Summary
Aqui, apresentamos a aplicação da microscopia de força atômica (AFM) como um método simples e rápido para caracterização bacteriana e analisamos detalhes como o tamanho e a forma bacteriana, biofilmes de cultura bacteriana e a atividade de nanopartículas como bactericidas.
Abstract
A microscopia eletrônica é uma das ferramentas necessárias para caracterizar estruturas celulares. No entanto, o procedimento é complicado e dispendioso devido ao preparo da amostra para observação. A microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica de caracterização muito útil devido à sua alta resolução em três dimensões e à ausência de qualquer requisito para vácuo e condutividade da amostra. O AFM pode obter imagens de uma grande variedade de amostras com diferentes topografias e diferentes tipos de materiais.
O AFM fornece informações de topografia 3D de alta resolução desde o nível de angstrom até a escala de mícrons. Ao contrário da microscopia tradicional, o AFM usa uma sonda para gerar uma imagem da topografia da superfície de uma amostra. Neste protocolo, sugere-se o uso deste tipo de microscopia para a caracterização morfológica e de dano celular de bactérias fixadas em um suporte. Foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isoladas de amostras de bulbo de alho). Neste trabalho, células bacterianas foram cultivadas em meios de cultura específicos. Para observar danos celulares, Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram incubados com diferentes concentrações de nanopartículas (NPs).
Uma gota de suspensão bacteriana foi fixada em um suporte de vidro, e as imagens foram obtidas com AFM em diferentes escalas. As imagens obtidas mostraram as características morfológicas das bactérias. Além disso, empregando AFM, foi possível observar o dano à estrutura celular causado pelo efeito de NPs. Com base nas imagens obtidas, o AFM de contato pode ser usado para caracterizar a morfologia de células bacterianas fixadas em um suporte. O AFM também é uma ferramenta adequada para a investigação dos efeitos dos NPs sobre bactérias. Comparada à microscopia eletrônica, a MFA é uma técnica barata e fácil de usar.
Introduction
Diferentes formas bacterianas foram observadas pela primeira vez por Antony van Leeuwenhoek no século 171. As bactérias existem em uma grande diversidade de formas desde a antiguidade, variando de esferas a células ramificadas2. A forma celular é condição fundamental para que taxonomistas de bactérias descrevam e classifiquem cada espécie bacteriana, principalmente para a separação morfológica dos filos gram-positivos egram-negativos3. Vários elementos são conhecidos por determinar as formas celulares bacterianas, todos os quais estão envolvidos nas coberturas e suporte celular como componentes da parede e membrana celular, bem como no citoesqueleto. Dessa forma, os cientistas ainda estão elucidando os mecanismos e processos químicos, bioquímicos e físicos implicados na determinação das formas celulares bacterianas, todas definidas por agrupamentos de genes que definem as formas bacterianas 2,4.
Além disso, os cientistas mostraram que a forma da haste é provavelmente a forma ancestral das células bacterianas, uma vez que essa forma de célula parece ideal em parâmetros significativos para as células. Assim, cocos, espirais, vibrios, filamentosos e outras formas são considerados como adaptações a vários ambientes; De fato, morfologias particulares evoluíram independentemente várias vezes, sugerindo que as formas das bactérias poderiam ser adaptações a ambientes particulares 3,5. No entanto, ao longo do ciclo de vida celular da bactéria, a forma celular muda, e isso também ocorre como uma resposta genética a condições ambientais prejudiciais3. A forma e o tamanho das células bacterianas determinam fortemente a rigidez, robustez e relação superfície/volume das bactérias, e essa característica pode ser explorada para processos biotecnológicos6.
A microscopia eletrônica é usada para estudar amostras biológicas devido à alta magnificação que pode ser alcançada além dos microscópios baseados em luz. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) são as técnicas mais utilizadas para este fim; no entanto, as amostras requerem alguns tratamentos antes de serem colocadas na câmara do microscópio para obter imagens apropriadas. Uma capa dourada nas amostras é necessária, e o tempo usado para a aquisição total da imagem não deve ser muito longo. Em contraste, a microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica amplamente utilizada na análise de superfícies, mas também é empregada no estudo de amostras biológicas.
Existem vários tipos de modos de AFM usados na análise de superfície, como modo de contato, modo sem contato ou macheamento, microscopia de força magnética (MFM), AFM condutivo, microscopia de força piezoelétrica (MAP), pico de força tapping (PFT), ressonância de contato e volume de força. Cada modo é utilizado na análise de materiais e fornece diferentes informações sobre a superfície dos materiais e suas propriedades mecânicas e físicas. Entretanto, alguns modos de MFA são utilizados para a análise de amostras biológicas in vitro, como o TFP, pois o TFP permite a obtenção de dados topográficos e mecânicos das células em meio líquido7.
Neste trabalho, usamos o modo mais básico incluído em cada modelo antigo e simples de AFM - o modo de contato. O AFM usa uma sonda afiada (cerca de <50 nm de diâmetro) para escanear áreas inferiores a 100 μm. A sonda é alinhada à amostra para interagir com os campos de força associados à amostra. A superfície é escaneada com a sonda para manter a força constante. Em seguida, uma imagem da superfície é gerada monitorando o movimento do cantilever à medida que ele se move pela superfície. As informações coletadas fornecem as propriedades nanomecânicas da superfície, como aderência, elasticidade, viscosidade e cisalhamento.
No modo de contato AFM, o cantilever é escaneado em toda a amostra em uma deflexão fixa. Isso permite determinar a altura das amostras (Z), o que representa uma vantagem sobre as outras técnicas de microscópio eletrônico. O software AFM permite a geração de uma varredura de imagem 3D pela interação entre a ponta e a superfície da amostra, sendo que a deflexão da ponta é correlacionada com a altura da amostra através de um laser e um detector.
No modo estático (modo contato) com força constante, a saída apresenta duas imagens diferentes: a altura (topografia z) e o sinal de deflexão ou erro. O modo estático é um modo de imagem simples e valioso, especialmente para amostras robustas no ar que podem lidar com as altas cargas e forças de torção exercidas pelo modo estático. O modo de deflexão ou erro é operado no modo de força constante. No entanto, a imagem de topografia é reforçada pela adição do sinal de deflexão à estrutura da superfície. Neste modo, o sinal de deflexão também é referido como o sinal de erro, pois a deflexão é o parâmetro de realimentação; Quaisquer características ou morfologia que aparecem neste canal são devidas ao "erro" no loop de feedback ou, melhor, devido ao loop de feedback necessário para manter um setpoint de deflexão constante.
O design exclusivo do AFM o torna compacto - pequeno o suficiente para caber em uma mesa - ao mesmo tempo em que tem resolução alta o suficiente para resolver etapas atômicas. O equipamento AFM tem um custo menor do que o equipamento para outros microscópios eletrônicos, e os custos de manutenção são mínimos. O microscópio não requer um laboratório com condições especiais, como uma sala limpa ou um espaço isolado; ele só precisa de uma mesa livre de vibrações. Para AFM, as amostras não precisam passar por preparação elaborada como para outras técnicas (capa de ouro, emagrecimento); apenas uma amostra seca tem de ser anexada ao porta-amostras.
Usamos o modo de contato AFM para observar as morfologias bacterianas e os efeitos das NPs. A população e a morfologia celular das bactérias fixadas em um suporte podem ser observadas, assim como o dano celular produzido pelas nanopartículas sobre as espécies bacterianas. As imagens obtidas pelo modo de contato AFM confirmam que é uma ferramenta poderosa e não limitada por reagentes e procedimentos complicados, tornando-se um método simples, rápido e econômico para caracterização bacteriana.
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Protocol
1. Isolamento e identificação bacteriana
- Isolamento de uma cepa endofítica de meristemas de bulbo de alho:
- Colocar fragmentos de 2 mm de meristemas de bulbos de alho previamente descascados, desinfectados e cortados em ágar de soja tripticase (TSA) como meio de crescimento rico e incubar a 25 °C por 1 dia.
- Com base nas diferenças morfológicas das colônias bacterianas - forma, tamanho, cor, borda, luz transmitida, luz refletida, textura, consistência e produção de pigmentos - descrever os diferentes morfotipos observados e purificar cruzando uma colônia representativa de cada morfotipo.
- Preservar todas as estirpes bacterianas purificadas em glicerol a 30% a −80 °C.
- Identificar uma cepa selecionada aleatoriamente (9AP) por sequenciamento do 16S rDNA. Extrair o DNA seguindo o método de Hoffman e Winston8.
- Amplificar o 16S rRNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) com 100 ng de DNA, 1x tampão polimerase, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol cada de 27F/1492r oligonucleotídeos universais e 1 U de DNA polimerase9. Use as seguintes condições de termociclador: 95 °C por 5 min para a desnaturalização inicial; seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 °C como temperatura de desnaturalização, 1 min a 56 °C como temperatura de hibridização e 1 min a 72 °C como temperatura de extensão; e depois 10 min a 72 °C como extensão final.
- Sequenciamento capilar do produto da PCR usando os mesmos oligonucleotídeos; utilizar o método dideoxi-terminal com o kit de instalação da matriz para sequenciamento capilar10 e realizar eletroforese em sistema multicapilar automatizado11.
- Editar manualmente as sequências, comparar a sequência com a biblioteca do GenBank usando uma busca BLAST e identificar provisoriamente a cepa com o padrão-ouro de pelo menos 98,7% de identidade com a espécie mais próxima12,13.
NOTA: A cepa 9AP foi identificada como pertencente à espécie Pseudomonas hunanensis, com identidade de 99,86% com a sequência da cepa P. hunanensis LV (JX545210).
2. Preparo de amostra bacteriana para observação morfológica por AFM
- Em condições estéreis, coloque uma gota da suspensão bacteriana (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) em uma lâmina de vidro.
- Fixe as amostras na lâmina por aquecimento a seco. Passe a lâmina suavemente sobre uma chama várias vezes até que a amostra esteja seca.
NOTA: A fixação de amostras é uma técnica de rotina em microbiologia para observar organismos procarióticos fixos e simular sua estrutura como células vivas o mais próximo possível. - Coloque as amostras fixas em uma placa de Petri e leve-as ao equipamento AFM para observação.
OBS: Como as amostras podem ser alteradas pelas condições climáticas ao longo do tempo, reserve um tempo máximo de 24 h para análise no equipamento AFM. Manter as amostras livres de poeira.
3. Efeito antibacteriano das nanopartículas de MgO contra bactérias
NOTA: A síntese e caracterização de NPs de MgO foram publicadas anteriormente14. Neste trabalho, a atividade antibacteriana dos nanomateriais foi estimada com base no manual do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando métodos de macrodiluição e microdiluição para inibição15,16.
- Estimativa da atividade inibitória mínima (CIM) e bactericidas (CMB)
- Pré-crescimento das cepas
- Inocular uma quantidade adequada de Escherichia coli ou Staphylococcus aureus em caldo nutritivo para obter uma concentração final de 1 × 108 UFC/mL.
- Incubar a suspensão a 37 °C (± 2 °C) durante 18-24 h.
- Pós-crescimento de cepas aclimatizadas
- Mergulhe uma alça bacteriológica estéril na suspensão, tocando o fundo do tubo.
- Realizar streaking com a alça em ágar azul de eosina e metileno e ágar nutriente.
- Incubar as placas de ágar a 37 °C (± 2 °C) durante 24 horas.
- Seleção de colônias para a preparação do inóculo padronizado
- Pegue de três a cinco colônias com o mesmo tipo morfológico tocando o topo da colônia na placa de Petri com uma alça bacteriológica.
- Transfira e mergulhe a seleção em 3-5 mL de caldo Müller-Hinton.
- Incubar a 37 °C (± 2 °C) para atingir uma turbidez de 1 × 108 UFC/mL ou 2 × 108 UFC/mL.
OBS: Neste trabalho, os padrões de turbidez de McFarland foram utilizados como referência para as suspensões bacteriológicas; especificamente, o padrão 0,5 corresponde aproximadamente a uma suspensão homogênea de E. coli de 1,5 × 108 células/mL. Um espectrofotômetro UV-Vis foi usado para medir a turbidez. - Tome 1 mL e adicione a 9 mL de caldo estéril. Tomar 200 μL desta diluição e adicioná-la a 19,8 mL de caldo estéril para obter uma concentração final de 5 × 105 UFC/mL.
- Concentrações requeridas de nanopartículas de MgO
- Use um ultrasonicator para a preparação das soluções.
- Suspender o nanomaterial em água estéril com o dobro da concentração necessária para obter soluções seriadas.
- Adicione essas suspensões a tubos estéreis contendo caldo Müller-Hinton para atingir a nova faixa de concentrações necessárias para o experimento.
NOTA: As seguintes concentrações de MgO NPs foram aplicadas para microdiluição: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm e 8.000 ppm.
- Preparação da microdiluição15
- Prepare uma nova e estéril placa de microtitulação de 96 poços (microplaca). Etiquetar a coluna nº 12 da microplaca como coluna de esterilidade; coluna de rótulo nº 11 como uma coluna de controle de crescimento.
- Adicionar 120 μL das suspensões de nanopartículas com as diferentes concentrações às colunas n.º 1-10.
- Inocular 120 μL de bactérias (5 × 105 UFC/mL) nos poços nas colunas nº 1-10.
NOTA: Para este estudo, as linhas G e H foram controles com ceftriaxona nas concentrações sugeridas pelos padrões CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm e 0,03 ppm. - Incubar a microplaca de 96 poços durante 24 h a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Por fim, analise os poços.
- Pré-crescimento das cepas
- Observação das alterações morfo-estruturais induzidas por nanopartículas de MgO nas linhagens bacterianas por AFM
- Retirar 250 μL dos poços dos testes de microdiluição, misturar com 750 μL de água estéril e centrifugar a 2.000 × g de 2 min a 5 min a 5 °C.
- Lavar os precipitados três vezes com 1 mL de água estéril de cada vez e, ao final das lavagens, adicionar 500 μL de água a eles.
- Para obter as imagens de AFM, retirar 10-20 μL da suspensão final de cada poço de partida, realizar um esfregaço em uma lâmina previamente limpa por ultrassom (30 min) e secar em temperatura ambiente por 1 h.
4. Medições de AFM
NOTA: Aqui, o microscópio de força atômica em modo de contato foi montado em uma estação de trabalho antivibratória que permitiu o isolamento do microscópio de quaisquer fontes vibracionais mecânicas e manteve o sistema nivelado. A interferência elétrica é diminuída com filtros de linha e proteção contra surtos. O AFM usado aqui alinha automaticamente o feixe de laser ao fotodetector.
- Ligue o computador e o AFM e selecione o modo Contato, as sondas contAI-G e as opções Auto Slope nas ferramentas de software. Os valores padrão do controlador Z são Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 e Tip voltage = 0 mV.
- Coloque as amostras no modo de contato AFM usando uma cabeça de varredura de 70 μm. Foram utilizados balanços de silicone ContAI-G com constante de mola de 0,13 N/m.
- Use um dispositivo de câmera montado em duas lentes integradas à cabeça de varredura para obter uma visão rápida da superfície da área sob a sonda.
- Execute manualmente um deslocamento no plano XY para escolher a área desejada. A sonda é feita para se aproximar eletronicamente da amostra de superfície até que as condições de contato sejam atingidas. Ajuste eletronicamente o plano de medição XY do scanner e a superfície da amostra reduzindo as inclinações nas direções XY.
- Use os parâmetros padrão do software: 1 linha por segundo a 256 pontos por linha.
- Primeiro, execute uma faixa de varredura completa de uma área de 70 μm x 70 μm; Em seguida, selecione uma área menor usando a ferramenta Zoom. O AFM otimiza o intervalo do gráfico em Z automaticamente.
NOTA: Ao diminuir as linhas por segundo de tempo, o tempo total de varredura aumenta, a qualidade da varredura é mais definida e algum ruído da medição também é eliminado. - Para selecionar uma nova área da amostra, retraia o cantilever eletronicamente e mova a amostra ao longo do plano XY. Realize uma nova varredura usando o procedimento descrito nas etapas 4.5 e 4.6.
NOTA: As varreduras obtidas são mostradas em uma escala de barra de cor única, na qual as cores claras são associadas a altitudes mais altas e as cores escuras são associadas a altitudes mais profundas. O software AFM gera uma visão 3D da varredura que permite a apreciação dos detalhes da superfície medida. - Execute o processamento de dados usando o nivelamento linha por linha no menu Ferramentas da imagem na seleção de filtro, que é o método de nivelamento mais usado e mais simples.
Observação : esse método de nivelamento pega cada linha horizontal ou vertical produzida na imagem AFM e a ajusta a uma equação polinomial. - Otimize a altura máxima e mínima na barra de cores à direita para obter a melhor resolução de imagem.
- Execute a análise de imagem usando o menu Análise na barra de ferramentas. Determine as alturas e distâncias selecionando os pontos iniciais e finais assim que a ferramenta desejada for selecionada.
Observação : os usuários devem tentar os diferentes filtros do menu Ferramentas para evitar artefatos de imagem de ponta devido ao nivelamento usado no processo de nivelamento. Os artefatos de imagem aparecem como linhas de raia e são mostrados em algumas das imagens AFM.
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Representative Results
Imagens da morfologia e tamanho das cepas de S. aureus e P. hunanensis , bem como a organização populacional de ambas as linhagens, foram obtidas por microscopia de força atômica em modo de contato. As imagens de S. aureus mostraram que sua população estava distribuída por zonas com agregados de cocos (Figura 1A). Com o aumento da escala, houve maior valorização da distribuição populacional e morfologia dos cocos (Figura 1B). Os laudos de microscopia mostraram que uma estrutura pseudo-hemisférica estava presente nas células adjacentes de S. aureus, mas que, em geral, as bactérias apresentavam uma morfologia esférica na forma de coco após a divisão celular, como mostrado anteriormente nas imagens de AFM. Além disso, as imagens do modo de contato AFM permitiram a determinação do tamanho dos cocos, que apresentaram largura média de 1,25 μm. Os valores obtidos a partir da medida de 20 células são mostrados na Figura 2.
No caso de P. hunanensis, observou-se distribuição homogênea em toda a superfície do suporte de vidro, formando uma monocamada bacteriana aderida ao suporte (Figura 3A), conforme relatado por Zuttion et al., em que os autores imobilizaram P. aureginosa sobre suporte sólido e apresentaram o mesmo comportamento. A bactéria Pseudomonas hunanensis foi observada em forma de bastonete, com comprimento de 1,9 μm (L) e largura de 0,9 μm (W) (Figura 3B,C); esses dados estão dentro dos valores relatados para P. fluorescens de 1,5-2,0 μm (L) e 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
Para visualizar as alterações morfoestruturais decorrentes da interação das NPs de MgO, as cepas bacterianas foram submetidas à análise de AFM após o tratamento (microdiluição). Três grupos são mostrados na Figura 4 e Figura 5: Figura 4A-C e Figura 5A-C são os controles; as imagens das Figuras 4D-F e 5D-F foram obtidas a partir dos resultados da microdiluição na CIM; as imagens da Figura 4G-I e Figura 5G-I foram obtidas em concentração maior que a CIM.
As imagens do grupo superior da Figura 4A-C mostram uma célula do tipo coco de Staphylococcus aureus com superfície lisa e contornos homogêneos, que cresceu em ambiente adequado em caldo de Müeller-Hinton por 24 h de acordo com a técnica de microdiluição. O diâmetro médio foi de 1 μm ± 0,15 μm. Esse diâmetro praticamente desapareceu após o tratamento com DN, como mostra a Figura 4D-F, uma vez que a deterioração da estrutura celular era muito severa. De acordo com o corte transversal, a altura média para o controle foi de 200 nm ± 50 nm; A altura das células tratadas foi reduzida em 40% (120 nm ± 5 nm) em relação aos controles. As imagens mostram claramente mudanças na superfície, como a formação de vesículas, após a exposição a NPs de MgO no CMI das partículas; além disso, com a duplicação das concentrações, o estado interno das estruturas celulares foi afetado e material citosólico foi liberado, como mostram as imagens da Figura4G-I 20,21.
Essas alterações também foram identificadas em células de E. coli, como mostra a Figura 5, com condições semelhantes a S. aureus. Os controles dessa bactéria apresentaram superfícies lisas, destacando-se sua forma bastonete (bacilo) muito homogênea, sem qualquer alteração aparente. As imagens tridimensionais mostram as regiões topográficas mais altas associadas ao microrganismo em branco. A altura média da E. coli controle foi de 160 nm ± 50 nm, e de acordo com as imagens transversais, a altura média diminuiu para 76 nm ± 10 nm para células expostas por 24 h a uma concentração de nanopartículas de MgO de 500 ppm (MIC). A estrutura desapareceu completamente a uma concentração de 1.000 ppm, e apenas as silhuetas das bactérias puderam ser distinguidas. Ao analisar as imagens para ambas as concentrações, observou-se que, em relação aos controles, a morfologia celular das células tratadas estava significativamente alterada, com alongamento de 2,0 μm ± 0,5 μm (Figura 5A-C) a 3,0 μm ± 0,3 μm, como mostram as imagens da Figura 5D-I. Esse aumento ficou claro quando a estrutura celular foi perdendo a homeostase interna, causando colapso estrutural20,22. As imagens de bactérias expostas a NPs de MgO mostraram claramente alterações superficiais, como formação de cristas ou corrugações, formando distúrbios vesiculares em ambas as CIMs e ao dobrar as concentrações20,22.
Figura 1: Modo de contato da microscopia de força atômica para Staphylococcus aureus. Esta figura mostra as topografias retiradas de S. aureus em diferentes escalas: (A) 70 μm e (B) 5,0 μm. As áreas de mapeamento foram escolhidas para obtenção da topografia de S. aureus ; a imagem B mostra claramente cocos de S. aureus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Topografias e histogramas do modo de contato da microscopia de força atômica de Staphylococcus aureus. A imagem mostra a (A) topografia e (B) histograma dos diâmetros das bactérias S. aureus fixados em suporte de vidro utilizando o procedimento de fixação térmica. O diâmetro celular foi medido com o software AFM; n = 20. A imagem é uma representação da medida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Modo de contato da microscopia de força atômica para Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Esta figura mostra as topografias retiradas de P. hunanensis 1AP-CY em diferentes escalas: (A) 70 μm, (B) 20 μm e (C) 5,0 μm. As imagens em diferentes escalas mostram a distribuição da população celular na lâmina. Para analisar a morfologia celular, focaliza-se uma área com menor densidade populacional, como mostra a imagem B, que mostra a forma da haste de P. hunanensis (o sinal de deflexão é mostrado para melhorar a imagem da topografia). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Imagens em modo de contato AFM obtidas para S. aureus (parte superior) e S. aureus não tratados expostos a nanopartículas de MgO de 250 ppm e 500 ppm (meio e fundo) por 24 h. (A,D,G) Imagens topográficas; (B,E,H) imagens tridimensionais; (C,F,I) imagens transversais. Mudanças estruturais nas bactérias foram observadas quando se emprega a concentração inibitória mínima de MgO (250 ppm) e uma maior concentração (500 ppm). O sinal de deflexão é mostrado para melhorar a imagem da topografia. As figuras 4A,D,G são de Muñiz Diaz et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens em modo de contato AFM obtidas para E. coli não tratada (superior) e E. coli expostas a nanopartículas de 500 ppm e 1.000 ppm de MgO (meio e fundo) por 24 h. (A,D,G) Imagens topográficas; (B,E,H) imagens tridimensionais; (C,F,I) imagens transversais. Mudanças estruturais nas bactérias foram observadas ao empregar a concentração inibitória mínima de MgO (500 ppm) e uma maior concentração (1.000 ppm). As figuras 5A,D,G são de Muñiz Diaz et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A microscopia é uma técnica comumente utilizada em laboratórios biológicos que permite a investigação da estrutura, tamanho, morfologia e arranjo celular de amostras biológicas. Para aprimorar essa técnica, podem ser utilizados diversos tipos de microscópios que diferem entre si em suas características ópticas ou eletrônicas, que determinam o poder de resolução do instrumento.
Na pesquisa científica, o uso da microscopia é necessário para a caracterização de células bacterianas; por exemplo, a microscopia demonstrou que o NaCl influencia a resistência térmica e a morfologia celular de cepas de E. coli, o extrato de Schisandra chinensis mostra efeitos antibacterianos contra S. aureus, S. aureus desenvolve termotolerância após choque térmico subletal e E. coli biomineraliza platina 23,24,25,26,27 . Assim, as vantagens apresentadas pelo AFM permitiram sua expansão para as áreas de pesquisa de meio ambiente e biologia.
O microscópio de força atômica é um instrumento utilizado no modo contato para analisar bactérias in situ e no modo sem contato para determinar a topografia de materiais macro e nanoscópicos. A vantagem do AFM sobre outras técnicas é que ele requer menos amostras para obter imagens topográficas; Também é considerada uma técnica não destrutiva, e não danifica ou compromete a estrutura da imagem analisada. Embora tenhamos utilizado a fixação térmica neste protocolo, a morfologia das células bacterianas não foi alterada. É importante mencionar que esta técnica é comumente utilizada no laboratório de microbiologia para o estudo de morfologias bacterianas. Ao contrário das amostras de tecidos vegetais e animais, a técnica de fixação térmica produz alterações em proteínas e lipídios que se manifestam na deterioração tecidual; Nas bactérias, a técnica provoca um ligeiro encolhimento da célula que não interfere na observação da forma e identificação celular.
Com o AFM, o preparo da amostra é fácil e não requer nenhum produto químico, como no caso da microscopia eletrônica, onde é essencial que a amostra a ser analisada seja condutiva, já que a imagem é produzida pela interação dos elétrons emitidos pelo equipamento e pela amostra. Se a amostra não for condutora, deve ser metalizada com um elemento condutor como o ouro por meio da técnica de deposição física de vapor. Além disso, a resolução da microscopia eletrônica atinge até 0,4 nm, dependendo da lente e do modelo, enquanto o AFM no modo de contato pode atingir resolução micrométrica, nanométrica ou mesmo picémetro, o que o torna competitivo com a microscopia eletrônica22. Outra vantagem do AFM sobre a microscopia eletrônica é que ele não requer condições de alto vácuo para o processamento das amostras20,21. Outras vantagens do AFM sobre as técnicas comumente utilizadas são o baixo custo e o curto tempo de aquisição das imagens.
Com relação à técnica de fixação da amostra bacteriana a uma placa de vidro, é importante mencionar que a fixação térmica é uma técnica comumente utilizada em laboratórios de microbiologia. Esta técnica é utilizada para que amostras bacterianas possam ser identificadas por coloração simples ou diferencial. Ao mesmo tempo, a forma das bactérias, comumente cocos ou bastonetes, pode ser vista. Uma desvantagem da técnica de fixação térmica é a diminuição do tamanho das bactérias, mas esta técnica não compromete a forma das bactérias.
Após a fixação, deve-se tomar cuidado para evitar o envelhecimento da amostra, que pode se manifestar como uma diminuição significativa no tamanho celular; portanto, é aconselhável analisar a amostra em até 24 h após a fixação. Deve-se também tomar cuidado para garantir que a amostra não seja exposta à poeira; as amostras devem, portanto, ser mantidas em um recipiente fechado (por exemplo, uma placa de Petri). Essas condições são críticas, pois podem alterar as imagens de AFM obtidas.
É claro que diminuir o tamanho das bactérias pode afetar alguns trabalhos de pesquisa, bem como que outras maneiras de anexar as bactérias a um suporte podem ser necessárias. Por exemplo, biofilmes de S. aureus cultivados em caldo BM em placas de 34 mm foram fixados com gliceraldeído. Além disso, S. aureus foi imobilizado com balanços em forma de V tratados com poli-L-lisina, enquanto para C. albicans, hifas foram fixadas em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina carregada positivamente para analisar a troca de proteínas séricas adsorvidas durante a adesão de ambas a uma superfície abiótica28,29.
Neste trabalho, a fixação térmica das amostras não alterou a forma ou os agregados formados pelas bactérias, e a fixação térmica permitiu visualizar o efeito das nanopartículas. Portanto, as topografias de AFM puderam mostrar a forma dos cocos isolados ou agregados de S. aureus e os bastões de P. hunanensis (Figura 1 e Figura 3). Além disso, também verificamos que S. aureus e E. coli apresentaram danos em suas estruturas devido ao efeito das nanopartículas de MgO, enquanto as amostras controle (sem nanopartículas) não apresentaram alteração em sua morfologia (Figura 4 e Figura 5).
Este trabalho demonstra que o uso do modo de contato AFM é uma alternativa viável para caracterizar a topologia superficial e defeitos de amostras biológicas, como foi demonstrado com S. aureus, P. hunanensis e E. coli. Além disso, a técnica de fixação térmica não é um fator determinante que altera a superfície celular e impede a análise. Modestamente, podemos sugerir que a fixação térmica pode ser uma vantagem no uso de AFM. As amostras são menos processadas e o uso de reagentes químicos é evitado. Portanto, a metodologia é uma técnica simples e econômica. Vale ressaltar que isso pode mudar dependendo da análise específica a ser realizada, como demonstrado para o estudo de biofilmes e adesãobacteriana28,29. Como uma possível extensão deste trabalho, o AFM de modo de contato pode ser usado para analisar o efeito de NPs sobre outras bactérias de importância médica ou em pesquisas nas quais danos celulares devem ser observados.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz agradece à CONACyT pela bolsa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
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