protocol

1. जीवाणु अलगाव और पहचान

  1. लहसुन बल्ब मेरिस्टेम से एक एंडोफाइटिक तनाव का अलगाव:
    1. पहले से छिले हुए, कीटाणुरहित और कटे हुए लहसुन के बल्बों से मेरिस्टेम के 2 मिमी टुकड़े ट्रिप्टिककेस सोया एगर (टीएसए) पर एक समृद्ध विकास माध्यम के रूप में रखें, और 1 दिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. बैक्टीरियल कॉलोनियों के रूपात्मक अंतर के आधार पर- आकार, आकार, रंग, किनारे, संचारित प्रकाश, परावर्तित प्रकाश, बनावट, स्थिरता और वर्णक उत्पादन-विभिन्न देखे गए मोर्फोटाइप का वर्णन करें, और प्रत्येक मोर्फोटाइप की एक प्रतिनिधि कॉलोनी को क्रॉस-स्ट्रीक करके शुद्ध करें।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर 30% ग्लिसरॉल में सभी शुद्ध जीवाणु उपभेदों को संरक्षित करें।
    4. 16 एस आरडीएनए को अनुक्रमित करके यादृच्छिक रूप से चयनित स्ट्रेन (9एपी) की पहचान करें। हॉफमैन और विंस्टन8 की विधि का पालन करते हुए डीएनए निकालें।
    5. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा 16 एस आरआरएनए को 100 एनजी डीएनए, 1एक्स पोलीमरेज़ बफर, 4 एमएम एमजीसीएल2, 0.4 एमएम डीएनटीपी, 27 एफ /1492 आर यूनिवर्सल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 10 पीमोल और डीएनए पोलीमरेज़9 के 1 यू के साथ बढ़ाएं। निम्नलिखित थर्मल साइकलर स्थितियों का उपयोग करें: प्रारंभिक अस्वाभाविकता के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के 35 चक्र ों को डीनेचुरलाइजेशन तापमान के रूप में, 1 मिनट को संकरण तापमान के रूप में 56 डिग्री सेल्सियस पर, और विस्तार तापमान के रूप में 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट का उपयोग किया जाता है; और फिर अंतिम विस्तार के रूप में 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
    6. केशिका-अनुक्रम एक ही ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद; केशिका अनुक्रमण10 के लिए मैट्रिक्स इंस्टॉलेशन किट के साथ डिडोक्सी-टर्मिनल विधि का उपयोग करें, और एक स्वचालित मल्टीकेशिका सिस्टम11 में वैद्युतकणसंचलन करें।
    7. मैन्युअल रूप से अनुक्रमों को संपादित करें, ब्लास्ट खोज का उपयोग करके जेनबैंक लाइब्रेरी के साथ अनुक्रम की तुलना करें, और निकटतम प्रजातियों12,13 के साथ कम से कम 98.7% पहचान के स्वर्ण मानक के साथ तनाव की अस्थायी रूप से पहचान करें।
      नोट: स्ट्रेन 9एपी की पहचान स्यूडोमोनास हुनानेंसिस की प्रजातियों से संबंधित के रूप में की गई थी, जिसमें 99.86% की पहचान पी हुनानेंसिस एलवी (JX545210) स्ट्रेन के अनुक्रम के साथ हुई थी।

2. एएफएम द्वारा रूपात्मक अवलोकन के लिए जीवाणु नमूना तैयारी।

  1. बाँझ परिस्थितियों में, एक ग्लास स्लाइड पर बैक्टीरियल सस्पेंशन (स्यूडोमोनास हुनानेंसिस, स्टेफिलोकोकस ऑरियस) की एक बूंद रखें।
  2. सूखे हीटिंग द्वारा स्लाइड पर नमूने ठीक करें। नमूना सूखने तक स्लाइड को कई बार लौ पर धीरे से पारित करें।
    नोट: नमूनों का निर्धारण सूक्ष्म जीव विज्ञान में एक नियमित तकनीक है जो निश्चित प्रोकैरियोटिक जीवों का निरीक्षण करने और जीवित कोशिकाओं के रूप में उनकी संरचना को यथासंभव बारीकी से अनुकरण करने के लिए है।
  3. एक पेट्री डिश में निश्चित नमूने रखें, और उन्हें अवलोकन के लिए एएफएम उपकरण में ले जाएं।
    नोट: चूंकि नमूने समय के साथ मौसम की स्थिति से बदल सकते हैं, एएफएम उपकरण में विश्लेषण के लिए 24 घंटे का अधिकतम समय निर्धारित करें। नमूने धूल से मुक्त रखें।

3. बैक्टीरिया के खिलाफ एमजीओ नैनोकणों का जीवाणुरोधी प्रभाव

नोट: एमजीओ एनपी के संश्लेषण और लक्षण वर्णन को पहले14 प्रकाशित किया गया है। इस काम में, नैनोमटेरियल्स की जीवाणुरोधी गतिविधि का अनुमान नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (सीएलएसआई) मैनुअल के आधार पर लगाया गया था, जिसमें अवरोध15,16 के लिए मैक्रोडायल्यूशन और माइक्रोडायल्यूशन विधियों का उपयोग किया गया था।

  1. न्यूनतम निरोधात्मक गतिविधि (एमआईसी) और जीवाणुनाशक (सीएमबी) का अनुमान
    1. उपभेदों का पूर्ववृद्धि।
      1. 1 × 108 सीएफयू / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पौष्टिक शोरबा में एस्चेरिचिया कोलाई या स्टेफिलोकोकस ऑरियस की उचित मात्रा में टीका लगाएं।
      2. 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर निलंबन को इनक्यूबेट करें।
    2. अनुकूलित उपभेदों की वृद्धि।
      1. ट्यूब के निचले हिस्से को छूते हुए, निलंबन में एक बाँझ बैक्टीरियोलॉजिकल लूप डुबोएं।
      2. ईओसिन और मेथिलीन ब्लू एगर और पोषक तत्व ों पर लूप के साथ लकीर ें करें।
      3. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    3. मानकीकृत इनोकुलम की तैयारी के लिए कॉलोनियों का चयन
      1. बैक्टीरियोलॉजिकल लूप के साथ पेट्री डिश में कॉलोनी के शीर्ष को छूकर एक ही रूपात्मक प्रकार के साथ तीन से पांच उपनिवेश लें।
      2. मुलर-हिंटन शोरबा के 3-5 एमएल में चयन को स्थानांतरित और विसर्जित करें।
      3. 1 × 108 सीएफयू / एमएल या 2 × 108 सीएफयू / एमएल की टर्बिडिटी प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (± 2 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: इस काम में, मैकफारलैंड टर्बिडिटी मानकों का उपयोग बैक्टीरियोलॉजिकल निलंबन के संदर्भ के रूप में किया गया था; विशेष रूप से, 0.5 मानक लगभग 1.5 × 108 कोशिकाओं / एमएल के एक सजातीय ई कोलाई निलंबन से मेल खाता है। टर्बिडिटी को मापने के लिए एक यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग किया गया था।
      4. 1 एमएल लें, और इसे बाँझ शोरबा के 9 एमएल में जोड़ें। इस तनुकरण का 200 μL लें, और इसे 5 × 105 CFU / mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ शोरबा के 19.8 मिलीलीटर में जोड़ें।
    4. एमजीओ नैनोकणों की आवश्यक सांद्रता।
      1. समाधान की तैयारी के लिए एक अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग करें।
      2. सीरियल समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक एकाग्रता से दोगुनी सांद्रता पर बाँझ पानी में नैनोमटेरियल को निलंबित करें।
      3. प्रयोग के लिए आवश्यक सांद्रता की नई सीमा प्राप्त करने के लिए मुलर-हिंटन शोरबा युक्त बाँझ ट्यूबों में इन निलंबन ों को जोड़ें।
        नोट: निम्नलिखित एमजीओ एनपी सांद्रता को माइक्रोडाइल्यूशन के लिए लागू किया गया था: 30 पीपीएम, 60 पीपीएम, 120 पीपीएम, 250 पीपीएम, 500 पीपीएम, 1,000 पीपीएम, 2,000 पीपीएम, 3,000 पीपीएम, 4,000 पीपीएम, और 8,000 पीपीएम।
    5. माइक्रोडायल्यूशन15 की तैयारी।
      1. एक नई और बाँझ 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट (माइक्रोप्लेट) तैयार करें। माइक्रोप्लेट के कॉलम नंबर 12 को बाँझपन कॉलम के रूप में लेबल करें; स्तंभ संख्या 11 को विकास नियंत्रण स्तंभ के रूप में लेबल करें.
      2. कॉलम नंबर 1-10 में विभिन्न सांद्रता के साथ नैनोपार्टिकल निलंबन के 120 μL जोड़ें।
      3. कॉलम नंबर 1-10 में कुओं में बैक्टीरिया के 120 μL (5 ×10 5 सीएफयू / एमएल) को टीका लगाएं।
        नोट: इस अध्ययन के लिए, पंक्ति जी और पंक्ति एच सीएलएसआई मानकों द्वारा सुझाए गए सांद्रता पर सेफ्ट्रियाक्सोन के साथ नियंत्रण थे: 8 पीपीएम, 4 पीपीएम, 2 पीपीएम, 1 पीपीएम, 0.5 पीपीएम, 0.25 पीपीएम, 0.125 पीपीएम, 0.06 पीपीएम, और 0.03 पीपीएम।
      4. 37 डिग्री सेल्सियस (35 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर 24 घंटे के लिए 96-वेल माइक्रोप्लेट को इनक्यूबेट करें। अंत में, कुओं का विश्लेषण करें।
  2. एएफएम द्वारा जीवाणु उपभेदों में एमजीओ नैनोपार्टिकल-प्रेरित मोर्फो-संरचनात्मक परिवर्तनों का अवलोकन
    1. माइक्रोडायल्यूशन परीक्षणों के कुओं से 250 μL लें, 750 μL बाँझ पानी के साथ मिलाएं, और 2,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट से 5 मिनट तक 5 डिग्री सेल्सियस पर करें।
    2. हर बार 1 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ अवक्षेप को तीन बार धोएं, और धोने के अंत में, उनमें 500 μL पानी जोड़ें।
    3. एएफएम छवियों को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक शुरुआत ी अच्छी तरह से अंतिम निलंबन का 10-20 μL लें, अल्ट्रासाउंड (30 मिनट) द्वारा पहले साफ की गई स्लाइड पर स्मीयर करें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सुखाएं।

4. एएफएम माप

नोट: यहां, संपर्क मोड में परमाणु बल माइक्रोस्कोप को एक एंटी-कंपन वर्कस्टेशन पर रखा गया था जिसने किसी भी यांत्रिक कंपन स्रोतों से माइक्रोस्कोप के अलगाव की अनुमति दी और सिस्टम को समतल रखा। लाइन फिल्टर और सर्ज प्रोटेक्शन के साथ विद्युत हस्तक्षेप कम हो जाता है। यहां इस्तेमाल किया जाने वाला एएफएम लेजर बीम को फोटोडिटेक्टर से ऑटो-संरेखित करता है।

  1. कंप्यूटर और AFM चालू करें, फिर सॉफ़्टवेयर टूल में संपर्क मोड, ContaI-G प्रोब्स और ऑटो स्लोप विकल्प का चयन करें। जेड-नियंत्रक के डिफ़ॉल्ट मान सेटपॉइंट = 20 एनएम, पी-गेन = 10,000, आई-गेन = 1,000, डी-गेन = 0, और टिप वोल्टेज = 0 एमवी हैं।
  2. नमूने को 70 μm स्कैन रेंज हेड का उपयोग करके AFM संपर्क मोड में रखें। हमने 0.13 एन / एम के स्प्रिंग स्थिरांक के साथ कॉन्टै-जी सिलिकॉन कैंटिलीवर का उपयोग किया।
  3. जांच के तहत क्षेत्र की सतह का त्वरित दृश्य प्राप्त करने के लिए स्कैन हेड में एकीकृत दो लेंस ों पर लगे कैमरा डिवाइस का उपयोग करें।
  4. वांछित क्षेत्र चुनने के लिए मैन्युअल रूप से एक्सवाई विमान में विस्थापन करें। संपर्क की स्थिति तक पहुंचने तक सतह के नमूने से इलेक्ट्रॉनिक रूप से संपर्क करने के लिए जांच की जाती है। एक्सवाई दिशाओं में ढलानों को कम करके स्कैनर और नमूना सतह के एक्सवाई माप विमान को इलेक्ट्रॉनिक रूप से समायोजित करें।
  5. सॉफ्टवेयर के मानक मापदंडों का उपयोग करें: 256 अंक प्रति लाइन पर 1 लाइन प्रति सेकंड।
  6. सबसे पहले, 70 μm x 70 μm क्षेत्र की एक पूर्ण स्कैन रेंज करें; फिर, ज़ूम टूल का उपयोग करके एक छोटे क्षेत्र का चयन करें। एएफएम स्वचालित रूप से जेड में चार्ट रेंज को अनुकूलित करता है।
    नोट: प्रति सेकंड लाइनों को कम करके, कुल स्कैन समय बढ़ जाता है, स्कैन की गुणवत्ता अधिक परिभाषित होती है, और माप से कुछ शोर भी साफ हो जाता है।
  7. नमूने से एक नया क्षेत्र चुनने के लिए, कैंटिलीवर को इलेक्ट्रॉनिक रूप से वापस लें, और नमूने को एक्सवाई विमान के साथ स्थानांतरित करें। चरण 4.5 और चरण 4.6 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके एक नया स्कैन महसूस करें।
    नोट: प्राप्त स्कैन को एकल-रंग बार स्केल में दिखाया गया है, जिसमें हल्के रंग उच्च ऊंचाई से जुड़े हैं, और गहरे रंग गहरी ऊंचाई से जुड़े हैं। एएफएम सॉफ्टवेयर स्कैन का एक 3 डी दृश्य उत्पन्न करता है जो मापा सतह के विवरण की सराहना की अनुमति देता है।
  8. फ़िल्टर चयन में छवि के उपकरण मेनू में लाइन लेवलिंग द्वारा लाइन का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग करें, जो सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली और सरल लेवलिंग विधि है।
    नोट: यह लेवलिंग विधि एएफएम छवि में उत्पादित हर क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर रेखा लेती है और इसे बहुपद समीकरण में फिट करती है।
  9. सर्वोत्तम छवि रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए दाईं ओर रंग पट्टी में अधिकतम और न्यूनतम ऊंचाई अनुकूलित करें।
  10. उपकरण पट्टी में विश्लेषण मेनू का उपयोग कर छवि विश्लेषण करें। वांछित उपकरण का चयन होने के बाद प्रारंभिक और अंतिम बिंदुओं का चयन करके ऊंचाइयों और दूरी का निर्धारण करें।
    नोट: लेवलिंग प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले चपटेपन के कारण टिप-छवि कलाकृतियों से बचने के लिए उपयोगकर्ताओं को टूल मेनू के विभिन्न फ़िल्टर ों का प्रयास करना चाहिए। छवि कलाकृतियां लकीर रेखाओं के रूप में दिखाई देती हैं और एएफएम छवियों में से कुछ में दिखाई देती हैं।

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Representative Results

एस ऑरियस और पी हुनानेंसिस उपभेदों की आकृति विज्ञान और आकार के साथ-साथ दोनों उपभेदों के जनसंख्या संगठन की छवियों को संपर्क मोड में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा लिया गया था। एस ऑरियस छवियों से पता चला कि इसकी आबादी कोकी के समुच्चय वाले क्षेत्रों द्वारा वितरित की गई थी (चित्रा 1 ए)। पैमाने में वृद्धि के साथ, कोकी के जनसंख्या वितरण और आकृति विज्ञान की अधिक सराहना हुई (चित्रा 1 बी)। माइक्रोस्कोपी रिपोर्ट से पता चला है कि एस ऑरियस की आसन्न कोशिकाओं में एक छद्म-अर्धगोलाकार संरचना मौजूद थी, लेकिन सामान्य तौर पर, बैक्टीरिया ने कोशिका विभाजन के बाद कोकस के रूप में एक गोलाकार आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया, जैसा कि पहले एएफएम छवियों में दिखाया गया था। इसके अलावा, एएफएम संपर्क मोड छवियों ने कोकी के आकार के निर्धारण की अनुमति दी, जिसने 1.25 μm की औसत चौड़ाई दिखाई। 20 कोशिकाओं के माप से प्राप्त मान चित्र 2 में दिखाए गए हैं।

हुनानेंसिस के मामले में, ग्लास सपोर्ट की पूरी सतह पर एक सजातीय वितरण देखा गया, जिससे एक बैक्टीरियल मोनोलेयर का निर्माण हुआ, जो समर्थन (चित्रा 3 ए) का पालन करता था, जैसा कि ज़ुटियन एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था, जिसमें लेखकों ने पी ऑरेगिनोसा को एक ठोस समर्थन पर स्थिर किया और एक ही व्यवहार दिखाया। स्यूडोमोनास हुनानेंसिस बैक्टीरिया को रॉड के आकार का देखा गया, जिसकी लंबाई 1.9 μm (L) और चौड़ाई 0.9 μm (W) (चित्रा 3B, C) थी; ये डेटा 1.5-2.0 μm (L) और 0.6-0.9 μm (W) 17,18,19 के P. फ्लोरेसेंस के लिए रिपोर्ट किए गए मूल्यों के भीतर हैं।

एमजीओ एनपी की बातचीत के कारण मोर्फोस्ट्रक्चरल परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए, बैक्टीरियल उपभेदों को उपचार (माइक्रोडाइल्यूशन) के बाद एएफएम विश्लेषण के अधीन किया गया था। तीन समूहों को चित्र 4 और चित्र 5 में दिखाया गया है: चित्रा 4 ए-सी और चित्रा 5 ए-सी नियंत्रण हैं; चित्रा 4 डी-एफ और चित्रा 5 डी-एफ में छवियां एमआईसी में माइक्रोडायल्यूशन के परिणामों से प्राप्त की गई थीं; चित्रा 4 जी -1 और चित्रा 5 जी -1 की छवियां एमआईसी की तुलना में उच्च एकाग्रता पर प्राप्त की गई थीं।

चित्रा 4 ए-सी के ऊपरी समूह की छवियां एक चिकनी सतह और सजातीय आकृति के साथ स्टेफिलोकोकस ऑरियस के एक कोकस-प्रकार की कोशिका दिखाती हैं, जो माइक्रोडायल्यूशन तकनीक के अनुसार 24 घंटे के लिए म्यूलर-हिंटन शोरबा में उपयुक्त वातावरण में बढ़ी। औसत व्यास 1 μm ± 0.15 μm था। यह व्यास व्यावहारिक रूप से एनपी उपचार के बाद गायब हो गया, जैसा कि चित्रा 4 डी-एफ में दिखाया गया है, क्योंकि सेलुलर संरचना की गिरावट बहुत गंभीर थी। क्रॉस-सेक्शन के अनुसार, नियंत्रण के लिए औसत ऊंचाई 200 एनएम ± 50 एनएम थी; उपचारित कोशिकाओं की ऊंचाई नियंत्रण के सापेक्ष 40% (120 एनएम ± 5 एनएम) कम हो गई थी। छवियों में स्पष्ट रूप से सतह में परिवर्तन दिखाई देते हैं, जैसे कि पुटिकाओं का गठन, कणों के सीएमआई में एमजीओ एनपी के संपर्क में आने के बाद; इसके अतिरिक्त, सांद्रता को दोगुना करके, सेलुलर संरचनाओं की आंतरिक स्थिति प्रभावित हुई थी, और साइटोसोलिक सामग्री जारी की गई थी, जैसा कि चित्रा4 जी-आई 20,21 की छवियों में दिखाया गया है।

इन परिवर्तनों को ई कोलाई कोशिकाओं में भी पहचाना गया था, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, एस ऑरियस के समान स्थितियों के साथ। इस जीवाणु के नियंत्रण ने चिकनी सतहों को दिखाया, बिना किसी स्पष्ट परिवर्तन के इसके बहुत ही सजातीय रॉड जैसे आकार (बैसिलस) को उजागर किया। त्रि-आयामी छवियां सफेद रंग में सूक्ष्मजीव से जुड़े उच्चतम स्थलाकृतिक क्षेत्रों को दिखाती हैं। नियंत्रण ई कोलाई की औसत ऊंचाई 160 एनएम ± 50 एनएम थी, और क्रॉस-सेक्शनल छवियों के अनुसार, 500 पीपीएम (एमआईसी) के एमजीओ नैनोकणों की एकाग्रता के लिए 24 घंटे के लिए उजागर कोशिकाओं के लिए औसत ऊंचाई 76 एनएम ± 10 एनएम तक कम हो गई। संरचना 1,000 पीपीएम की एकाग्रता पर पूरी तरह से गायब हो गई, और केवल बैक्टीरिया के सिल्हूट को अलग किया जा सकता था। दोनों सांद्रता के लिए छवियों का विश्लेषण करते समय, यह देखा गया कि नियंत्रण के संबंध में, उपचारित कोशिकाओं की कोशिका आकृति विज्ञान में काफी बदलाव किया गया था, जिसमें 2.0 μm ± 0.5 μm (चित्रा 5A-C) से 3.0 μm ± 0.3 μm की लम्बाई थी, जैसा कि चित्रा 5D-I की छवियों में दिखाया गया है। यह वृद्धि स्पष्ट थी जब सेलुलर संरचना आंतरिक होमियोस्टैसिस खो रही थी, जिससे संरचनात्मक पतन20,22 हो रहा था। एमजीओ एनपी के संपर्क में आने वाले बैक्टीरिया की छवियों ने स्पष्ट रूप से सतह में परिवर्तन दिखाया जैसे कि रिज गठन या कोरुगेशन दोनों एमआईसी में वेसिकुलर गड़बड़ी पैदा करते हैं और जब सांद्रता20,22 को दोगुना कर दिया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: स्टेफिलोकोकस ऑरियस के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी संपर्क मोड। यह आंकड़ा विभिन्न पैमानों पर एस ऑरियस से लिए गए टोपोग्राफियों को दर्शाता है: (ए) 70 μm और (B) 5.0 μm। मानचित्रण क्षेत्रों को एस ऑरियस स्थलाकृति प्राप्त करने के लिए चुना गया था; छवि बी स्पष्ट रूप से एस ऑरियस कोकी को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: स्टेफिलोकोकस ऑरियस के परमाणु बल माइक्रोस्कोपी संपर्क मोड टोपोग्राफऔर हिस्टोग्राम। छवि गर्मी-निर्धारण प्रक्रिया का उपयोग करके ग्लास सपोर्ट पर तय किए गए एस ऑरियस बैक्टीरिया के व्यास के (ए) स्थलाकृति और (बी) हिस्टोग्राम को दिखाती है। सेल व्यास एएफएम सॉफ्टवेयर के साथ मापा गया था; n = 20 छवि माप का प्रतिनिधित्व है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: स्यूडोमोनास हुनानेंसिस 1एपी-सीवाई के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी संपर्क मोड। यह आंकड़ा विभिन्न पैमानों पर पी. हुनानेंसिस 1एपी-सीवाई से लिए गए टोपोग्राफियों को दर्शाता है: (ए) 70 μm, (B) 20 μm, और (C) 5.0 μm। विभिन्न पैमानों पर छवियां स्लाइड पर सेल आबादी के वितरण को दिखाती हैं। सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए, कम जनसंख्या घनत्व वाले क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, जैसा कि छवि बी में दिखाया गया है, जो पी हुनानेंसिस के रॉड आकार को दर्शाता है (स्थलाकृति छवि को बढ़ाने के लिए विक्षेपण संकेत दिखाया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. अनुपचारित एस ऑरियस (ऊपर) और एस ऑरियस के लिए प्राप्त एएफएम संपर्क मोड छवियों को 24 घंटे के लिए 250 पीपीएम और 500 पीपीएम एमजीओ नैनोकणों (मध्य और नीचे) के संपर्क में लाया गया। (ए, डी, जी) स्थलाकृतिक चित्र; (बी, ई, एच) तीन आयामी छवियां; (सी, एफ, आई) क्रॉस-अनुभागीय चित्र। एमजीओ (250 पीपीएम) और उच्च सांद्रता (500 पीपीएम) की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता को नियोजित करते समय बैक्टीरिया में संरचनात्मक परिवर्तन देखे गए। स्थलाकृति छवि को बढ़ाने के लिए विक्षेपण संकेत दिखाया गया है। चित्रा 4 ए, डी, जी मुनिज डियाज़ एट अल .14 से हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अनुपचारित ई कोलाई (ऊपर) और ई कोलाई के लिए प्राप्त एएफएम संपर्क मोड छवियां 24 घंटे के लिए 500 पीपीएम और 1,000 पीपीएम एमजीओ नैनोकणों (मध्य और नीचे) के संपर्क में हैं। (बी, ई, एच) तीन आयामी छवियां; (सी, एफ, आई) क्रॉस-अनुभागीय चित्र। एमजीओ (500 पीपीएम) और उच्च सांद्रता (1,000 पीपीएम) की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता को नियोजित करते समय बैक्टीरिया में संरचनात्मक परिवर्तन देखे गए। चित्रा 5 ए, डी, जी मुनिज डियाज़ एट अल .14 से हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइक्रोस्कोपी आमतौर पर जैविक प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली तकनीक है जो जैविक नमूनों की संरचना, आकार, आकृति विज्ञान और सेलुलर व्यवस्था की जांच के लिए अनुमति देती है। इस तकनीक को बेहतर बनाने के लिए, कई प्रकार के माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है जो उनकी ऑप्टिकल या इलेक्ट्रॉनिक विशेषताओं के संदर्भ में एक दूसरे से भिन्न होते हैं, जो उपकरण की संकल्प शक्ति निर्धारित करते हैं।

वैज्ञानिक अनुसंधान में, बैक्टीरिया कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग आवश्यक है; उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोपी ने प्रदर्शित किया है कि एनएसीएल ई कोलाई उपभेदों के थर्मल प्रतिरोध और कोशिका आकृति विज्ञान को प्रभावित करता है, शिसांद्रा चिनेंसिस अर्क एस ऑरियस की ओर जीवाणुरोधी प्रभाव दिखाता है, एस ऑरियस उपघातक गर्मी के झटके के बाद थर्मोटॉलरेंस विकसित करता है, और ई कोलाई बायोमिनरलप्लेटिनम 23,24,25,26,27 को प्रभावित करता है।. इस प्रकार, एएफएम द्वारा प्रस्तुत लाभों ने पर्यावरण और जीव विज्ञान के अनुसंधान क्षेत्रों में इसके विस्तार की अनुमति दी है।

परमाणु बल माइक्रोस्कोप एक उपकरण है जिसका उपयोग संपर्क मोड में सीटू में बैक्टीरिया का विश्लेषण करने के लिए और गैर-संपर्क मोड में मैक्रो- और नैनोस्कोपिक सामग्री की स्थलाकृति निर्धारित करने के लिए किया जाता है। अन्य तकनीकों पर एएफएम का लाभ यह है कि स्थलाकृतिक छवियों को प्राप्त करने के लिए कम नमूनों की आवश्यकता होती है; इसे एक गैर-विनाशकारी तकनीक भी माना जाता है, और यह विश्लेषण की गई छवि की संरचना को नुकसान या समझौता नहीं करता है। यद्यपि हमने इस प्रोटोकॉल में गर्मी निर्धारण का उपयोग किया, लेकिन जीवाणु कोशिका आकृति विज्ञान में बदलाव नहीं किया गया था। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि इस तकनीक का उपयोग आमतौर पर सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में जीवाणु आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। पौधे और पशु ऊतक के नमूनों के विपरीत, गर्मी निर्धारण तकनीक प्रोटीन और लिपिड में परिवर्तन पैदा करती है जो ऊतक बिगड़ने में प्रकट होती है; बैक्टीरिया में, तकनीक कोशिका के मामूली संकोचन का कारण बनती है जो कोशिका के आकार और पहचान के अवलोकन में हस्तक्षेप नहीं करती है।

एएफएम के साथ, नमूना तैयार करना आसान है और किसी भी रासायनिक उत्पादों की आवश्यकता नहीं है, जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के मामले में, जहां यह आवश्यक है कि विश्लेषण किया जाने वाला नमूना प्रवाहकीय है, क्योंकि छवि उपकरण और नमूने द्वारा उत्सर्जित इलेक्ट्रॉनों की बातचीत से उत्पन्न होती है। यदि नमूना प्रवाहकीय नहीं है, तो इसे भौतिक वाष्प जमाव तकनीक के माध्यम से सोने जैसे प्रवाहकीय तत्व के साथ धातुकृत किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का रिज़ॉल्यूशन लेंस और मॉडल के आधार पर 0.4 एनएम तक पहुंचता है, जबकि संपर्क मोड में एएफएम माइक्रोमीटर, नैनोमीटर या यहां तक कि पिकोमीटर रिज़ॉल्यूशन तक पहुंच सकता है, जो इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी22 के साथ प्रतिस्पर्धी बनाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर एएफएम का एक और लाभ यह है कि इसे नमूना प्रसंस्करण20,21 के लिए उच्च वैक्यूम स्थितियों की आवश्यकता नहीं होती है। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों पर एएफएम के अन्य फायदे कम लागत और कम छवि अधिग्रहण समय हैं।

एक ग्लास प्लेट में बैक्टीरिया के नमूने को ठीक करने की तकनीक के संबंध में, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि गर्मी निर्धारण एक तकनीक है जो आमतौर पर सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाती है। इस तकनीक का उपयोग इसलिए किया जाता है ताकि बैक्टीरिया के नमूनों को सरल या अंतर धुंधला करके पहचाना जा सके। इसी समय, बैक्टीरिया का आकार, आमतौर पर कोकी या रॉड, देखा जा सकता है। गर्मी निर्धारण तकनीक का एक नुकसान बैक्टीरिया के आकार में कमी है, लेकिन यह तकनीक बैक्टीरिया के आकार से समझौता नहीं करती है।

निर्धारण के बाद, नमूने की उम्र बढ़ने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो सेल के आकार में महत्वपूर्ण कमी के रूप में प्रकट हो सकती है; इसलिए, निर्धारण के 24 घंटे के भीतर नमूने का विश्लेषण करना उचित है। यह सुनिश्चित करने के लिए भी ध्यान रखा जाना चाहिए कि नमूना धूल के संपर्क में न आए; इसलिए, नमूने को एक बंद कंटेनर (जैसे, एक पेट्री डिश) में रखा जाना चाहिए। ये स्थितियां महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे प्राप्त एएफएम छवियों को बदल सकते हैं।

यह स्पष्ट है कि बैक्टीरिया के आकार को कम करने से कुछ शोध कार्य प्रभावित हो सकते हैं, साथ ही बैक्टीरिया को समर्थन से जोड़ने के अन्य तरीकों की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, 34 मिमी प्लेटों पर बीएम शोरबा में उगाए गए एस ऑरियस बायोफिल्म को ग्लिसराल्डिहाइड के साथ तय किया गया है। इसके अलावा, एस ऑरियस को पॉली-एल-लाइसिन के साथ इलाज किए गए वी-आकार के कैंटिलीवर के साथ स्थिर किया गया है, जबकि सी अल्बिकन्स के लिए, हाइफे को सकारात्मक रूप से चार्ज पॉली-एल-लाइसिन के साथ लेपित ग्लास स्लाइड पर तय किया गया है ताकि दोनों के अजैविक सतह28,29 पर आसंजन के दौरान अधिशोषित सीरम प्रोटीन के आदान-प्रदान का विश्लेषण किया जा सके।

इस काम में, हीट-फिक्सिंग नमूनों ने बैक्टीरिया द्वारा गठित आकार या समुच्चय को नहीं बदला, और गर्मी-फिक्सिंग ने नैनोकणों के प्रभाव को देखने की अनुमति दी। इसलिए, एएफएम टोपोग्राफर्स एस ऑरियस के पृथक कोकी या समुच्चय और पी हुनानेंसिस की छड़ों के आकार को दिखा सकते हैं (चित्र 1 और चित्रा 3)। इसके अलावा, हमने यह भी पाया कि एस ऑरियस और ई कोलाई ने एमजीओ नैनोकणों के प्रभाव के कारण अपनी संरचनाओं में नुकसान दिखाया, जबकि नियंत्रण नमूने (नैनोकणों के बिना) ने अपनी आकृति विज्ञान में कोई बदलाव नहीं दिखाया (चित्रा 4 और चित्रा 5)।

यह काम दर्शाता है कि एएफएम संपर्क मोड का उपयोग सतह टोपोलॉजी और जैविक नमूनों के दोषों को चिह्नित करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है, जैसा कि एस ऑरियस, पी हुनानेंसिस और ई कोलाई के साथ दिखाया गया है। इसके अलावा, गर्मी निर्धारण तकनीक एक निर्धारण कारक नहीं है जो सेल की सतह को बदल देती है और विश्लेषण को रोकती है। मामूली रूप से, हम सुझाव दे सकते हैं कि एएफएम के उपयोग में गर्मी निर्धारण एक फायदा हो सकता है। नमूने कम संसाधित होते हैं, और रासायनिक अभिकर्मकों के उपयोग से बचा जाता है। इसलिए, कार्यप्रणाली एक सरल और किफायती तकनीक है। यह ध्यान देने योग्य है कि यह किए जाने वाले विशिष्ट विश्लेषण के आधार पर बदल सकता है, जैसा कि बायोफिल्म और जीवाणु आसंजन28,29 के अध्ययन के लिए दिखाया गया है। इस काम के संभावित विस्तार के रूप में, संपर्क मोड एएफएम का उपयोग अन्य चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण बैक्टीरिया पर एनपी के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है या अनुसंधान में जिसमें सेल क्षति देखी जानी है।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

रामिरो मुनीज-डियाज़ छात्रवृत्ति के लिए CONACyT को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM EasyScan 2 NanoSurf discontinued Measurement Media
bacteriological loop No aplica not applicable instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1 ThermoFisher Scientific 4337455 Matrix installation kit
Bioedit not applicable version 7.2.5 Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer Agilent Technologies not applicable
ceftriazone Merck not applicable antibiotic
centrifuge eppendorf not applicable to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever BudgetSensors ContAl-G-10 Measurement Media
eosin and methylene blue agar Merck not applicable bacterial culture medium
Escherichia coli American Type Culture Collection ATCC 25922 bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8295 PCR of 16S rRNA gene
microplate Thermo Scientific 10558295 for microdilution analysis
Müller-Hinton broth Merck not applicable bacterial culture medium
nutrient agar Merck not applicable bacterial culture medium
nutritious broth Merck not applicable bacterial culture medium
Petri dishes not applicable not applicable growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP not applicable not applicable isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing Macrogen not applicable sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation ThorLabs
slides not applicable not applicable glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus American Type Culture Collection ATCC 25923 bacterial strain
Thermalcycler Applied Biosystems Veriti-4375786 PCR amplification
Trypticasein soy agar BD BA-256665 growth media
ultrasonicator Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC not applicable for mixing the nanoparticle dilutions

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