Summary
Здесь мы представляем применение атомно-силовой микроскопии (АСМ) как простого и быстрого метода характеристики бактерий и анализируем такие детали, как размер и форма бактерий, биопленки бактериальных культур и активность наночастиц в качестве бактерицидов.
Abstract
Электронная микроскопия является одним из инструментов, необходимых для характеристики клеточных структур. Однако процедура сложная и дорогостоящая из-за подготовки образца к наблюдению. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является очень полезным методом определения характеристик из-за ее высокого разрешения в трех измерениях и из-за отсутствия каких-либо требований к проводимости вакуума и образца. АСМ может получать изображения широкого спектра образцов с различной рельефностью и различными типами материалов.
АСМ предоставляет 3D-топографическую информацию высокого разрешения от уровня ангстрема до микронного масштаба. В отличие от традиционной микроскопии, АСМ использует зонд для создания изображения топографии поверхности образца. В этом протоколе предлагается использовать этот тип микроскопии для морфологической характеристики и характеристики повреждений клеток бактерий, закрепленных на носителе. Были использованы штаммы Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) и Pseudomonas hunanensis (выделенные из образцов луковиц чеснока). В этой работе бактериальные клетки были выращены в специфических питательных средах. Для наблюдения за повреждением клеток золотистый стафилококк и кишечная палочка инкубировали с различными концентрациями наночастиц (НУП).
Каплю бактериальной суспензии фиксировали на стеклянной подставке, а снимки делали с помощью АСМ в разных масштабах. Полученные изображения показали морфологические характеристики бактерий. Далее, используя АСМ, можно было наблюдать повреждение клеточной структуры, вызванное действием НУП. На основании полученных изображений контактный АСМ может быть использован для характеристики морфологии бактериальных клеток, закрепленных на носителе. АСМ также является подходящим инструментом для исследования воздействия НП на бактерии. По сравнению с электронной микроскопией, АСМ является недорогим и простым в использовании методом.
Introduction
Различные формы бактерий были впервые отмечены Антони ван Левенгуком в 17 веке1. Бактерии существовали в большом разнообразии форм с древних времен, начиная от сфер и заканчивая ветвящимися клетками2. Форма клеток является фундаментальным условием для бактериальных таксономистов при описании и классификации каждого вида бактерий, главным образом для морфологического разделения грамположительных и грамотрицательных типов3. Известно, что несколько элементов определяют формы бактериальных клеток, все из которых участвуют в клеточных покровах и опорах в качестве компонентов клеточной стенки и мембраны, а также в цитоскелете. Таким образом, ученые все еще выясняют химические, биохимические и физические механизмы и процессы, участвующие в определении форм бактериальных клеток, все из которых определяются кластерами генов, определяющих формы бактерий 2,4.
Кроме того, ученые показали, что форма палочки, вероятно, является предковой формой бактериальных клеток, поскольку эта форма клеток кажется оптимальной по значимым для клеток параметрам. Таким образом, кокки, спирали, вибрионы, нитевидные и другие формы рассматриваются как приспособления к различным средам; Действительно, определенные морфологии развивались независимо несколько раз, предполагая, что формы бактерий могут быть адаптацией к определенным средам 3,5. Однако на протяжении всего жизненного цикла бактериальной клетки форма клетки изменяется, и это также происходит как генетическая реакция на вредные условия окружающей среды3. Форма и размер бактериальных клеток в значительной степени определяют жесткость, прочность и отношение поверхности к объему бактерий, и эта характеристика может быть использована для биотехнологических процессов6.
Электронная микроскопия используется для изучения биологических образцов из-за большого увеличения, которое может быть достигнуто за пределами световых микроскопов. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) являются наиболее часто используемыми методами для этой цели; Тем не менее, образцы требуют некоторой обработки, прежде чем они будут помещены в камеру микроскопа для получения соответствующих изображений. На образцах требуется золотая крышка, а время, затрачиваемое на полное получение изображения, не должно быть слишком большим. Напротив, атомно-силовая микроскопия (АСМ) является методом, широко используемым при анализе поверхностей, но также используется при изучении биологических образцов.
Существует несколько типов режимов АСМ, используемых при анализе поверхности, таких как контактный режим, бесконтактный режим или постукивание, магнитно-силовая микроскопия (MFM), проводящая АСМ, пьезоэлектрическая силовая микроскопия (PFM), пиковая силовая резьба (PFT), контактный резонанс и объем силы. Каждый режим используется при анализе материалов и предоставляет различную информацию о поверхности материалов и их механических и физических свойствах. Тем не менее, некоторые режимы АСМ используются для анализа биологических образцов in vitro, такие как ПФТ, поскольку ПФТ позволяет получать топографические и механические данные о клетках в жидкой среде7.
В этой работе мы использовали самый основной режим, входящий в каждую старую и простую модель АСМ - контактный режим. АСМ использует острый зонд (диаметром около <50 нм) для сканирования областей менее 100 мкм. Зонд выравнивается по образцу, чтобы взаимодействовать с силовыми полями, связанными с образцом. Поверхность сканируется с помощью зонда, чтобы поддерживать постоянную силу. Затем изображение поверхности генерируется путем наблюдения за движением кантилевера при его движении по поверхности. Собранная информация обеспечивает наномеханические свойства поверхности, такие как адгезия, эластичность, вязкость и сдвиг.
В контактном режиме АСМ кантилевер сканируется поперек образца с фиксированным отклонением. Это позволяет определить высоту образцов (Z), и это представляет собой преимущество по сравнению с другими методами электронного микроскопа. Программное обеспечение AFM позволяет генерировать сканирование 3D-изображения за счет взаимодействия между наконечником и поверхностью образца, а отклонение наконечника коррелирует с высотой образца с помощью лазера и детектора.
В статическом режиме (контактный режим) с постоянной силой на выходе отображаются два разных изображения: высота (z-топография) и сигнал отклонения или ошибки. Статический режим является ценным и простым режимом визуализации, особенно для прочных образцов в воздухе, которые могут выдерживать высокие нагрузки и крутильные силы, оказываемые статическим режимом. Режим отклонения или ошибки работает в режиме постоянной силы. Тем не менее, топографическое изображение дополнительно улучшается за счет добавления сигнала отклонения к структуре поверхности. В этом режиме сигнал отклонения также называется сигналом ошибки, поскольку отклонение является параметром обратной связи; Любые особенности или морфология, которые появляются в этом канале, обусловлены «ошибкой» в петле обратной связи или, скорее, петлей обратной связи, необходимой для поддержания постоянного заданного значения отклонения.
Уникальная конструкция АСМ делает его компактным - достаточно маленьким, чтобы поместиться на столешнице, - а также имеет достаточно высокое разрешение для разрешения атомарных шагов. Оборудование АСМ имеет меньшую стоимость, чем оборудование для других электронных микроскопов, а затраты на обслуживание минимальны. Микроскоп не требует лаборатории с особыми условиями, такими как чистая комната или изолированное пространство; Ему нужен только стол без вибрации. Для АСМ образцы не нуждаются в сложной подготовке, как при других методах (золотое покрытие, похудение); К держателю образца должен быть прикреплен только сухой образец.
Мы используем контактный режим AFM для наблюдения за морфологией бактерий и воздействием НУП. Можно наблюдать популяцию и клеточную морфологию бактерий, закрепленных на носителе, а также клеточное повреждение, вызванное наночастицами на видах бактерий. Изображения, полученные в контактном режиме АСМ, подтверждают, что это мощный инструмент и не ограничен реагентами и сложными процедурами, что делает его простым, быстрым и экономичным методом характеристики бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение и идентификация бактерий
- Выделение эндофитного штамма из меристем луковиц чеснока:
- Поместите 2-миллиметровые фрагменты меристем из ранее очищенных, продезинфицированных и разрезанных луковиц чеснока на триптиказный соевый агар (TSA) в качестве богатой питательной среды и инкубируйте при 25 ° C в течение 1 дня.
- Основываясь на морфологических различиях бактериальных колоний - форме, размере, цвете, краях, проходящем свете, отраженном свете, текстуре, консистенции и производстве пигмента - описывают различные наблюдаемые морфотипы и очищают путем перекрестного полосирования репрезентативной колонии каждого морфотипа.
- Храните все очищенные штаммы бактерий в 30% глицерине при температуре -80 °C.
- Идентификация случайно выбранного штамма (9AP) путем секвенирования 16S рДНК. Извлеките ДНК по методу Хоффмана иУинстона 8.
- Амплификация 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со 100 нг ДНК, 1x полимеразным буфером, 4 мМ MgCl2, 0,4 мМ dNTP, по 10 пмоль универсальных олигонуклеотидов 27F/1492r и 1 ЕД ДНК-полимеразы9. Используйте следующие условия термоциклера: 95 °C в течение 5 минут для первоначальной денатурализации; затем следуют 35 циклов по 1 мин при 94 °C в качестве температуры денатурализации, 1 мин при 56 °C в качестве температуры гибридизации и 1 мин при 72 °C в качестве температуры расширения; а затем 10 мин при 72 °C в качестве окончательного продления.
- Капиллярная последовательность продукта ПЦР с использованием тех же олигонуклеотидов; Используйте дидезокситерминальный метод с матричным установочным комплектом для капиллярного секвенирования10 и выполняйте электрофорез в автоматизированной мультикапиллярной системе11.
- Вручную отредактируйте последовательности, сравните последовательность с библиотекой GenBank с помощью поиска BLAST и предварительно определите штамм с золотым стандартом не менее 98,7% идентичности с ближайшим видом12,13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм 9AP был идентифицирован как принадлежащий к виду Pseudomonas hunanensis с идентичностью 99,86% с последовательностью штамма P. hunanensis LV (JX545210).
2. Бактериальная пробоподготовка для морфологического наблюдения с помощью АСМ
- В стерильных условиях поместите каплю бактериальной суспензии (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) на предметное стекло.
- Зафиксируйте образцы на предметном стекле сухим нагревом. Осторожно проведите предметным стеклом над пламенем несколько раз, пока образец не высохнет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация образцов является обычным методом в микробиологии для наблюдения за фиксированными прокариотическими организмами и для моделирования их структуры как живых клеток как можно ближе. - Поместите фиксированные образцы в чашку Петри и отнесите их к оборудованию AFM для наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образцы могут изменяться в зависимости от погодных условий с течением времени, выделите максимум 24 часа для анализа в оборудовании AFM. Следите за тем, чтобы образцы не попадали в пыль.
3. Антибактериальное действие наночастиц MgO против бактерий
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез и характеристика НУП MgO были опубликованы ранее14. В данной работе антибактериальная активность наноматериалов оценивалась на основе руководства Института клинико-лабораторных стандартов (CLSI) с использованием методов макроразведения и микроразведения для ингибирования15,16.
- Оценка минимальной ингибирующей активности (MIC) и бактерицидов (CMB)
- Предварительный рост штаммов
- Инокулируйте соответствующее количество Escherichia coli или Staphylococcus aureus в питательный бульон, чтобы получить конечную концентрацию 1 × 108 КОЕ / мл.
- Инкубировать суспензию при 37 °C (± 2 °C) в течение 18-24 ч.
- Построст акклиматизированных штаммов
- Погрузите стерильную бактериологическую петлю в суспензию, касаясь дна пробирки.
- Нанесите полосы петлей на эозин и метиленовый синий агар и питательный агар.
- Инкубировать агаровые пластины при 37 °C (± 2 °C) в течение 24 ч.
- Отбор колоний для приготовления стандартизированного посевного материала
- Возьмите от трех до пяти колоний с одинаковым морфологическим типом, коснувшись бактериологической петлей верхней части колонии в чашке Петри.
- Перенесите и погрузите выделение в 3-5 мл бульона Мюллера-Хинтона.
- Инкубировать при 37 °C (± 2 °C) до достижения мутности 1 × 10 8 КОЕ/мл или 2 × 108 КОЕ/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе стандарты мутности Макфарланда использовались в качестве эталона для бактериологических суспензий; в частности, стандарт 0,5 приблизительно соответствует однородной суспензии E. coli 1,5 × 108 клеток/мл. Для измерения мутности использовался УФ-ВИД спектрофотометр. - Возьмите 1 мл и добавьте его к 9 мл стерильного бульона. Возьмите 200 мкл этого разведения и добавьте его к 19,8 мл стерильного бульона, чтобы получить конечную концентрацию 5 × 105 КОЕ / мл.
- Требуемые концентрации наночастиц MgO
- Используйте ультразвуковой аппарат для приготовления растворов.
- Суспендировать наноматериал в стерильной воде в концентрации, в два раза превышающей концентрацию, необходимую для получения серийных растворов.
- Добавьте эти суспензии в стерильные пробирки, содержащие бульон Мюллера-Хинтона, чтобы достичь нового диапазона концентраций, необходимых для эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для микроразбавления применялись следующие концентрации НЧ MgO: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm и 8,000 ppm.
- Приготовление микроразведения15
- Подготовьте новую стерильную 96-луночную микротитровальную пластинку (микропланшет). Этикетка колонки No 12 микропланшета в виде стерильной колонки; столбец No 11 в качестве столбца контроля роста.
- В колонки No 1-10 добавляют 120 мкл суспензий наночастиц различной концентрации.
- Инокулировать 120 мкл бактерий (5 × 105 КОЕ/мл) в лунки в колонки No1-10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования ряд G и ряд H были контрольными с цефтриаксоном в концентрациях, рекомендованных стандартами CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm и 0,03 ppm. - Инкубируйте 96-луночную микропланшет в течение 24 ч при 37 °C (35 °C ± 2 °C). Наконец, проанализируйте скважины.
- Предварительный рост штаммов
- Наблюдение морфоструктурных изменений, индуцированных наночастицами MgO, в бактериальных штаммах с помощью АСМ
- Возьмите 250 мкл из лунок тестов на микроразведение, смешайте с 750 мкл стерильной воды и центрифугу при 2000 × г от 2 до 5 минут при 5 ° C.
- Каждый раз трижды промывать осадки 1 мл стерильной воды, а в конце промывания добавлять к ним 500 мкл воды.
- Для получения снимков АСМ берут 10-20 мкл окончательной суспензии каждой стартовой лунки, проводят мазок на предметное стекло, предварительно очищенное ультразвуком (30 мин), и сушат при комнатной температуре в течение 1 ч.
4. Измерения АСМ
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь атомно-силовой микроскоп в контактном режиме был установлен на антивибрационной рабочей станции, которая позволяла изолировать микроскоп от любых механических источников колебаний и удерживала систему в горизонтальном положении. Электрические помехи уменьшаются с помощью линейных фильтров и защиты от перенапряжения. АСМ, используемая здесь, автоматически выравнивает лазерный луч по отношению к фотоприемнику.
- Включите компьютер и AFM, затем выберите в программных инструментах режим контакта, датчики contAI-G и параметры Auto Slope. Значения Z-контроллера по умолчанию: Setpoint = 20 нМ, P-Gain = 10 000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 и Tip voltage = 0 мВ.
- Поместите образцы в контактный режим АСМ с помощью сканирующей головки 70 мкм. Мы использовали кремниевые консоли ContAI-G с постоянной пружины 0,13 Н/м.
- Используйте камеру, установленную на двух линзах, встроенных в сканирующую головку, чтобы получить быстрый обзор поверхности области под зондом.
- Вручную выполните смещение в плоскости XY, чтобы выбрать нужную область. Зонд предназначен для электронного приближения к поверхностному образцу до тех пор, пока не будут достигнуты условия контакта. Электронная регулировка плоскости измерения XY сканера и поверхности образца, уменьшая наклоны в направлениях XY.
- Используйте стандартные параметры программного обеспечения: 1 строка в секунду при 256 точках на линию.
- Во-первых, выполните полный диапазон сканирования области 70 мкм x 70 мкм; Затем выберите меньшую область с помощью инструмента «Масштабирование». AFM автоматически оптимизирует диапазон графика в Z.
ПРИМЕЧАНИЕ: При уменьшении количества строк в секунду общее время сканирования увеличивается, качество сканирования становится более четким, а также устраняется некоторый шум от измерения. - Чтобы выбрать новую область из образца, втяните консоль электронным способом и переместите образец вдоль плоскости XY. Выполните новое сканирование, используя процедуру, описанную в шагах 4.5 и 4.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные сканы показаны в одноцветной гистограмме, в которой светлые цвета связаны с большими высотами, а темные цвета связаны с более глубокими высотами. Программное обеспечение AFM генерирует 3D-вид скана, который позволяет оценить детали измеряемой поверхности. - Выполните обработку данных с помощью построчного выравнивания в меню «Инструменты» изображения в выбранном фильтре, который является наиболее используемым и простым методом выравнивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод выравнивания берет каждую горизонтальную или вертикальную линию, полученную на изображении AFM, и подгоняет ее под полиномиальное уравнение. - Оптимизируйте максимальную и минимальную высоту на цветовой панели справа, чтобы получить наилучшее разрешение изображения.
- Выполните анализ изображений с помощью меню «Анализ » на панели инструментов. Определите высоту и расстояния, выбрав начальную и конечную точки после выбора нужного инструмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны попробовать различные фильтры меню «Инструменты », чтобы избежать артефактов изображения подсказки из-за сведения, используемого в процессе выравнивания. Артефакты изображения отображаются в виде линий полос и показаны на некоторых изображениях AFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью атомно-силовой микроскопии в контактном режиме были получены изображения морфологии и размеров штаммов S. aureus и P. hunanensis , а также популяционной организации обоих штаммов. Снимки S. aureus показали, что его популяция распределена по зонам с скоплениями кокков (рис. 1А). С увеличением масштаба наблюдалось большее понимание популяционного распределения и морфологии кокков (рис. 1B). Отчеты о микроскопии показали, что псевдополусферическая структура присутствовала в соседних клетках S. aureus, но в целом бактерии представляли сферическую морфологию в виде кокка после деления клеток, как ранее было показано на изображениях AFM. Кроме того, изображения контактного режима АСМ позволили определить размер кокков, который показал среднюю ширину 1,25 мкм. Значения, полученные при измерении 20 ячеек, показаны на рисунке 2.
В случае P. hunanensis наблюдалось однородное распределение по всей поверхности стеклянной подложки, образуя бактериальный монослой, который прилипал к подложке (рис. 3А), как сообщили Zuttion et al., в котором авторы иммобилизовали P. aureginosa на твердую опору и показали такое же поведение. Было обнаружено, что бактерии Pseudomonas hunanensis имеют палочковидную форму, длину 1,9 мкм (L) и ширину 0,9 мкм (W) (рис. 3B, C); эти данные находятся в пределах зарегистрированных значений для P. fluorescens 1,5-2,0 мкм (L) и 0,6-0,9 мкм (W)17,18,19.
Для визуализации морфоструктурных изменений, обусловленных взаимодействием НУП MgO, штаммы бактерий после обработки (микроразведение) подвергали анализу АСМ. На рисунке 4 и рисунке 5 показаны три группы: на рисунке 4A-C и рисунке 5A-C представлены элементы управления; изображения на рисунке 4D-F и рисунке 5D-F были получены по результатам микроразведения на МИК; изображения рисунков 4G-I и 5G-I были получены при более высокой концентрации, чем MIC.
На изображениях верхней группы рисунка 4A-C показана клетка коккового типа Staphylococcus aureus с гладкой поверхностью и однородными контурами, которая росла в подходящей среде в бульоне Мюллера-Хинтона в течение 24 ч по методике микроразведения. Средний диаметр составлял 1 мкм ± 0,15 мкм. Этот диаметр практически исчез после обработки NP, как показано на рисунке 4D-F, поскольку ухудшение клеточной структуры было очень серьезным. По поперечному сечению средняя высота для управления составила 200 нм ± 50 нм; Высота обработанных клеток была уменьшена на 40% (120 нм ± 5 нм) по сравнению с контролем. Изображения ясно показывают изменения на поверхности, такие как образование везикул, после воздействия MgO NP в CMI частиц; кроме того, удвоение концентраций влияло на внутреннее состояние клеточных структур, и высвобождался цитозольный материал, как показано на изображениях на рисунке4G-I 20,21.
Эти изменения также были идентифицированы в клетках E. coli, как показано на рисунке 5, с условиями, аналогичными S. aureus. Контрольная группа этой бактерии показала гладкие поверхности, подчеркивая ее очень однородную палочковидную форму (бациллу) без каких-либо видимых изменений. На трехмерных изображениях белым цветом показаны самые высокие топографические области, связанные с микроорганизмом. Средняя высота контрольной кишечной палочки составила 160 нм ± 50 нм, а согласно изображениям поперечного сечения средняя высота снизилась до 76 нм ± 10 нм для клеток, подвергшихся в течение 24 ч воздействию концентрации наночастиц MgO 500 ppm (MIC). Структура полностью исчезла при концентрации 1000 ppm, и можно было различить только силуэты бактерий. При анализе изображений для обеих концентраций было замечено, что по отношению к контрольной группе морфология обработанных клеток была значительно изменена с удлинением от 2,0 мкм ± 0,5 мкм (рис. 5A-C) до 3,0 мкм ± 0,3 мкм, как показано на изображениях на рисунке 5D-I. Это увеличение было очевидно, когда клеточная структура теряла внутренний гомеостаз, вызывая структурный коллапс20,22. Изображения бактерий, подвергшихся воздействию MgO NP, ясно показали поверхностные изменения, такие как образование гребней или гофр, образующих везикулярные нарушения на обоих МПК и при удвоении концентраций20,22.
Рисунок 1: Контактный режим атомно-силовой микроскопии для золотистого стафилококка. На этом рисунке показаны топографии, взятые из S. aureus в разных масштабах: (A) 70 мкм и (B) 5,0 мкм. Районы картографирования были выбраны для получения топографии S. aureus ; на изображении B отчетливо видны S. aureus cocci. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Топографии и гистограммы Staphylococcus aureus в контактном режиме атомно-силовой микроскопии. На изображении показана (А) топография и (Б) гистограмма диаметров бактерий S. aureus , закрепленных на стеклянной подложке с использованием процедуры термофиксации. Диаметр ячейки измерялся с помощью программного обеспечения AFM; n = 20. Изображение представляет собой представление измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Контактный режим атомно-силовой микроскопии для Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. На этом рисунке показаны топографии, взятые из P. hunanensis 1AP-CY в разных масштабах: (A) 70 мкм, (B) 20 мкм и (C) 5,0 мкм. Изображения в разных масштабах показывают распределение клеточной популяции на слайде. Для анализа морфологии клеток фокусируется область с более низкой плотностью населения, как показано на рисунке B, на котором показана форма палочки P. hunanensis (сигнал отклонения показан для улучшения изображения топографии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Изображения контактного режима АСМ получены для необработанных S. aureus (вверху) и S. aureus, подвергшихся воздействию наночастиц MgO 250 ppm и 500 ppm MgO (средний и нижний) в течение 24 часов. (А, Д, Г) Топографические снимки; (B,E,H) трехмерные изображения; (C, F, I) изображения поперечного сечения. Структурные изменения в бактериях наблюдались при использовании минимальной ингибирующей концентрации MgO (250 ppm) и более высокой концентрации (500 ppm). Показано, что сигнал отклонения улучшает топографическое изображение. Рисунки 4A, D, G взяты из Muñiz Diaz et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Изображения контактного режима AFM, полученные для необработанных E. coli (вверху) и E. coli, подвергшихся воздействию наночастиц MgO 500 ppm и 1,000 ppm (средний и нижний) в течение 24 ч. (A, D, G) Топографические изображения; (B,E,H) трехмерные изображения; (C, F, I) изображения поперечного сечения. Структурные изменения в бактериях наблюдались при использовании минимальной ингибирующей концентрации MgO (500 ppm) и более высокой концентрации (1000 ppm). Рисунки 5A, D, G взяты из Muñiz Diaz et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроскопия — это метод, обычно используемый в биологических лабораториях, который позволяет исследовать структуру, размер, морфологию и клеточное расположение биологических образцов. Для совершенствования этой методики можно использовать несколько типов микроскопов, отличающихся друг от друга своими оптическими или электронными характеристиками, определяющими разрешающую способность прибора.
В научных исследованиях использование микроскопии требуется для характеристики бактериальных клеток; например, микроскопия показала, что NaCl влияет на термическую стойкость и морфологию клеток штаммов E. coli, экстракт лимонника китайского проявляет антибактериальное действие по отношению к S. aureus, S. aureus развивает термотолерантность после сублетального теплового шока, а E. coli биоминерализует платину 23,24,25,26,27. Таким образом, преимущества, представленные AFM, позволили расширить его на области исследований окружающей среды и биологии.
Атомно-силовой микроскоп - это прибор, используемый в контактном режиме для анализа бактерий in situ и в бесконтактном режиме для определения топографии макро- и наноскопических материалов. Преимущество АСМ перед другими методами заключается в том, что для получения топографических изображений требуется меньше образцов; Он также считается неразрушающим методом, и он не повреждает и не компрометирует структуру анализируемого изображения. Хотя мы использовали термофиксацию в этом протоколе, морфология бактериальных клеток не была изменена. Важно отметить, что этот метод обычно используется в микробиологической лаборатории для изучения морфологии бактерий. В отличие от образцов тканей растений и животных, метод фиксации тепла вызывает изменения в белках и липидах, которые проявляются в разрушении тканей; У бактерий этот метод вызывает небольшое сокращение клетки, что не мешает наблюдению за формой клетки и ее идентификацией.
С помощью АСМ подготовка образцов проста и не требует каких-либо химических продуктов, как в случае электронной микроскопии, где важно, чтобы анализируемый образец был проводящим, поскольку изображение создается взаимодействием электронов, испускаемых оборудованием, и образцом. Если образец не является проводящим, он должен быть металлизирован проводящим элементом, таким как золото, с помощью метода физического осаждения из паровой фазы. Кроме того, разрешение электронной микроскопии достигает 0,4 нм, в зависимости от объектива и модели, тогда как АСМ в контактном режиме может достигать микрометрового, нанометрового или даже пикометрического разрешения, что делает его конкурентоспособным с электронной микроскопией22. Еще одним преимуществом АСМ перед электронной микроскопией является то, что она не требует высоких условий вакуума для обработки образца20,21. Другими преимуществами АСМ по сравнению с широко используемыми методами являются низкая стоимость и короткое время получения изображения.
Что касается техники фиксации бактериального образца на стеклянной пластине, важно отметить, что тепловая фиксация является методом, обычно используемым в микробиологических лабораториях. Этот метод используется для того, чтобы бактериальные образцы могли быть идентифицированы простым или дифференцированным окрашиванием. В то же время можно увидеть форму бактерий, обычно кокков или палочек. Недостатком метода тепловой фиксации является уменьшение размера бактерий, но этот метод не ставит под угрозу форму бактерий.
После фиксации необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать старения образца, которое может проявляться в виде значительного уменьшения размера клетки; Следовательно, рекомендуется проанализировать образец в течение 24 часов после фиксации. Также следует следить за тем, чтобы образец не подвергался воздействию пыли; Поэтому образцы следует хранить в закрытом контейнере (например, в чашке Петри). Эти условия имеют решающее значение, поскольку они могут изменить полученные изображения AFM.
Ясно, что уменьшение размера бактерий может повлиять на некоторые исследовательские работы, а также что могут потребоваться другие способы прикрепления бактерий к подложке. Например, биопленки S. aureus, выращенные в бульоне BM на 34-мм пластинах, были зафиксированы глицеральдегидом. Кроме того, S. aureus были иммобилизованы V-образными консолями, обработанными поли-l-лизином, в то время как для C. albicans гифы были зафиксированы на предметных стеклах, покрытых положительно заряженным поли-l-лизином, чтобы проанализировать обмен адсорбированных сывороточных белков во время адгезии обоих к абиотической поверхности28,29.
В этой работе тепловая фиксация образцов не изменяла форму или агрегаты, образованные бактериями, и тепловая фиксация позволила визуализировать эффект наночастиц. Таким образом, топографии AFM могут показать форму изолированных кокков или агрегатов S. aureus и стержней P. hunanensis (рис. 1 и рис. 3). Кроме того, мы также обнаружили, что S. aureus и E. coli показали повреждение своих структур из-за воздействия наночастиц MgO, тогда как контрольные образцы (без наночастиц) не показали каких-либо изменений в их морфологии (рис. 4 и рис. 5).
Эта работа демонстрирует, что использование контактной моды АСМ является жизнеспособной альтернативой для характеристики топологии поверхности и дефектов биологических образцов, как это было показано на примере S. aureus, P. hunanensis и E. coli. Кроме того, метод тепловой фиксации не является определяющим фактором, который изменяет поверхность клетки и препятствует анализу. Скромно можно предположить, что тепловая фиксация может быть преимуществом при использовании АСМ. Образцы обрабатываются реже, а использование химических реагентов исключается. Таким образом, методология является простым и экономичным методом. Стоит отметить, что это может измениться в зависимости от конкретного анализа, который необходимо выполнить, как показано для исследования биопленок и бактериальной адгезии28,29. В качестве возможного расширения этой работы контактный режим AFM может быть использован для анализа влияния НУП на другие важные с медицинской точки зрения бактерии или в исследованиях, в которых должно наблюдаться повреждение клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Рамиро Мунис-Диас благодарит CONACyT за стипендию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
