Summary
Hier stellen wir die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie (AFM) als einfache und schnelle Methode zur bakteriellen Charakterisierung vor und analysieren Details wie die Bakteriengröße und -form, Bakterienkulturbiofilme und die Aktivität von Nanopartikeln als Bakterizide.
Abstract
Die Elektronenmikroskopie ist eines der Werkzeuge, die zur Charakterisierung zellulärer Strukturen erforderlich sind. Das Verfahren ist jedoch aufgrund der Probenvorbereitung für die Beobachtung kompliziert und teuer. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine sehr nützliche Charakterisierungstechnik, da sie eine hohe Auflösung in drei Dimensionen aufweist und keine Vakuum- und Probenleitfähigkeit erforderlich ist. Das AFM kann eine Vielzahl von Proben mit unterschiedlichen Topografien und unterschiedlichen Materialtypen abbilden.
AFM liefert hochauflösende 3D-Topographieinformationen vom Ångström-Niveau bis zum Mikrometer-Maßstab. Im Gegensatz zur herkömmlichen Mikroskopie wird beim AFM eine Sonde verwendet, um ein Bild der Oberflächentopographie einer Probe zu erzeugen. In diesem Protokoll wird die Verwendung dieser Art der Mikroskopie für die morphologische und zellschädigende Charakterisierung von Bakterien vorgeschlagen, die auf einem Träger fixiert sind. Es wurden Stämme von Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) und Pseudomonas hunanensis (isoliert aus Knoblauchknollenproben) verwendet. In dieser Arbeit wurden Bakterienzellen in spezifischen Nährmedien gezüchtet. Zur Beobachtung der Zellschädigung wurden Staphylococcus aureus und Escherichia coli mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln (NPs) inkubiert.
Ein Tropfen Bakteriensuspension wurde auf einem Glasträger fixiert, und Bilder wurden mit AFM in verschiedenen Maßstäben aufgenommen. Die gewonnenen Bilder zeigten die morphologischen Eigenschaften der Bakterien. Darüber hinaus konnte mit Hilfe von AFM die Schädigung der Zellstruktur durch die Wirkung von NPs beobachtet werden. Basierend auf den erhaltenen Bildern kann das Kontakt-AFM verwendet werden, um die Morphologie von Bakterienzellen zu charakterisieren, die auf einem Träger fixiert sind. Das AFM ist auch ein geeignetes Werkzeug, um die Auswirkungen von NPs auf Bakterien zu untersuchen. Im Vergleich zur Elektronenmikroskopie ist das AFM eine kostengünstige und einfach anzuwendende Technik.
Introduction
Verschiedene Bakterienformen wurden erstmals von Antony van Leeuwenhoek im 17. Jahrhundert festgestellt1. Bakterien gibt es seit der Antike in einer Vielzahl von Formen, die von Kugeln bis hin zu verzweigten Zellenreichen 2. Die Zellform ist eine grundlegende Voraussetzung für bakterielle Taxonomen, um jede Bakterienart zu beschreiben und zu klassifizieren, hauptsächlich für die morphologische Trennung von grampositiven und gramnegativen Stämmen3. Zur Bestimmung bakterieller Zellformen sind mehrere Elemente bekannt, die alle an der Zellhülle und -stütze als Bestandteile der Zellwand und -membran sowie im Zytoskelett beteiligt sind. Auf diese Weise sind die Wissenschaftler immer noch dabei, die chemischen, biochemischen und physikalischen Mechanismen und Prozesse aufzuklären, die an der Bestimmung bakterieller Zellformen beteiligt sind, die alle durch Gencluster definiert sind, die bakterielle Formen definieren 2,4.
Darüber hinaus haben Wissenschaftler gezeigt, dass die Stäbchenform wahrscheinlich die Urform von Bakterienzellen ist, da diese Zellform in zellsignifikanten Parametern optimal erscheint. So werden Kokken, Spiralen, Vibrionen, Faden und andere Formen als Anpassungen an verschiedene Umgebungen betrachtet; In der Tat haben sich bestimmte Morphologien mehrfach unabhängig voneinander entwickelt, was darauf hindeutet, dass die Formen von Bakterien Anpassungen an bestimmte Umgebungen sein könnten 3,5. Während des gesamten Lebenszyklus der bakteriellen Zellen ändert sich jedoch die Zellform, und dies geschieht auch als genetische Reaktion auf schädliche Umweltbedingungen3. Die Form und Größe der Bakterienzellen bestimmen stark die Steifigkeit, Robustheit und das Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis der Bakterien, und diese Eigenschaft kann für biotechnologische Prozesse genutzt werden6.
Die elektronische Mikroskopie wird aufgrund der hohen Vergrößerung, die über lichtbasierte Mikroskope hinaus erreicht werden kann, zur Untersuchung biologischer Proben eingesetzt. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (REM) sind die am häufigsten verwendeten Techniken für diesen Zweck; Die Proben benötigen jedoch einige Behandlungen, bevor sie in die Kammer des Mikroskops gelegt werden, um geeignete Bilder zu erhalten. Eine goldene Abdeckung der Proben ist erforderlich, und die Zeit, die für die gesamte Bildaufnahme benötigt wird, sollte nicht zu lang sein. Im Gegensatz dazu ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) eine Technik, die bei der Analyse von Oberflächen weit verbreitet ist, aber auch bei der Untersuchung biologischer Proben eingesetzt wird.
Es gibt verschiedene Arten von AFM-Modi, die in der Oberflächenanalyse verwendet werden, z. B. Kontaktmodus, berührungsloser Modus oder Gewindebohren, Magnetkraftmikroskopie (MFM), konduktives AFM, piezoelektrische Kraftmikroskopie (PFM), Spitzenkraftabgriff (PFT), Kontaktresonanz und Kraftvolumen. Jeder Modus wird bei der Analyse von Materialien verwendet und liefert unterschiedliche Informationen über die Oberfläche der Materialien und ihre mechanischen und physikalischen Eigenschaften. Einige AFM-Modi werden jedoch für die In-vitro-Analyse biologischer Proben verwendet, wie z. B. PFT, da PFT die Gewinnung topographischer und mechanischer Daten über Zellen in einem flüssigen Medium ermöglicht7.
In dieser Arbeit haben wir den grundlegendsten Modus verwendet, der in jedem alten und einfachen AFM-Modell enthalten ist - den Kontaktmodus. Das AFM verwendet eine scharfe Sonde (ca. <50 nm Durchmesser), um Bereiche mit einer Größe von weniger als 100 μm zu scannen. Die Sonde wird auf die Probe ausgerichtet, um mit den mit der Probe verbundenen Kraftfeldern zu interagieren. Die Oberfläche wird mit der Sonde abgetastet, um die Kraft konstant zu halten. Anschließend wird ein Bild der Oberfläche erzeugt, indem die Bewegung des Auslegers überwacht wird, während er sich über die Oberfläche bewegt. Die gesammelten Informationen liefern die nanomechanischen Eigenschaften der Oberfläche, wie Haftung, Elastizität, Viskosität und Scherung.
Im AFM-Kontaktmodus wird der Cantilever mit einer festen Auslenkung über die Probe abgetastet. Dadurch kann die Höhe der Proben (Z) bestimmt werden, was einen Vorteil gegenüber den anderen elektronischen Mikroskoptechniken darstellt. Die AFM-Software ermöglicht die Erzeugung eines 3D-Bildscans durch die Wechselwirkung zwischen der Spitze und der Probenoberfläche, und die Spitzenauslenkung wird durch einen Laser und einen Detektor mit der Höhe der Probe korreliert.
Im statischen Modus (Kontaktmodus) mit konstanter Kraft stellt der Ausgang zwei verschiedene Bilder dar: die Höhe (z-Topographie) und das Auslenkungs- oder Fehlersignal. Der statische Modus ist ein wertvoller, einfacher Bildgebungsmodus, insbesondere für robuste Proben in Luft, die den hohen Belastungen und Torsionskräften des statischen Modus standhalten können. Der Auslenkungs- oder Fehlermodus wird im Konstantkraftmodus betrieben. Das Topographiebild wird jedoch durch Hinzufügen des Ablenksignals zur Oberflächenstruktur weiter verbessert. In diesem Modus wird das Ablenksignal auch als Fehlersignal bezeichnet, da die Auslenkung der Rückkopplungsparameter ist. Alle Merkmale oder Morphologien, die in diesem Kanal auftreten, sind auf den "Fehler" in der Rückkopplungsschleife oder vielmehr auf die Rückkopplungsschleife zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen konstanten Auslenkungssollwert aufrechtzuerhalten.
Das einzigartige Design von AFM macht es kompakt - klein genug, um auf eine Tischplatte zu passen - und hat gleichzeitig eine hohe Auflösung, um atomare Schritte aufzulösen. Die AFM-Geräte sind kostengünstiger als die Geräte für andere elektronische Mikroskope, und die Wartungskosten sind minimal. Das Mikroskop benötigt kein Labor mit besonderen Bedingungen wie einem Reinraum oder einem isolierten Raum. Es braucht nur einen vibrationsfreien Schreibtisch. Für das AFM müssen die Proben nicht wie bei anderen Techniken (Goldabdeckung, Schlankheitsmessung) aufwendig aufbereitet werden. Lediglich eine trockene Probe muss am Probenhalter befestigt werden.
Wir verwenden den AFM-Kontaktmodus, um bakterielle Morphologien und die Auswirkungen von NPs zu beobachten. Die Population und Zellmorphologie von Bakterien, die auf einem Träger fixiert sind, können ebenso beobachtet werden wie die zellulären Schäden, die durch Nanopartikel an den Bakterienarten verursacht werden. Die Bilder, die mit dem AFM-Kontaktmodus erhalten wurden, bestätigen, dass es sich um ein leistungsstarkes Werkzeug handelt, das nicht durch Reagenzien und komplizierte Verfahren eingeschränkt ist, was es zu einer einfachen, schnellen und wirtschaftlichen Methode zur Charakterisierung von Bakterien macht.
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Protocol
1. Bakterielle Isolierung und Identifizierung
- Isolierung eines endophytischen Stammes aus Knoblauchknollenmeristemen:
- Legen Sie 2 mm Meristemfragmente von zuvor geschälten, desinfizierten und geschnittenen Knoblauchknollen auf Trypticase-Soja-Agar (TSA) als reichhaltiges Wachstumsmedium und inkubieren Sie 1 Tag lang bei 25 °C.
- Basierend auf den morphologischen Unterschieden der Bakterienkolonien - Form, Größe, Farbe, Rand, Durchlicht, reflektiertes Licht, Textur, Konsistenz und Pigmentproduktion - beschreiben Sie die verschiedenen beobachteten Morphotypen und reinigen Sie durch Kreuzstreifen eine repräsentative Kolonie jedes Morphotyps.
- Alle gereinigten Bakterienstämme werden in 30%igem Glycerin bei −80 °C konserviert.
- Identifizierung eines zufällig ausgewählten Stammes (9AP) durch Sequenzierung der 16S rDNA. Extrahieren Sie die DNA nach der Methode von Hoffman und Winston8.
- Amplifizieren Sie die 16S rRNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 100 ng DNA, 1x Polymerase-Puffer, 4 mMMgCl2, 0,4 mM dNTPs, je 10 pmol von 27F/1492r universellen Oligonukleotiden und 1 U DNA-Polymerase9. Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Bedingungen: 95 °C für 5 min für die anfängliche Denaturierung; gefolgt von 35 Zyklen von 1 min bei 94 °C als Denaturierungstemperatur, 1 min bei 56 °C als Hybridisierungstemperatur und 1 min bei 72 °C als Ausdehnungstemperatur; und dann 10 min bei 72 °C als letzte Verlängerung.
- Kapillarsequenz des PCR-Produkts unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide; Verwenden Sie die Didesoxy-terminale Methode mit dem Matrix-Installationskit für die Kapillarsequenzierung10 und führen Sie die Elektrophorese in einem automatisierten Multikapillarsystem11 durch.
- Bearbeiten Sie die Sequenzen manuell, vergleichen Sie die Sequenz mit der GenBank-Bibliothek mithilfe einer BLAST-Suche und identifizieren Sie vorläufig den Stamm mit dem Goldstandard von mindestens 98,7 % Identität mit der nächstgelegenen Spezies12,13.
HINWEIS: Der Stamm 9AP wurde als zur Spezies Pseudomonas hunanensis gehörend identifiziert, mit einer Identität von 99,86% mit der Sequenz für den Stamm P. hunanensis LV (JX545210).
2. Präparation der bakteriellen Probe zur morphologischen Beobachtung mittels AFM
- Unter sterilen Bedingungen wird ein Tropfen der Bakteriensuspension (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) auf einen Objektträger gegeben.
- Fixieren Sie die Proben durch trockenes Erhitzen auf dem Objektträger. Führen Sie den Objektträger mehrmals vorsichtig über eine Flamme, bis die Probe trocken ist.
HINWEIS: Die Fixierung von Proben ist eine Routinetechnik in der Mikrobiologie, um fixierte prokaryotische Organismen zu beobachten und ihre Struktur als lebende Zellen so genau wie möglich zu simulieren. - Legen Sie die fixierten Proben in eine Petrischale und bringen Sie sie zur Beobachtung in das AFM-Gerät.
Anmerkungen: Da sich die Proben im Laufe der Zeit durch Witterungseinflüsse verändern können, planen Sie eine maximale Zeit von 24 Stunden für die Analyse im AFM-Gerät ein. Halten Sie die Proben staubfrei.
3. Antibakterielle Wirkung von MgO-Nanopartikeln gegen Bakterien
ANMERKUNG: Die Synthese und Charakterisierung von MgO-NPs wurde bereits veröffentlicht14. In dieser Arbeit wurde die antibakterielle Aktivität der Nanomaterialien auf der Grundlage des Handbuchs des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) unter Verwendung von Makroverdünnungs- und Mikroverdünnungsmethoden zur Inhibition abgeschätzt15,16.
- Abschätzung der minimalen Hemmaktivität (MHK) und der Bakterizide (CMB)
- Vorwachsen der Stämme
- Impfen Sie eine angemessene Menge Escherichia coli oder Staphylococcus aureus in nahrhafte Brühe, um eine Endkonzentration von 1 ×10 8 KBE/ml zu erhalten.
- Die Suspension wird bei 37 °C (± 2 °C) für 18-24 h inkubiert.
- Nachwachsen von akklimatisierten Stämmen
- Tauchen Sie eine sterile bakteriologische Schlinge in die Suspension ein und berühren Sie dabei den Boden des Röhrchens.
- Führen Sie Streifen mit der Schlaufe auf Eosin und Methylenblau-Agar und Nähr-Agar durch.
- Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C (± 2 °C) für 24 h.
- Auswahl der Kolonien für die Herstellung des standardisierten Inokulums
- Nehmen Sie drei bis fünf Kolonien mit dem gleichen morphologischen Typ, indem Sie die Oberseite der Kolonie in der Petrischale mit einer bakteriologischen Schleife berühren.
- Übertragen und tauchen Sie die Auswahl in 3-5 ml Müller-Hinton-Brühe.
- Inkubieren Sie bei 37 °C (± 2 °C), um eine Trübung von 1 × 10 8 KBE/ml oder 2 × 108 KBE/ml zu erreichen.
ANMERKUNG: In dieser Arbeit wurden die McFarland-Trübungsstandards als Referenz für die bakteriologischen Suspensionen verwendet. Konkret entspricht der 0,5-Standard in etwa einer homogenen E. coli-Suspension von 1,5 × 108 Zellen/ml. Zur Messung der Trübung wurde ein UV-Vis-Spektralphotometer verwendet. - Nehmen Sie 1 ml und fügen Sie es zu 9 ml steriler Brühe hinzu. Nehmen Sie 200 μl dieser Verdünnung und fügen Sie sie 19,8 ml steriler Brühe hinzu, um eine Endkonzentration von 5 ×10 5 KBE/ml zu erhalten.
- Erforderliche Konzentrationen von MgO-Nanopartikeln
- Verwenden Sie für die Herstellung der Lösungen ein Ultraschallgerät.
- Suspendieren Sie das Nanomaterial in sterilem Wasser mit der doppelten Konzentration, die erforderlich ist, um Serienlösungen zu erhalten.
- Geben Sie diese Suspensionen in sterile Röhrchen mit Müller-Hinton-Brühe, um den neuen Konzentrationsbereich zu erreichen, der für das Experiment erforderlich ist.
HINWEIS: Für die Mikroverdünnung wurden die folgenden MgO-NP-Konzentrationen angewendet: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm und 8.000 ppm.
- Herstellung der Mikroverdünnung15
- Bereiten Sie eine neue und sterile 96-Well-Mikrotiterplatte (Mikrotiterplatte) vor. Etikettensäule Nr. 12 der Mikrotiterplatte als Sterilitätssäule; Beschriftungsspalte Nr. 11 als Wachstumskontrollspalte.
- Geben Sie 120 μl der Nanopartikelsuspensionen mit den unterschiedlichen Konzentrationen in die Säulen Nr. 1-10.
- Impfen Sie 120 μl Bakterien (5 ×10 5 KBE/ml) in die Vertiefungen in den Spalten Nr. 1-10.
HINWEIS: Für diese Studie wurden Zeile G und Reihe H Kontrollen mit Ceftriaxon in Konzentrationen behandelt, die von den CLSI-Standards vorgeschlagen werden: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm und 0,03 ppm. - Inkubieren Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte für 24 h bei 37 °C (35 °C ± 2 °C). Analysieren Sie abschließend die Bohrlöcher.
- Vorwachsen der Stämme
- Beobachtung der MgO-Nanopartikel-induzierten morphostrukturellen Veränderungen in den Bakterienstämmen mittels AFM
- Entnehmen Sie 250 μl aus den Vertiefungen der Mikroverdünnungstests, mischen Sie sie mit 750 μl sterilem Wasser und zentrifugieren Sie sie bei 2.000 × g von 2 min bis 5 min bei 5 °C.
- Waschen Sie die Ausfällungen dreimal mit jeweils 1 ml sterilem Wasser und fügen Sie ihnen am Ende der Waschgänge 500 μl Wasser hinzu.
- Um die AFM-Bilder zu erhalten, entnehmen Sie 10-20 μl der endgültigen Suspension jeder Startvertiefung, führen Sie einen Abstrich auf einem zuvor mit Ultraschall gereinigten Objektträger durch (30 min) und trocknen Sie ihn 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
4. AFM-Messungen
HINWEIS: Hier wurde das Rasterkraftmikroskop im Kontaktmodus auf einer Anti-Vibrations-Workstation montiert, die es ermöglichte, das Mikroskop von mechanischen Vibrationsquellen zu isolieren und das System waagerecht zu halten. Elektrische Störungen werden durch Netzfilter und Überspannungsschutz verringert. Das hier verwendete AFM richtet den Laserstrahl automatisch auf den Photodetektor aus.
- Schalten Sie den Computer und das AFM ein und wählen Sie dann in den Software-Tools den Kontaktmodus, die contAI-G-Sonden und die Optionen für die automatische Steigung aus. Die Standardwerte des Z-Reglers sind Sollwert = 20 nM, P-Verstärkung = 10.000, I-Verstärkung = 1.000, D-Verstärkung = 0 und Spitzenspannung = 0 mV.
- Platzieren Sie die Proben mit einem 70-μm-Scanbereichskopf im AFM-Kontaktmodus. Wir haben ContAI-G Silizium-Ausleger mit einer Federkonstante von 0,13 N/m verwendet.
- Verwenden Sie ein Kameragerät, das auf zwei in den Scankopf integrierten Linsen montiert ist, um einen schnellen Überblick über die Oberfläche des Bereichs unter der Sonde zu erhalten.
- Führen Sie manuell eine Verschiebung in der XY-Ebene durch, um den gewünschten Bereich auszuwählen. Die Sonde ist so konzipiert, dass sie sich der Oberflächenprobe elektronisch nähert, bis die Kontaktbedingungen erreicht sind. Passen Sie die XY-Messebene des Scanners und der Probenoberfläche elektronisch an, indem Sie die Neigungen in XY-Richtung reduzieren.
- Verwenden Sie die Standardparameter der Software: 1 Zeile pro Sekunde bei 256 Punkten pro Zeile.
- Führen Sie zunächst einen vollständigen Scanbereich von 70 μm x 70 μm durch. Wählen Sie dann mit dem Zoom-Werkzeug einen kleineren Bereich aus. Das AFM optimiert den Diagrammbereich in Z automatisch.
HINWEIS: Durch das Verringern der Zeilen pro Sekunde erhöht sich die Gesamtscanzeit, die Qualität des Scans ist definierter und ein Teil des Messrauschens wird ebenfalls gelöscht. - Um einen neuen Bereich aus der Probe auszuwählen, ziehen Sie den Ausleger elektronisch zurück und bewegen Sie die Probe entlang der XY-Ebene. Führen Sie einen neuen Scan mit der in Schritt 4.5 und Schritt 4.6 beschriebenen Vorgehensweise durch.
HINWEIS: Die erhaltenen Scans werden in einer einfarbigen Balkenskala angezeigt, in der die hellen Farben größeren Höhen und die dunklen Farben größeren Höhen zugeordnet sind. Die AFM-Software generiert eine 3D-Ansicht des Scans, die es ermöglicht, die Details der gemessenen Oberfläche zu würdigen. - Führen Sie die Datenverarbeitung mit dem zeilenweisen Abgleich im Menü Extras des Bildes in der Filterauswahl durch, was die am häufigsten verwendete und einfachste Nivelliermethode ist.
HINWEIS: Bei dieser Nivelliermethode wird jede horizontale oder vertikale Linie, die im AFM-Bild erzeugt wird, an eine Polynomgleichung angepasst. - Optimieren Sie die maximale und minimale Höhe in der Farbleiste auf der rechten Seite, um die beste Bildauflösung zu erhalten.
- Führen Sie die Bildanalyse über das Menü Analyse in der Symbolleiste durch. Bestimmen Sie die Höhen und Abstände, indem Sie den Anfangs- und Endpunkt auswählen, sobald das gewünschte Werkzeug ausgewählt ist.
HINWEIS: Benutzer müssen die verschiedenen Filter des Menüs "Extras" ausprobieren, um Tip-Image-Artefakte aufgrund der beim Nivellieren verwendeten Abflachung zu vermeiden. Bildartefakte werden als Streifenlinien angezeigt und in einigen AFM-Bildern angezeigt.
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Representative Results
Bilder der Morphologie und Größe der Stämme von S. aureus und P. hunanensis sowie der Populationsorganisation beider Stämme wurden mittels Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus aufgenommen. Die Bilder von S. aureus zeigten, dass die Population nach Zonen mit Kokkenaggregaten verteilt war (Abbildung 1A). Mit zunehmender Größe wurden die Populationsverteilung und die Morphologie der Kokken besser bewertet (Abbildung 1B). Die Mikroskopieberichte zeigten, dass in benachbarten Zellen von S. aureus eine pseudo-hemisphärische Struktur vorhanden war, dass die Bakterien jedoch im Allgemeinen nach der Zellteilung eine kugelförmige Morphologie in Form eines Kokkus aufwiesen, wie zuvor in den AFM-Bildern gezeigt. Darüber hinaus ermöglichten die AFM-Kontaktmodenbilder die Bestimmung der Größe der Kokken, die eine durchschnittliche Breite von 1,25 μm aufwiesen. Die Werte, die sich aus der Messung von 20 Zellen ergeben, sind in Abbildung 2 dargestellt.
Im Fall von P. hunanensis wurde eine homogene Verteilung auf der gesamten Oberfläche des Glasträgers beobachtet, die eine bakterielle Monoschicht bildete, die am Träger haftete (Abbildung 3A), wie von Zuttion et al. berichtet, bei dem die Autoren P. aureginosa auf einem festen Träger immobilisierten und das gleiche Verhalten zeigten. Es wurde beobachtet, dass Pseudomonas hunanensis-Bakterien stäbchenförmig sind, mit einer Länge von 1,9 μm (L) und einer Breite von 0,9 μm (W) (Abbildung 3B,C); Diese Daten liegen innerhalb der gemeldeten Werte für P. fluorescens von 1,5-2,0 μm (L) und 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
Um die morphostrukturellen Veränderungen durch das Zusammenspiel der MgO-NPs sichtbar zu machen, wurden die Bakterienstämme nach der Behandlung einer AFM-Analyse unterzogen (Mikrodilution). In Abbildung 4 und Abbildung 5 sind drei Gruppen dargestellt: Abbildung 4A-C und Abbildung 5A-C sind die Bedienelemente; Die Bilder in Abbildung 4D-F und Abbildung 5D-F wurden aus den Ergebnissen der Mikroverdünnung am MIC gewonnen. Die Bilder von Abbildung 4G-I und Abbildung 5G-I wurden bei einer höheren Konzentration als das MIC aufgenommen.
Die Bilder der oberen Gruppe von Abbildung 4A-C zeigen eine Coccus-artige Zelle von Staphylococcus aureus mit glatter Oberfläche und homogenen Konturen, die in geeigneter Umgebung in Müeller-Hinton-Bouillon für 24 h nach der Mikroverdünnungstechnik gewachsen ist. Der durchschnittliche Durchmesser betrug 1 μm ± 0,15 μm. Dieser Durchmesser verschwand nach der NP-Behandlung, wie in Abbildung 4D-F dargestellt, praktisch weg, da die Verschlechterung der Zellstruktur sehr stark war. Entsprechend dem Querschnitt betrug die durchschnittliche Höhe für die Steuerung 200 nm ± 50 nm; Die Höhe der behandelten Zellen wurde im Vergleich zu den Kontrollen um 40% (120 nm ± 5 nm) reduziert. Die Bilder zeigen deutlich Veränderungen in der Oberfläche, wie z. B. die Bildung von Vesikel, nach der Exposition gegenüber MgO-NPs im CMI der Partikel; Darüber hinaus wurde durch die Verdoppelung der Konzentrationen der interne Status der zellulären Strukturen beeinflusst und zytosolisches Material freigesetzt, wie in den Bildern von Abbildung4G-I 20,21 gezeigt.
Diese Veränderungen wurden auch in E. coli-Zellen identifiziert, wie in Abbildung 5 dargestellt, mit ähnlichen Bedingungen wie bei S. aureus. Die Kontrollen dieses Bakteriums zeigten glatte Oberflächen, die seine sehr homogene stäbchenförmige Form (Bazillus) ohne sichtbare Veränderung hervorhoben. Die dreidimensionalen Bilder zeigen die höchsten topographischen Regionen, die mit dem Mikroorganismus assoziiert sind, in Weiß. Die durchschnittliche Höhe der Kontroll-E. coli betrug 160 nm ± 50 nm, und nach den Querschnittsbildern sank die durchschnittliche Höhe auf 76 nm ± 10 nm für Zellen, die 24 Stunden lang einer Konzentration von MgO-Nanopartikeln von 500 ppm (MIC) ausgesetzt waren. Bei einer Konzentration von 1.000 ppm verschwand die Struktur vollständig, und nur die Silhouetten der Bakterien waren zu unterscheiden. Bei der Analyse der Bilder für beide Konzentrationen wurde beobachtet, dass die Zellmorphologie der behandelten Zellen in Bezug auf die Kontrollen signifikant verändert war, mit einer Elongation von 2,0 μm ± 0,5 μm (Abbildung 5A-C) auf 3,0 μm ± 0,3 μm, wie in den Bildern von Abbildung 5D-I gezeigt. Dieser Anstieg wurde deutlich, als die zelluläre Struktur die interne Homöostase verlor, was zu einem strukturellen Kollaps führte20,22. Die Bilder von Bakterien, die MgO-NPs ausgesetzt waren, zeigten deutlich Oberflächenveränderungen wie Kammbildung oder Riffelungen, die vesikuläre Störungen an beiden MICs und bei Verdopplung der Konzentrationen bildeten20,22.
Abbildung 1: Rasterkraftmikroskopischer Kontaktmodus für Staphylococcus aureus. Diese Abbildung zeigt die Topographien von S. aureus in verschiedenen Skalen: (A) 70 μm und (B) 5,0 μm. Die Kartierungsgebiete wurden ausgewählt, um die Topographie von S. aureus zu erhalten; Bild B zeigt deutlich S. aureus cocci. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Rasterkraftmikroskopische Kontaktmodus-Topographien und Histogramme von Staphylococcus aureus. Das Bild zeigt die (A) Topographie und (B) das Histogramm der Durchmesser von S. aureus-Bakterien, die mit dem Wärmefixierungsverfahren auf einem Glasträger befestigt sind. Der Zelldurchmesser wurde mit der AFM-Software gemessen; n = 20. Das Bild ist eine Darstellung der Messung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Rasterkraftmikroskopischer Kontaktmodus für Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Diese Abbildung zeigt die Topographien von P. hunanensis 1AP-CY in verschiedenen Skalen: (A) 70 μm, (B) 20 μm und (C) 5,0 μm. Die Bilder in verschiedenen Maßstäben zeigen die Verteilung der Zellpopulation auf dem Objektträger. Um die Zellmorphologie zu analysieren, wird ein Gebiet mit einer geringeren Populationsdichte fokussiert, wie in Bild B gezeigt, das die Stäbchenform von P. hunanensis zeigt (das Ablenkungssignal wird gezeigt, um das Topographiebild zu verbessern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. AFM-Kontaktmodus-Bilder für unbehandelte S. aureus (oben) und S. aureus, die 24 h lang bei 250 ppm und 500 ppm MgO-Nanopartikeln (Mitte und unten) exponiert wurden. (A,D,G) Topographische Bilder; (B,E,H) dreidimensionale Bilder; (C,F,I) Querschnittsbilder. Strukturelle Veränderungen der Bakterien wurden bei Verwendung der minimalen Hemmkonzentration von MgO (250 ppm) und einer höheren Konzentration (500 ppm) beobachtet. Das Ablenksignal wird gezeigt, um das Topographiebild zu verbessern. Die Abbildungen 4A, D und G stammen von Muñiz Diaz et al.14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: AFM-Kontaktmodus-Bilder für unbehandelte E. coli (oben) und E. coli, die 500 ppm und 1.000 ppm MgO-Nanopartikeln (Mitte und unten) für 24 Stunden ausgesetzt waren. (A,D,G) Topographische Bilder; (B,E,H) dreidimensionale Bilder; (C,F,I) Querschnittsbilder. Strukturelle Veränderungen der Bakterien wurden bei Verwendung der minimalen Hemmkonzentration von MgO (500 ppm) und einer höheren Konzentration (1.000 ppm) beobachtet. Die Abbildungen 5A, D und G stammen von Muñiz Diaz et al.14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Mikroskopie ist eine Technik, die häufig in biologischen Laboratorien verwendet wird und die Untersuchung der Struktur, Größe, Morphologie und zellulären Anordnung biologischer Proben ermöglicht. Um diese Technik zu verbessern, können verschiedene Arten von Mikroskopen verwendet werden, die sich in ihren optischen oder elektronischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, die das Auflösungsvermögen des Instruments bestimmen.
In der wissenschaftlichen Forschung ist der Einsatz der Mikroskopie für die Charakterisierung von Bakterienzellen erforderlich; Zum Beispiel hat die Mikroskopie gezeigt, dass NaCl die thermische Beständigkeit und Zellmorphologie von E. coli-Stämmen beeinflusst, Schisandra chinensis-Extrakt zeigt antibakterielle Wirkungen gegenüber S. aureus, S. aureus entwickelt nach subletalem Hitzeschock eine Thermotoleranz und E. coli biomineralisiert Platin 23,24,25,26,27 . Die Vorteile des AFM haben es somit ermöglicht, es auf die Forschungsbereiche Umwelt und Biologie auszudehnen.
Das Rasterkraftmikroskop ist ein Instrument, das im Kontaktmodus zur Analyse von Bakterien in situ und im berührungslosen Modus zur Bestimmung der Topographie von makroskopischen und nanoskopischen Materialien verwendet wird. Der Vorteil von AFM gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass weniger Proben benötigt werden, um topografische Bilder zu erhalten. Es wird auch als zerstörungsfreie Technik betrachtet und beschädigt oder beeinträchtigt die Struktur des analysierten Bildes nicht. Obwohl wir in diesem Protokoll eine Wärmefixierung verwendeten, wurde die bakterielle Zellmorphologie nicht verändert. Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Technik häufig im mikrobiologischen Labor verwendet wird, um bakterielle Morphologien zu untersuchen. Anders als in pflanzlichen und tierischen Gewebeproben führt die Hitzefixierungstechnik zu Veränderungen in Proteinen und Lipiden, die sich in einer Verschlechterung des Gewebes manifestieren. Bei Bakterien bewirkt die Technik eine leichte Schrumpfung der Zelle, die die Beobachtung der Zellform und -identifizierung nicht beeinträchtigt.
Mit AFM ist die Probenvorbereitung einfach und erfordert keine chemischen Produkte, wie bei der Elektronenmikroskopie, bei der es wichtig ist, dass die zu analysierende Probe leitfähig ist, da das Bild durch die Wechselwirkung der vom Gerät und der Probe emittierten Elektronen erzeugt wird. Wenn die Probe nicht leitfähig ist, muss sie mit einem leitfähigen Element wie Gold mittels der physikalischen Gasphasenabscheidungstechnik metallisiert werden. Darüber hinaus erreicht die Auflösung der Elektronenmikroskopie je nach Objektiv und Modell bis zu 0,4 nm, während das AFM im Kontaktmodus eine Auflösung im Mikrometer-, Nanometer- oder sogar Pikometerbereich erreichen kann, was es mit der Elektronenmikroskopie konkurrenzfähig macht22. Ein weiterer Vorteil der AFM gegenüber der Elektronenmikroskopie besteht darin, dass sie keine Hochvakuumbedingungen für die Probenverarbeitung benötigt20,21. Weitere Vorteile des AFM gegenüber herkömmlichen Techniken sind die geringen Kosten und die kurze Bildaufnahmezeit.
In Bezug auf die Technik der Fixierung der Bakterienprobe auf einer Glasplatte ist es wichtig zu erwähnen, dass die Wärmefixierung eine Technik ist, die häufig in mikrobiologischen Labors verwendet wird. Diese Technik wird verwendet, um bakterielle Proben durch einfache oder differentielle Färbung zu identifizieren. Gleichzeitig ist die Form der Bakterien, in der Regel Kokken oder Stäbchen, zu erkennen. Ein Nachteil der Wärmefixierungstechnik ist die Verkleinerung der Bakterien, aber diese Technik beeinträchtigt nicht die Form der Bakterien.
Nach der Fixierung muss darauf geachtet werden, dass die Probe altert, was sich in einer deutlichen Abnahme der Zellgröße äußern kann. Daher ist es ratsam, die Probe innerhalb von 24 Stunden nach der Fixierung zu analysieren. Es sollte auch darauf geachtet werden, dass die Probe keinem Staub ausgesetzt wird. Die Proben sollten daher in einem geschlossenen Behältnis (z. B. einer Petrischale) aufbewahrt werden. Diese Bedingungen sind kritisch, da sie die erhaltenen AFM-Bilder verändern können.
Es ist klar, dass die Verringerung der Größe der Bakterien einige Forschungsarbeiten beeinträchtigen kann und dass andere Möglichkeiten zur Befestigung der Bakterien an einem Träger erforderlich sein können. So wurden beispielsweise S. aureus-Biofilme, die in BM-Brühe auf 34-mm-Platten gewachsen sind, mit Glycerinaldehyd fixiert. Darüber hinaus wurden S. aureus mit V-förmigen Cantilevern, die mit Poly-L-Lysin behandelt wurden, immobilisiert, während für C. albicans Hyphen auf Glasobjektträgern fixiert wurden, die mit positiv geladenem Poly-L-Lysin beschichtet waren, um den Austausch von adsorbierten Serumproteinen während der Adhäsion beider Proteine an eine abiotische Oberfläche zu analysieren28,29.
In dieser Arbeit veränderte die Hitzefixierung der Proben weder die Form noch die von den Bakterien gebildeten Aggregate, und die Hitzefixierung ermöglichte es, die Wirkung der Nanopartikel sichtbar zu machen. Daher konnten die AFM-Topographien die Form der isolierten Kokken oder Aggregate von S. aureus und der Stäbchen von P. hunanensis zeigen (Abbildung 1 und Abbildung 3). Darüber hinaus fanden wir auch heraus, dass S. aureus und E. coli aufgrund der Wirkung der MgO-Nanopartikel Schäden in ihren Strukturen aufwiesen, während die Kontrollproben (ohne Nanopartikel) keine Veränderung ihrer Morphologie zeigten (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Diese Arbeit zeigt, dass die Verwendung des AFM-Kontaktmodus eine praktikable Alternative zur Charakterisierung der Oberflächentopologie und der Defekte biologischer Proben darstellt, wie dies bei S. aureus, P. hunanensis und E. coli gezeigt wurde. Darüber hinaus ist die Hitzefixierungstechnik kein entscheidender Faktor, der die Zelloberfläche verändert und die Analyse verhindert. Bescheiden können wir vermuten, dass die Wärmefixierung bei der Verwendung von AFM von Vorteil sein kann. Die Proben werden weniger verarbeitet und der Einsatz chemischer Reagenzien wird vermieden. Daher ist die Methodik eine einfache und kostengünstige Technik. Es ist erwähnenswert, dass sich dies je nach durchzuführender spezifischer Analyse ändern kann, wie bei der Untersuchung von Biofilmen und bakterieller Adhäsion gezeigt wurde28,29. Als mögliche Erweiterung dieser Arbeit könnte die Kontaktmodus-AFM eingesetzt werden, um die Wirkung von NPs auf andere medizinisch wichtige Bakterien zu analysieren oder in der Forschung, in der Zellschäden beobachtet werden sollen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz bedankt sich bei CONACyT für das Stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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