Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס מודל עכברי של סיליקוזיס באמצעות חשיפה חוזרת ונשנית לתרחיפים של סיליקה באמצעות טפטוף אף. מודל זה יכול לחקות ביעילות, בנוחות ובגמישות את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות וחיסכון גבוהים.
Abstract
סיליקוזיס יכול להיגרם על ידי חשיפה לאבק סיליקה גבישי נשימתי (CSD) בסביבה תעשייתית. הפתופיזיולוגיה, הסינון והטיפול בסיליקוזיס בבני אדם נחקרו כולם בהרחבה באמצעות מודל הסיליקוזיס של העכבר. על-ידי גרימת עכברים לשאוף CSD שוב ושוב לריאותיהם, העכברים יכולים לחקות את הסימפטומים הקליניים של סיליקוזיס אנושי. מתודולוגיה זו מעשית ויעילה מבחינת זמן ותפוקה, ואינה גורמת לפגיעה מכנית בדרכי הנשימה העליונות עקב ניתוח. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה תהליך טרנספורמציה חריפה/כרונית של סיליקוזיס. הנהלים העיקריים היו כדלקמן. אבקת CSD מעוקרת של 1-5 מיקרומטר נטחנה במלואה, מרחפת במי מלח ופוזרה באמבט מים על-קולי למשך 30 דקות. עכברים תחת הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן עברו מנשימה רדודה ומהירה לשאיפה עמוקה ואיטית במשך כ -2 שניות. העכבר הונח בכף יד, וקצה האגודל נגע בעדינות בקצה השפה של לסת העכבר כדי ליישר את נתיב האוויר. לאחר כל נשיפה, העכברים נשמו את תרחיף הסיליקה טיפה אחר טיפה דרך נחיר אחד, והשלימו את התהליך תוך 4-8 שניות. לאחר שנשימתם של העכברים התייצבה, ליטפו וליטפו את החזה שלהם כדי למנוע את שיעול ה-CSD בשאיפה. לאחר מכן הוחזרו העכברים לכלוב. לסיכום, מודל זה יכול לכמת CSD לאורך המעבר הפיזיולוגי הטיפוסי של חלקיקים זעירים לתוך הריאה, מדרכי הנשימה העליונות אל הסימפונות הסופניים ונאדיות. זה יכול גם לשכפל את החשיפה החוזרת ונשנית של עובדים עקב עבודה. המודל יכול להתבצע על ידי אדם אחד ואינו זקוק לציוד יקר. זה בנוחות וביעילות מדמה את תכונות המחלה של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות גבוהה.
Introduction
עובדים נחשפים באופן בלתי נמנע לאבק סיליקה גבישי לא סדיר (CSD), שניתן לשאוף והוא רעיל יותר בהקשרים תעסוקתיים רבים, כולל כרייה, כלי חרס, זכוכית, עיבוד קוורץ ובטון 1,2. מצב שאיפת אבק כרוני המכונה סיליקוזיס גורם לפיברוזיס ריאתי מתקדם3. על פי נתונים אפידמיולוגיים, שכיחות הסיליקוזיס נמצאת בירידה עולמית בעשורים האחרונים, אך בשנים האחרונות היא עולה ומשפיעה על צעירים 4,5,6. המנגנון הבסיסי של סיליקוזיס מהווה אתגר משמעותי למחקר המדעי בשל תחילתו החתרנית ותקופת הדגירה הממושכת. עדיין לא ידוע כיצד מתפתחת סיליקוזיס. יתר על כן, אין תרופות הנוכחיות יכול לעצור את התקדמות סיליקוזיס ופיברוזיס ריאתי הפוך.
המודלים הנוכחיים של עכבר עבור סיליקוזיס כוללים בליעה קנה הנשימה של השעיה מעורבת של CSD. לדוגמה, מתן CSD לריאות על ידי אימוץ טראומת קנה הנשימה הצווארית לאחר הרדמה אינו תואם חשיפה אנושית חוזרת ונשנית לאבק צבע7. ההשפעה של חשיפה לאבק סביבתי על אנשים ניתן ללמוד על ידי חשיפתם CSD בצורה של אירוסולים, אשר משקף בצורה מדויקת יותר את הריכוזים הסביבתיים של חומר רעיל זה8. עם זאת, CSD סביבתי לא יכול פשוט להיות שואף ישירות לתוך הריאות בשל המבנה הפיזיולוגי הייחודי של אף העכבר9. יתר על כן, הציוד הקשור לטכנולוגיה זו הוא יקר, מה שגרם לחוקרים להעריך מחדש את מודל סיליקוזיסעכבר 10. על ידי שאיפת תרחיף CSD דרך טפטוף אף חמש פעמים בתוך שבועיים, ניתן היה לבנות מודל דינמי של סיליקוזיס. דגם זה עקבי ובטוח ובו בזמן קל לשימוש. חשוב לציין כי מחקר זה מאפשר שאיפה חוזרת ונשנית של CSD בעכברים. מודל הסיליקוזיס של העכבר שנוצר באמצעות הליך זה צפוי להיות מועיל יותר לדרישות המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים פעלו בהתאם להנחיות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (פרסום NIH מס' 8023, תוקן בשנת 1978) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה.
1. ניהול והאכלת עכברים
- הקצו 20 עכברים זכרים בריאים מסוג C57BL/6 לקבוצות הניסוי או הרכב ביחס של 1:1. התאקלמו את העכברים לסביבה החדשה למשך שבוע.
- ספק זמן אור קבוע של 12 שעות ביום. השתמש במתג בקרת זמן לתזמון מדויק.
2. הכנת השעיית CSD
- לפחות יום אחד לפני טפטוף האף, לטחון את הסיליקה במכתש אגת במשך 0.5 שעות.
- שימו לב לגודל ולצורה של חלקיקי הגביש. צלם תמונות מייצגות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
- השתמש בסרט מוליך כדי לקשור את החלקיקים כדי להכין את הדגימה ל- SEM. השתמש במייבש שיער כדי להעיף בעדינות את חלקיקי הסיליקון שאינם מחוברים היטב.
- פנה את תא הדגימה, הפעל את הלחץ הגבוה וצלם את התמונה.
הערה: מרחק העבודה (WD) בין העדשה לדגימה הוא 5.9 מ"מ, מתח התאוצה הוא 2.0 קילו-וולט וההגדלה (מאג) היא 100,000x, באמצעות גלאי SignalA. החלקיקים מפוזרים בהתגבשות לא סדירה, וכ-80% מהם הם בקוטר של 1-5 מיקרומטר (איור 1A).
- הפוך תרחיף CSD סטרילי של 20 מ"ג / מ"ל. לדלל את CSD באמצעות מלוחים סטריליים ולערבב אותו עם שייקר קולי (40 קילוהרץ, 80 W) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות.
- מערבבים ומערבבים היטב את מתלה ה-CSD על מערבל מערבולת במשך 10 שניות לפני מתן טפטופי האף.
3. מתן טפטופים לאף לעכבר
- הרדימו במהירות עכבר עם איזופלורן 2% במינון של 3.6 מ"ל/שעה במכשיר הרדמה (איור 1B, פאנל שמאלי).
הערה: ההרדמה צריכה להתבצע במכסה אדים כדי למנוע שאיפת חומר ההרדמה על ידי הטכנאי. ודא כי עומק ההרדמה הולם על ידי התבוננות בשינוי מנשימה מהירה ולא סדירה למצב איטי ויציב בעכברים. - טפטוף 50 μL של CSD באף בתוך 4-8 שניות (איור 1B, מימין).
- לטפטוף האף, הניחו את ראש העכבר על המפרק המטא-קרפופלנגאלי של החוקר עם קצה האצבע המורה.
- שמור את העכבר במצב נוטה, עם ארבע אצבעות מכופפות מעט וקצה האגודל נוגע קלות בשפה התחתונה של העכבר כדי ליישר את נתיב האוויר. הימנע מלגעת בלוע כדי לעורר את רפלקס ההקאה.
- לשאוף 50 μl של נוזל באמצעות פיפטה 200 μl. זרוק את הנוזל לתוך חלל האף של העכבר בשלוש עד ארבע מנות מחולקות בהתאם לקצב הנשימה של העכבר. כל החדרה צריכה להכיל 15 עד 20 μl נוזל. יש לתת את הטפטוף אחת ל-3 ימים, 5 פעמים תוך 12 יום. טפל בעכבר הבקרה עם כמות שווה של מלוחים.
- עסו בעדינות את אזור הלב של העכבר 5x-10x במשך 5 שניות.
- החזק את גוף העכבר עם כף היד, צבוט את העור בחלק האחורי של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה, וקבע את הגפיים האחוריות של העכבר עם האצבעות האחרות. לאחר מכן, לחץ בעדינות על אזור פעימות הלב של העכבר עם האצבע המורה של היד השנייה 5-10 פעמים בתקופה של 5 שניות.
- כאשר נשימתו של העכבר התייצבה, הניחו אותו בכלוב התאוששות עם כרית חימום והתבוננו עד שהוא מתאושש מההרדמה, ואז החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. להקריב את העכבר בגיל 31 יום.
4. איסוף רקמות הריאה והכנת קטע פרפין
- הזריקו 0.18 מ"ל של 10% כלורל הידרט תוך צפקי, כדי להבטיח שהעכברים לא יגיבו לגירוי הבוהן או הזנב (מבוצע באמצעות מלקחיים עם שיניים). לאחר מכן, המשך לשלב הבא.
- תקן את גפי העכבר על לוח בדיקת קצף וססס עם 75% אלכוהול כדי להרטיב את הפרווה. הסר את רוב צלעות החזה בקו האמצע של עצם הבריח ופתח את חלל בית החזה של העכברים כדי לחשוף את הלב והריאות.
- פתח מיד את האטריום הימני עם מספריים כירורגיים אופתלמיים והזריק לאט 20 מ"ל של חיץ פוספט (PBS) מקצה הלב בפעימת הפרוזדורים השמאלית עם המשרעת הגדולה ביותר כדי לאפשר לכל הדם לזרום. לאחר מכן, להסיר את האונה התחתונה של הריאה הימנית ולאחסן אותו ב -80 ° C עבור ניתוח כתמים מערביים.
- המשך לערבב 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) באותו אתר לאחר הזרקת PBS. לאסוף את הריאה הנותרת ולשמר את הדגימה ב 30 מ"ל של 4% PFA לניתוח פתולוגי.
- לאחר 72 שעות של קיבוע, להטמיע דגימות בפרפין.
- יש לייבש את הרקמות באמצעות סדרה מדורגת של דילולי אתנול (EtOH) במים שעברו דה-יוניזציה (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) למשך שעה אחת כל אחת ב-RT. נקה את הדגימה בשתי שטיפות של קסילן למשך שעה אחת כל אחת.
- יש להחדיר את הדגימות עם שעוות הפרפין המומסת על ידי חימום ל-50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חזור על תהליך זה בצילינדר אחר. מצננים את תבניות השעווה עם רקמות למשך שעה אחת כדי להתקשות.
- לאחר שהשעווה התקשתה והרקמה הוטמעה, השתמש במכונת חיתוך פרפין כדי לחתוך את הרקמה ב -5 מיקרומטר. שלבי החתך והרכבת השקופיות המדויקים תוארו בעבר11.
הערה: זילוח רקמות מספיק מצוין על ידי פיתוח עוויתות שרירים ופיתול זנב לצורת "S" או כיפוף לאחר קבלת 10 מ"ל של 4% PFA.
5. ביצוע צביעת המטוקסילין ואוזין (HE)
- חממו את הרקמות המשובצות בפרפין על פלטה חמה (60°C) במשך יותר מ-4 שעות כדי לאפשר היצמדות למגלשות ושיפור הפרפרפרציה.
- קטעי פרפין Dewax ו hydrate. השרו את המגלשות בדוגמאות בקסילן 2x למשך 30 דקות בכל פעם. לאחר מכן, לטבול אותם אתנול נטול מים, ולאחר מכן 95%, 85%, 75% אלכוהול, ומים deionized במשך 5 דקות, בהתאמה.
- בצע hematoxylin ו eosin צביעה. מכתימים את הרקמות בדלי מכתים המטוקסילין למשך 10 דקות. שטפו אותם במים זורמים בעדינות במשך 5 דקות. לאחר מכן, טבלו את המגלשות בדלי מכתים eosin במשך 10 שניות.
- יש לייבש את הדגימות ב-75%, 85%, 95% ואתנול נטול מים למשך 5 דקות כל אחת. נקה את חלקי הרקמה על ידי טבילתם בקסילן למשך 5 דקות. אטמו את החלק בכ-60 מיקרוליטר טיפות שרף ניטרליות. הניחו את מגלשת הכיסוי מעל החלק והורידו אותו בזהירות כדי למנוע בועות אוויר.
6. ביצוע צביעת מסון
- Dewax ולחות את דגימות פרפין, כפי שהוזכר בשלב 5.2. לאחר מכן, להכתים את גרעיני התא עם 50% hematoxylin של Weigert במשך 10 דקות. השרו את הרקמה בנוזל אתנול חומצי למשך 10 שניות ושטפו את החלקות הרקמה בעדינות במים זורמים להדבקת גרעינים.
הערה: יש להכין את תמיסת צביעת המטוקסילין של Weigert מיד לפני השימוש. - הכתימו את הדגימות בטיפות של תמיסת צביעה אדומה של ליצ'ון (40 מיקרוליטר לכל שקופית רקמה) למשך 7 דקות ושטפו אותן בתמיסת עבודה של חומצה חלשה (30% חומצה הידרוכלורית) למשך דקה אחת כדי להסיר את הצבע האדום של ליצ'ון שאינו קשור.
- טבלו אותם ב-95% אלכוהול למשך 20 שניות וייבשו אותם פי 2 עם אתנול נטול מים למשך 1-3 שניות כל אחד. לאחר מכן, לנקות את הרקמות עם xylene ולאטום אותם עם 60 μL של טיפות שרף ניטרלי, כאמור בשלב 5.4.
7. ביצוע צביעה אדומה של סיריוס
- קטעי פרפין Dewax ו-Hydrate כפי שהוזכר בשלב 5.2.
- הסתננו לחלקים למשך שעה אחת עם תמיסת צביעה אדומה של סיריוס.
- מכתימים את גרעיני התא של הדגימות למשך 8-10 דקות עם תמיסת צביעת המטוקסילין של מאייר. שטפו אותם בעדינות עם מים זורמים במשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לייבש ולנקות את שקופיות הרקמה. חתמו אותם כפי שהוזכר בשלב 5.4.
8. ביצוע אימונוהיסטוכימיה
- Dewax ולחות את דגימות פרפין כמתואר בשלב 5.2.
- יש להחדיר את הדגימות לתמיסת אחזור אנטיגן EDTA במינון 3 מ"ג/מ"ל של כ-30 מ"ל. מרתיחים במשך 20-30 דקות. שטפו את הרקמות במים נטולי יונים, ולאחר מכן דגרו עליהן בתמיסה חוצצת פוספט המכילה 0.5% Tween-20 (PBST) למשך 5 דקות.
- השרו את הדגימות למשך 15 דקות בתמיסת מי חמצן 0.3% כדי להשבית את הפרוקסידז האנדוגני בדגימות. שטפו אותם 3 פעמים עם PBST במשך 5 דקות בכל פעם.
הערה: תמיסת 0.3% מי חמצן חייבת להיות טרייה בסביבה חסינת אור. - חדרו את קרום הדגימות למשך 15 דקות עם תמיסת טריטון-100 0.3%. לאחר מכן, לחסום עם 30-40 μL של אלבומין 5% בסרום בקר (BSA) למשך 1 שעות.
- הסר את פתרון החסימה. הוסיפו נוגדנים ראשוניים מדוללים NF-κB (דילול 1:200) ו-CD68 (דילול 1:1,000) ודגרו על הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס בקופסה רטובה של מיקרוסקופ כדי למנוע אידוי ואור.
- למחרת, העבר אותם ל- RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם עם PBST 3x למשך 5 דקות כל אחד.
- דגרו על הדגימות במשך שעה אחת בנוגדנים משניים נגד עכבר נגד חזרת פרוקסידז (יחס דילול 1:500) ב-RT ושטפו אותם עם PBST 3x למשך 5 דקות כל אחת.
הערה: נוגדנים ראשוניים ומשניים דוללו ב-5% BSA. - דגרו דגימות עם מצע 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) המתאים לנוגדן המסומן באנזים למשך 5-20 דקות. עצור את התגובה עם מים שעברו דה-יוניזציה כאשר מגיעים לעוצמת הצביעה האופטימלית.
הערה: פתרון DAB צריך להיות מוכן טרי ומוגן מפני אור. יש לצפות בתגובת התפתחות הצבע בזמן אמת תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע מתי להפסיק להכתים. דגימות חיוביות מציגות כתמים עזים, בעוד שדגימות שליליות אינן מפתחות צבע. - כתם נגדי את הדגימות במשך 30 שניות עם Weigert hematoxylin. לאחר מכן, לשטוף את הרקמות תחת מים זורמים במשך 1 דקה. לאחר מכן, יש לייבש, לנקות ולאטום את שקופיות הרקמה, כפי שהוזכר בשלב 5.4.
9. ביצוע ניתוח כתם מערבי
- ליז את רקמות הריאה כדי לחלץ חלבונים. הוסף 200 μL של תמיסת עבודה RIPA ל 20 מ"ג של רקמת הריאה.
- הומוגניזציה של הרקמה על קרח במשך 5 דקות באמצעות מטחנה חשמלית ידנית ודגרה במשך שעה על קרח עם ניעור עדין. לאחר מכן, צנטריפוגה הומוגנט ב 4 ° C במשך 15 דקות ב 14,800 x גרם.
- אספו את הסופרנאטנט וקבעו את ריכוז החלבון בעזרת ערכת בדיקת החלבון BCA. הפוך את תמיסת אחסון החלבון עם RIPA לחלבון של 6 מיקרוגרם/מיקרוליטר. הוסף 20 μL של מאגר העמסה פי 5 ל- 80 μL של החלבון ליזט. לשבש את מבנה החלבון המשני על ידי חימום צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות חלבון באמבט מתכת (100 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות.
- לאחר הקירור, aliquot 100 μL של תמיסת אחסון חלבון לתוך כל צינור ולאחסן את הדגימות במקרר -80 °C. לדלל את ריכוז החלבון ל 2-3 מיקרוגרם / μL עם חיץ העמסה 1x לפני אלקטרופורזה.
הערה: תהליך מיצוי החלבון צריך להתבצע על קרח. עבור פתרון העבודה RIPA, הוסף 1 μL של 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ל 99 μL של RIPA כדי לעכב פירוק חלבון phosphorylated. הכן מאגר טעינה 1x על ידי דילול מאגר העמסה 5x עם RIPA ביחס של 1:4. - מוסיפים 20 מק"ג דגימות לכל באר ומפעילים את הג'ל. עבור 5% ג'לים מרוכזים, השתמש 80 V במשך 20 דקות כדי לקבל אלקטרופורזה למטה מאותה נקודת התחלה. עבור 10% ג'לים מבודדים, לרוץ ב 100 V במשך 1 שעה כדי לאפשר חלבונים של משקלים מולקולריים שונים להיות מופרדים ככל האפשר.
- הפעל מראש את קרום PVDF עם מתנול למשך 20 שניות. מעבירים את החלבונים לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה עם זרם 400 mA למשך 1-2 שעות.
הערה: ודא שמיכל האלקטרופורזה ומיכל האלקטרוטרנספר אופקיים. מצננים את המיכל כולו בקרח, מכיוון שתהליך העברת הממברנה מייצר חום רב. - שטפו את הממברנה בתמיסת TBST במשך 5 דקות בכל פעם, 5x. לאחר מכן, לחסום עם 5% BSA או 5% חלב רזה במשך 1 שעות. לדלל את הנוגדנים העיקריים NF-κB (1:1,000) ו β-אקטין (1:1,000) עם 5% BSA. יש לטבול את הרצועות בתמיסת הנוגדנים ולנער את הרצועות בעדינות למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
- שטפו את הרצועות עם PBST. לאחר מכן, יש לדלל נוגדן משני מצומד נגד ארנב של חזרת (HRP) נגד ארנב (1:10,000) ולדגור אותם בנוגדן המשני המדולל למשך שעה אחת ב-RT עם רעידות עדינות.
- הכינו מפתח כימילומינסנציה משופר (ECL), זרקו אותו על הרצועה ודגרו במשך 3 דקות.
- יש לחשוף את הרצועה למכונת הדמיה ג'ל למשך 20 שניות. מדוד את הערך האפור של הרצועה כדי להעריך את רמת החלבון באמצעות תוכנת מערכת. השתמש β-אקטין כבקרה פנימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפתוגנזה הפוטנציאלית של סיליקוזיס בעכברים נחקרה בשיטה המוצעת. מצאנו כי משקל הגוף של העכברים בקבוצת הניסוי ירד משמעותית ביחס לקבוצת הביקורת, וכי משקל הגוף התאושש לאט לאחר הפסקת החשיפה. בשל המינון האופטימלי המשמש כאן, לא נצפתה תמותה בעכברים שנחשפו לסיליקה בניסוי זה. מפת הדרכים הטכנית של טפטוף אף חוזר ונשנה ל-CSD מוצגת באיור 1. ההליכים שתוארו לעיל כללו הכנת מתלה CSD, הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן, טפטוף אף ועיסוי חזה12. הדגמנו שקיעת קולגן והתמיינות מיופיברובלסטים לאחר 4 שבועות של הזנה סטטית12. השתמשנו בשיטת חשיפה זו לאבק כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של פיברוזיס ריאתי הנגרם על-ידי אבק פחם. תת-הקבוצות החדשות של המקרופאגים והשפעת ההתערבות של ויטמין D נמצאו באמצעות טכנולוגיית שעתוק חד-תאי13. במחקר זה, ההתקדמות של פיברוזיס ריאתי בעכברים הואצה באופן משמעותי על-ידי חשיפה ל-CSD, שגרמה נזק לסיבים אלסטיים היקפיים של הסימפונות (איור 2 ואיור 3). גושי סיליקוזיס מורכבים מקרופאגים המכילים CSD. פיברוזיס נודולרי מועשר בהרבה CSD, ומקרופאגים חיוביים ל-CD68 בולעים באופן פעיל חלקיקים אלה. CSDs אלה שהופקדו לקדם את היווצרות של מוקדים סיביים. כאמור, לאחר שנחשפו ל- CSD במשך 4 שבועות, עכברים רכשו נגעים ברורים, כגון שקיעת קולגן בגושי ריאה סיליקון ופגיעה במבנה רקמת הריאה. הייתה גם פציעה קלה של הרקמה סביב הסמפונות12. התהליך הביולוגי של עקה בחדר מיון שנגרם על-ידי CSD קשור ל-NF-κB, אשר מעורב בתגובה הדלקתית (ראו איור 4). בסך הכל, ממצאים אלה מראים כי הגישה המוצעת יכולה לדמות ביעילות התפתחות סיליקוזיס של עכברים.
איור 1: חלקיקי אבק סיליקה גבישי (CSD) מתחת לחמישה מיקרון שימשו לטפטוף באף. (A) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של CSD הראה שהחלקיקים היו בעלי צורה לא סדירה. (B) תרחיף CSD שימש להכנת מודל הסיליקוזיס של העכבר על ידי טפטוף האף. המכונה משמאל משמשת להרדמה איזופלורנית, והפאנל הימני מתאר את נקודות המפתח המובילות לפעולת הטפטוף באף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צביעה אדומה של סיריוס הראתה פיברוזיס בריאות עכברים על-ידי טפטוף אף CSD במשך חודש אחד. (A) צביעה אדומה של סיריוס בוצעה כדי למדוד שקיעת קולגן ברקמת הריאה לאחר טיפול ב-CSD או במי מלח (שמאל עליון ושמאל תחתון בשמשות). מיקרוסקופיה מקטבת חשפה שלושה סוגים שונים של סיבי קולגן (אדום, צהוב וירוק), מתוכם סיבי קולגן מסוג 1 המוצגים באדום מהווים גורם סיכון לסיליקוזיס. עם זאת, לא נמצאה פיברוזיס משמעותי בקבוצת הרכב (פאנלים ישרים ונמוכים). (B) ציון פיברוזיס (FS) הוא מדד הערכה כמותי למחצה המבוסס על צביעה אדומה של סיריוס12 השונה באופן משמעותי מהביקורת (***P < 0.0001). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צביעה אימונוהיסטוכימית של CD68 בריאה של עכבר שטופלה ב-CSD כדי לעקוב אחר תפקיד המקרופאגים ביצירת קשריות סיליקוטיות. גולם סיליקה טיפוסי מאופיין בנמק נוזלי לאחר פגוציטוזה של CSD במרכז, מוקף מקרופאגים בפריפריה (צביעת HE). בנוסף, CSD הועשר בגושים, מלווה פיברוזיס (צביעת מאסון). צביעת האימונוהיסטוכימיה של CD68 גילתה כי מקרופאגים היו נוכחים באופן נרחב ברקמת הריאה. יתר על כן, מקרופאגים אלה בלעו CSD (נראה תחת מיקרוסקופ האור המקוטב, פאנל ימני), אשר גרם לפגיעה ריאתית חמורה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי NF-κB בריאת עכבר שטופלה ב-CSD . (A) צביעה אימונוהיסטוכימית בוצעה ברקמת הריאה. ריאה של עכברים שטופלו ב-CSD בחלונית הימנית הראתה צביעת NF-κB גבוהה בהשוואה לקבוצת הרכב משמאל. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) כתם מערבי מייצג הראה שלעכברים שטופלו ב-CSD יש ביטוי מוגבר של NF-κB בריאה. ליזה טרייה של רקמת הריאה הייתה נתונה לכתם מערבי. (C) ההבדל NF-κB בין קבוצות Sil ו-Veh היה משמעותי (** P < 0.01). עוצמת הפס נמדדה באמצעות תמונה J. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים של עכברי סיליקוזיס חיוניים לחקר הפתוגנזה והטיפול בסיליקוזיס. פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת מודל של סיליקוזיס בעכברים באמצעות חשיפה חוזרת לאף. שיטה זו מאפשרת לחקור את המאפיינים הפתולוגיים של סיליקוזיס המושרה על ידי זמני חשיפה שונים. עכברים הורדמו והונשמו וקצב נשימתם נוטר. קצב הנשימה הראשוני הקצר והמהיר הואט והעמיק בהדרגה עם הזמן. ההרדמה גרמה לשרירי העכברים להירגע, מה שהוביל לנשימה עמוקה ואיפשר להם לשאוף CSD בחלון זמן של נשימה איטית ועמוקה. בתהליך זה, המפעיל מחזיק את לסת העכבר עם האגודל ומיישר את צווארו כדי למנוע מהנוזל להיכנס למערכת העיכול, שיטה של חשיפה לאבק נשמתי שאינה גורמת לכאב ואינה פולשנית. שיטה זו יכולה לענות על הצרכים האישיים של יישום חוזר ונשנה לחקר חשיפה לאבק. Kato et al. בשנת 2017 השתמשו במינון גדול יחיד (125 מ"ג / מ"ל, 40 μL) באמצעות טפטוף אורופרינגיאלי כדי למדל פיברוזיס ריאתי, ואנו מתייחסים לריכוז זה כדי לנסות לחקור את השינויים הריאתיים הנגרמים על ידי מינונים קטנים מרובים דרך חלל האף14.
ישנם מספר אתגרים הקשורים לטפטוף אף לאחר הרדמה מבחינה טכנית. בתהליך זה, המפעיל מחזיק את הלסת התחתונה של העכבר עם האגודל כדי ליישר את צווארו ולמנוע מהנוזל להיכנס למערכת העיכול. אם העכברים אינם מגיעים להרדמה עמוקה או שהמפעיל אינו מיומן ומחמיץ את חלון הזמן לנשימה עמוקה איטית, השפעת טפטוף האף והמאפיינים הפתולוגיים של המודל לא יהיו כצפוי. לכן, כדי למנוע מוות בהרדמת יתר וכישלון מודלים בתת-הרדמה, אלה שעובדים עם עכברים מורדמים איזופלורן חייבים להיות מאומנים כראוי ולשלוט במאפיינים הקריטיים של עכברים מורדמים איזופלורן לפני ביצוע טפטוף האף. יתר על כן, לחיצה על החזה של העכברים לאחר טפטוף האף, המכונה בדרך כלל עיסוי, מקדם את הנסיעה של CSD כדי להגיע הסמפונות הסופי ואפילו את קירות alveolar של הריאות. עכברים שהורדמו לרמה עמוקה נטו לחנק כאשר קיבלו מינון גבוה של טפטופים מהאף. עם זאת, אם החזה שלהם נדחס במהירות, שיעור ההישרדות גדל. ואחרון חביב, יצירת מודלים של סיליקוזיס מחייבת עכברים עם בסיס פיזי איתן, וכמה מחקרים הראו כי עכברים מעל גיל 10-12 שבועות הם בעלי סבילות ירודה ושיעור תמותה מוגבר לאחר חשיפה חוזרת ונשנית ל- CSD. למרות יתרונותיו, למודל זה יש מספר חסרונות. חסרון אחד הוא שעכבר אינו שואף חלקיקי אבק ישירות דרך זרימת האוויר. כדי לטפל בבעיה זו, הגבלנו את כמות תרחיף CSD בשאיפה בנשימה אחת ואת התדירות של מתן חוזר של CSD. בנוסף, הקמנו קבוצות רכב. הנתונים מגלים כי שאיפת כמות קטנה של נוזל משבשת זמנית בלבד את האוורור, מה שלא יפגע בריאות העכברים12. עכברי הבקרה ברכב יספגו במהירות את נוזל המלח הנשאף מבלי להשפיע על תפקוד הריאות של העכברים, משקל גופם או פעילותם הבסיסית. להיפך, חשיפה חוזרת ונשנית ל- CSD באמצעות שאיפת אף יכולה ליצור את המודל הדינמי הרצוי של סיליקוזיס בעכברים12. מכיוון שתדרי חשיפה שונים משפיעים על תהליך הפיברוזיס במודלים עם חשיפות חוזרות, אין לנו נקודת זמן ברורה. בדרך כלל, לחשיפה חד פעמית של אבק סיליקה, יום 7 הוא עדיין בשלבים המוקדמים של הסיליקוזיס. ימים 7-14 מתאימים לשלב הפעילות הדלקתית, ימים 14-28 מתאימים לשלב טרנספורמציית הפיברוזיס, והזמן שלאחר יום 28 מתאים לשלב היווצרות הפיברוזיס12,15. עם זאת, הפתולוגיה בנקודות זמן אלה יכולה להשתנות בהתאם למינון.
לשיטת טפטוף האף יש מספר יתרונות על פני טפטופים אנדוטרכאליים מסורתיים או גישות טרכאוסטומיה שנחשפו בניתוח16,17, כגון הפחתת זיהומים הקשורים לטרכאוטומיה וטיפול לאחר הניתוח. גישה זו יכולה גם לספק את הדרישה לחשיפה חוזרת ל- CSD במהלך ניסוי אחד ואינה דורשת ציוד יקר. בנוסף, שיטת טפטוף האף היא ייצוג מציאותי יותר של חשיפה לאבק, כמו חלקיקים קטנים להיכנס לריאות מן דרכי הנשימה העליונות לנסוע ברונכיולים מסוף alveoli. מכיוון שאנו משתמשים במספר מנות קטנות של טפטופי סיליקה, מנת אבק הסיליקה יכולה להיכנס לריאה במידה המקסימלית ולעורר את האורגניזם ללא הרף. לפיכך, גישת מידול זו פותחה כדי לדמות את החשיפה החוזרת ונשנית של עובדים למדעי המחשב בסביבת העבודה שלהם ולחקור את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס.
יצירת מודלים עכבריים של סיליקוזיס באמצעות חשיפה לאף ל- CSD יכולה להיות מיושמת על חשיפות חוזרות. לכן, מודל זה של בעלי חיים יכול לשמש לחקר ההשפעות של תדירות החשיפה והמינון על התקדמות סיליקוזיס והתכונות והמנגנונים הפתולוגיים הדינמיים של סיליקוזיס. יתר על כן, חשיפה משולבת עם חומרים אחרים או תרופות היא גם ריאלית מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית החדשנות הסינרגית האוניברסיטאית של מחוז אנחווי (GXXT-2021-077) וקרן החדשנות לבוגרי אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
