Summary
Ce protocole décrit une méthode permettant d’établir un modèle murin de silicose par exposition répétée à des suspensions de silice par écoulement nasal. Ce modèle peut imiter de manière efficace, pratique et flexible le processus pathologique de la silicose humaine avec une répétabilité et une économie élevées.
Abstract
La silicose peut être causée par l’exposition à des poussières de silice cristalline respiratoire (CSD) dans un environnement industriel. La physiopathologie, le dépistage et le traitement de la silicose chez l’homme ont tous été largement étudiés à l’aide du modèle de silicose chez la souris. En faisant inhaler à plusieurs reprises de la CSD dans les poumons des souris, les souris peuvent imiter les symptômes cliniques de la silicose humaine. Cette méthodologie est pratique et efficace en termes de temps et de rendement et ne provoque pas de lésions mécaniques des voies respiratoires supérieures dues à une intervention chirurgicale. De plus, ce modèle peut imiter avec succès le processus de transformation aiguë/chronique de la silicose. Les principales procédures ont été les suivantes. La poudre de CSD stérilisée de 1 à 5 μm a été entièrement broyée, suspendue dans une solution saline et dispersée dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 minutes. Les souris sous anesthésie induite par l’isoflurane sont passées d’une respiration rapide et superficielle à une aspiration profonde et lente pendant environ 2 s. La souris a été placée dans la paume d’une main, et le bout du pouce a doucement touché le bord de la lèvre de la mâchoire de la souris pour redresser les voies respiratoires. Après chaque expiration, les souris ont respiré la suspension de silice goutte à goutte par une narine, complétant le processus en 4 à 8 secondes. Une fois que la respiration des souris s’est stabilisée, leur poitrine a été caressée et caressée pour empêcher le CSD inhalé d’être craché. Les souris ont ensuite été renvoyées dans la cage. En conclusion, ce modèle permet de quantifier la CSD le long du passage physiologique typique de minuscules particules dans le poumon, des voies respiratoires supérieures aux bronchioles terminales et aux alvéoles. Il peut également reproduire l’exposition récurrente des employés en raison du travail. Le modèle peut être réalisé par une seule personne et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Il simule de manière pratique et efficace les caractéristiques de la maladie de la silicose humaine avec une grande répétabilité.
Introduction
Les travailleurs sont inévitablement exposés à des poussières de silice cristalline irrégulières, qui peuvent être inhalées et sont plus toxiques dans de nombreux contextes professionnels, notamment dans les mines, la poterie, le verre, le traitement du quartz et le béton 1,2. Une affection chronique d’inhalation de poussière connue sous le nom de silicose provoque une fibrose pulmonaire progressive3. Selon les données épidémiologiques, l’incidence de la silicose a diminué à l’échelle mondiale au cours des dernières décennies, mais ces dernières années, elle a augmenté et touche les personnes plus jeunes 4,5,6. Le mécanisme sous-jacent de la silicose représente un défi important pour la recherche scientifique en raison de son apparition insidieuse et de sa période d’incubation prolongée. On ne sait toujours pas comment la silicose se développe. De plus, aucun médicament actuel ne peut arrêter la progression de la silicose et inverser la fibrose pulmonaire.
Les modèles murins actuels pour la silicose impliquent l’ingestion trachéale d’une suspension mixte de CSD. Par exemple, l’administration de CSD dans les poumons en adoptant le traumatisme de la trachée cervicale après anesthésie n’est pas conforme à l’exposition humaine répétée à la poussière de colorant7. L’impact de l’exposition aux poussières ambiantes sur les individus peut être étudié en les exposant à des CSD sous forme d’aérosols, ce qui reflète plus précisément les concentrations environnementales de cette substance toxique8. Cependant, la CSD environnementale ne peut pas simplement être inhalée directement dans les poumons en raison de la structure physiologique unique du nez de la souris9. De plus, l’équipement associé à cette technologie est coûteux, ce qui a amené les chercheurs à réévaluer le modèle de silicosede souris 10. En inhalant une suspension de CSD par goutte à goutte nasale cinq fois en 2 semaines, il a été possible de construire un modèle dynamique de la silicose. Ce modèle est cohérent et sûr tout en étant facile à utiliser. Il est important de noter que cette étude permet l’inhalation répétée de CSD chez la souris. On s’attend à ce que le modèle de silicose de souris créé par cette procédure soit plus avantageux pour les besoins de la recherche.
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Protocol
Toutes les procédures ont suivi les directives du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (publication du NIH n° 8023, révisée en 1978) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui.
1. Gérer et nourrir les souris
- Assignez 20 souris mâles C57BL/6 en bonne santé aux groupes expérimentaux ou véhicules dans un rapport de 1 :1. Acclimater les souris au nouvel environnement pendant 1 semaine.
- Fournir un temps d’éclairage constant de 12 h par jour. Utilisez un interrupteur de contrôle de l’heure pour un chronométrage précis.
2. Préparation de la suspension de la CDD
- Au moins 1 jour avant l’écoulement nasal, broyez la silice dans un mortier d’agate pendant 0,5 h.
- Observez la taille et la forme des particules de cristal. Prenez des photos représentatives à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB).
- Utilisez du ruban adhésif conducteur pour lier les particules afin de préparer l’échantillon pour le MEB. Utilisez un sèche-cheveux pour souffler doucement les particules de silicium qui ne sont pas fermement liées.
- Évacuez la chambre d’échantillonnage, allumez la haute pression et capturez l’image.
REMARQUE : La distance de travail (WD) entre la lentille et l’échantillon est de 5,9 mm, la tension d’accélération est de 2,0 kV et le grossissement (Mag) est de 100 000x, à l’aide du détecteur SignalA. Les particules sont dispersées avec une cristallisation irrégulière et environ 80 % ont un diamètre de 1 à 5 μm (Figure 1A).
- Préparez une suspension de CSD stérile à 20 mg/mL. Diluez la CSD à l’aide d’une solution saline stérile et mélangez-la avec un agitateur à ultrasons (40 kHz, 80 W) à température ambiante (RT) pendant 30 min.
- Remuez et mélangez soigneusement la suspension CSD sur un mélangeur vortex pendant 10 s avant d’administrer les gouttes nasales.
3. Administrer des gouttes nasales à la souris
- Anesthésier rapidement une souris avec de l’isoflurane à 2 % à une dose de 3,6 mL/h dans un appareil d’anesthésie (Figure 1B, panneau de gauche).
REMARQUE : L’anesthésie doit être effectuée dans une hotte pour éviter l’inhalation de l’anesthésique par le technicien. Assurez-vous que la profondeur adéquate de l’anesthésie en observant le passage d’une respiration rapide et irrégulière à un état lent et stable chez les souris. - Verser 50 μL de CSD par voie nasale dans un délai de 4 à 8 s (figure 1B, à droite).
- Pour l’écoulement nasal, placez la tête de la souris sur l’articulation métacarpo-phalangienne du chercheur avec le bout de l’index.
- Gardez la souris en position couchée, avec quatre doigts légèrement fléchis et le bout du pouce touchant légèrement la lèvre inférieure de la souris pour redresser les voies respiratoires. Évitez de toucher le pharynx pour provoquer le réflexe nauséeux.
- Aspirer 50 μl de liquide à l’aide d’une pipette de 200 μl. Déposez le liquide dans la cavité nasale de la souris en trois à quatre doses fractionnées en fonction de la fréquence respiratoire de la souris. Chaque instillation doit être constituée de 15 à 20 μl de liquide. Administrez les gouttes une fois tous les 3 jours, 5 fois dans les 12 jours. Traitez la souris témoin avec une quantité égale de solution saline.
- Massez doucement la zone du cœur de la souris 5 à 10 fois pendant 5 s.
- Tenez le corps de la souris avec la paume, pincez la peau de la nuque avec le pouce et l’index et fixez les membres postérieurs de la souris avec les autres doigts. Ensuite, appuyez doucement sur la zone de battement du cœur de la souris avec l’index de l’autre main 5 à 10 fois sur une période de 5 s.
- Lorsque la respiration de la souris s’est stabilisée, placez-la dans une cage de récupération avec un coussin chauffant et observez-la jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie, puis remettez-la dans sa cage d’origine. Sacrifiez la souris à 31 jours.
4. Collecte des tissus pulmonaires et préparation d’une section de paraffine
- Injecter 0,18 mL d’hydrate de chloral à 10 % par voie intrapéritonéale, en veillant à ce que les souris ne répondent pas à la stimulation des orteils ou de la queue (effectuée à l’aide de la pince dentée). Ensuite, passez à l’étape suivante.
- Fixez les membres de la souris sur une planche de test en mousse et vaporisez de l’alcool à 75% pour humidifier la fourrure. Retirez la plupart des côtes thoraciques sur la ligne médiane de la clavicule et ouvrez la cavité thoracique des souris pour exposer le cœur et les poumons.
- Ouvrir immédiatement l’oreillette droite à l’aide de ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et injecter lentement 20 mL de tampon phosphate (PBS) à partir de l’extrémité du cœur au niveau du battement auriculaire gauche avec la plus grande amplitude pour permettre au sang total de circuler. Ensuite, retirez le lobe inférieur du poumon droit et conservez-le à -80 °C pour l’analyse Western Blot.
- Continuez à perfuser 10 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % au même endroit après l’injection de PBS. Prélever le poumon restant et conserver l’échantillon dans 30 mL de PFA à 4 % pour analyse pathologique.
- Après 72 h de fixation, enfoncer les échantillons dans de la paraffine.
- Déshydrater les tissus par une série graduée de dilutions d’éthanol (EtOH) dans de l’eau déminéralisée (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) pendant 1 h chacune à RT. Nettoyer l’échantillon en deux lavages de xylène pendant 1 h chacun.
- Infiltrer les échantillons avec la cire de paraffine fondue en chauffant à 50 °C pendant 2 h. Répétez ce processus dans un autre cylindre. Refroidir les moules en cire avec des moules en papier pendant 1 h pour qu’ils durcissent.
- Une fois que la cire a durci et que le tissu a été incrusté, utilisez une machine à sectionner la paraffine pour trancher le tissu à 5 μm. Les étapes précises de la coupe et du montage de la glissière ont été décrites précédemment11.
REMARQUE : Une perfusion tissulaire suffisante est indiquée par le développement de contractions musculaires et d’une torsion de la queue en forme de « S » ou de flexion après avoir reçu 10 mL de PFA à 4 %.
5. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)
- Chauffer les tissus enrobés de paraffine sur une plaque chauffante (60 °C) pendant plus de 4 h pour permettre l’adhérence aux lames et une meilleure déparaffination.
- Dépatisser et hydrater les sections de paraffine. Faites tremper les lames avec des échantillons de xylène 2x pendant 30 min à chaque fois. Ensuite, plongez-les dans de l’éthanol anhydre, puis de l’alcool à 95 %, 85 %, 75 % et de l’eau déminéralisée pendant 5 minutes, respectivement.
- Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Teindre les tissus dans un seau de coloration à l’hématoxyline pendant 10 min. Rincez-les à l’eau courante pendant 5 min. Ensuite, trempez les lames dans le seau de coloration à l’éosine pendant 10 s.
- Déshydrater les échantillons dans de l’éthanol à 75 %, 85 %, 95 % et anhydre pendant 5 min chacun. Nettoyez les sections de tissu en les immergeant dans du xylène pendant 5 min. Sceller la section avec environ 60 μL de gouttes de résine neutre. Placez la glissière de couvercle sur la section et abaissez-la soigneusement pour éviter les bulles d’air.
6. Effectuer la coloration Masson
- Dépatisser et hydrater les échantillons de paraffine, comme mentionné à l’étape 5.2. Ensuite, colorez les noyaux cellulaires avec 50% d’hématoxyline de Weigert pendant 10 min. Trempez le tissu dans une liquéfaction acide à l’éthanol pendant 10 s et rincez doucement les lames de tissu à l’eau courante pour le bleuissement des noyaux.
REMARQUE : Préparez la solution de coloration à l’hématoxyline de Weigert immédiatement avant utilisation. - Colorer les échantillons avec des gouttes de solution colorante rouge Lichun (40 μL pour chaque lame de tissu) pendant 7 min et les laver avec une solution de travail acide faible (acide chlorhydrique à 30 %) pendant 1 min pour éliminer le colorant rouge Lichun non lié.
- Trempez-les dans de l’alcool à 95 % pendant 20 s et déshydratez-les 2 fois avec de l’éthanol anhydre pendant 1 à 3 s chacun. Après cela, nettoyez les tissus avec du xylène et scellez-les avec 60 μL de gouttes de résine neutre, comme mentionné à l’étape 5.4.
7. Effectuer la coloration rouge Sirius
- Dépatisser et hydrater les sections de paraffine comme mentionné à l’étape 5.2.
- Infiltrer les sections pendant 1 h avec la solution de coloration rouge Sirius.
- Colorer les noyaux cellulaires des échantillons pendant 8 à 10 minutes avec la solution de coloration à l’hématoxyline Mayer. Rincez-les délicatement à l’eau courante pendant 10 min. Ensuite, déshydratez et nettoyez les lames de tissu. Scellez-les comme indiqué à l’étape 5.4.
8. Effectuer l’immunohistochimie
- Dépatisser et hydrater les échantillons de paraffine comme décrit à l’étape 5.2.
- Infiltrer les échantillons avec une solution de prélèvement d’antigène EDTA à 3 mg/mL d’environ 30 mL. Faire bouillir pendant 20-30 min. Lavez les tissus avec de l’eau déminéralisée, puis incubez-les dans une solution tamponnée au phosphate contenant 0,5 % de Tween-20 (PBST) pendant 5 min.
- Faire tremper les échantillons pendant 15 min avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pour inactiver la peroxydase endogène dans les échantillons. Lavez-les 3 fois avec du PBST pendant 5 min à chaque fois.
REMARQUE : La solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % doit être fraîche dans un environnement à l’abri de la lumière. - Perméabiliser la membrane des échantillons pendant 15 min avec une solution de Triton-100 à 0,3 %. Ensuite, bloquez avec 30 à 40 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % pendant 1 h.
- Retirez la solution bloquante. Ajouter les anticorps primaires dilués NF-κB (dilution 1 :200) et CD68 (dilution 1 :1 000) et incuber les échantillons pendant une nuit à 2-8 °C dans une boîte humide IHC pour lames de microscope afin d’éviter l’évaporation et la lumière.
- Le lendemain, transférez-les à RT pendant 1 h. Ensuite, lavez-les avec PBST 3x pendant 5 min chacun.
- Incuber les échantillons pendant 1 h dans des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort de lapin (rapport de dilution de 1 :500) à RT et les laver avec PBST 3x pendant 5 min chacun.
REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires ont été dilués avec 5 % de BSA. - Incuber les échantillons avec le substrat 3,3'-diaminobenzidine (DAB) correspondant à l’anticorps marqué par l’enzyme pendant 5 à 20 minutes. Arrêtez la réaction avec de l’eau déminéralisée lorsque l’intensité optimale de coloration est atteinte.
REMARQUE : La solution DAB doit être préparée fraîche et à l’abri de la lumière. La réaction de développement de la couleur doit être observée en temps réel au microscope pour déterminer quand arrêter la coloration. Les spécimens positifs présentent une coloration intense, tandis que les spécimens négatifs ne développent pas de couleur. - Contre-colorer les échantillons pendant 30 s avec de l’hématoxyline de Weigert. Ensuite, rincez les mouchoirs sous l’eau courante pendant 1 min. Ensuite, déshydratez, nettoyez et scellez les lames de tissu, comme mentionné à l’étape 5.4.
9. Réalisation d’une analyse par transfert Western
- Lyser les tissus pulmonaires pour en extraire les protéines. Ajouter 200 μL de solution de travail RIPA à 20 mg de tissu pulmonaire.
- Homogénéiser le tissu sur de la glace pendant 5 min à l’aide d’un broyeur électrique portatif et incuber pendant 1 h sur de la glace en agitant doucement. Ensuite, centrifugez l’homogénat à 4 °C pendant 15 min à 14 800 x g.
- Prélevez le surnageant et déterminez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA. Préparez la solution de stockage des protéines avec RIPA à 6 μg/μL de protéines. Ajouter 20 μL de tampon de charge 5x aux 80 μL de lysat de protéines. Perturber la structure de la protéine secondaire en chauffant les tubes de microcentrifugation contenant des protéines dans un bain métallique (100 °C) pendant 20 min.
- Après refroidissement, aliquotez 100 μL de la solution de stockage des protéines dans chaque tube et conservez les échantillons dans un réfrigérateur à -80 °C. Diluer la concentration de protéines à 2–3 μg/μL avec 1x tampon de charge avant l’électrophorèse.
REMARQUE : Le processus d’extraction des protéines doit être effectué sur de la glace. Pour la solution de fonctionnement RIPA, ajouter 1 μL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à 100 mM à 99 μL de RIPA pour inhiber la dégradation des protéines phosphorylées. Préparez 1x tampon de chargement en diluant 5x tampon de chargement avec RIPA dans un rapport de 1 :4. - Ajoutez 20 μg d’échantillons dans chaque puits et faites couler le gel. Pour les gels concentrés à 5 %, utilisez 80 V pendant 20 min pour que les protéines soient électrophorisées à partir du même point de départ. Pour les gels isolés à 10 %, faire fonctionner à 100 V pendant 1 h pour permettre de séparer au maximum les protéines de différents poids moléculaires.
- Pré-activer la membrane PVDF avec du méthanol pendant 20 s. Transférez les protéines sur la membrane PVDF en utilisant la méthode de transfert humide avec un courant de 400 mA pendant 1 à 2 h.
REMARQUE : Assurez-vous que le réservoir d’électrophorèse et le réservoir d’électrotransfert sont horizontaux. Refroidissez tout le réservoir avec de la glace, car le processus de transfert de membrane génère beaucoup de chaleur. - Lavez la membrane avec la solution TBST pendant 5 minutes à chaque fois, 5 fois. Ensuite, bloquez avec du lait écrémé 5 % BSA ou 5 % pendant 1 h. Diluer les anticorps primaires NF-κB (1 :1 000) et β-actine (1 :1 000) avec 5 % de BSA. Plongez les bandelettes dans la solution d’anticorps et agitez-les doucement pendant la nuit à une température comprise entre 2 et 8 °C.
- Lavez les bandelettes avec du PBST. Ensuite, diluez l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) de chèvre (1 :10 000) et incubez-les dans l’anticorps secondaire dilué pendant 1 h à RT en agitant doucement.
- Préparez un révélateur de chimiluminescence améliorée (ECL), déposez-le sur la bandelette et incubez pendant 3 minutes.
- Exposez la bandelette à un imageur de gel pendant 20 s. Mesurez la valeur de gris de la bandelette pour évaluer le niveau de protéines à l’aide du logiciel système. Utiliser β-actine comme contrôle interne.
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Representative Results
La pathogenèse potentielle de la silicose chez la souris a été étudiée à l’aide de la méthode proposée. Nous avons constaté que le poids corporel des souris du groupe expérimental diminuait significativement par rapport au groupe témoin et que le poids corporel se rétablissait lentement après l’arrêt de l’exposition. En raison de la dose optimisée utilisée ici, aucune mortalité n’a été observée chez les souris exposées à la silice dans cette expérience. La feuille de route technique de l’écoulement nasal répété vers la CSD est illustrée à la figure 1. Les procédures décrites précédemment comprenaient la préparation de la suspension CSD, l’anesthésie induite par l’isoflurane, l’écoulement nasal et le massage thoracique12. Nous avons démontré le dépôt de collagène et la différenciation des myofibroblastes après 4 semaines d’alimentation statique12. Nous avons utilisé cette méthode d’exposition aux poussières pour étudier le mécanisme sous-jacent de la fibrose pulmonaire causée par la poussière de charbon. Les nouveaux sous-ensembles de macrophages et l’effet d’intervention de la vitamine D ont été découverts grâce à la technologie du transcriptome unicellulaire13. Dans cette étude, la progression de la fibrose pulmonaire chez la souris a été considérablement accélérée par l’exposition à la CSD, qui a causé des dommages aux fibres élastiques périphériques bronchiques (Figure 2 et Figure 3). Les nodules de silicose sont composés de macrophages qui contiennent de la CSD. La fibrose nodulaire est enrichie de nombreux CSD, et les macrophages CD68-positifs engloutissent activement ces particules. Ces CSD déposées favorisent la formation de foyers fibreux. Comme mentionné précédemment, après avoir été exposées à la CSD pendant 4 semaines, les souris ont acquis des lésions évidentes, telles que le dépôt de collagène dans les nodules pulmonaires en silicium et des dommages à la structure du tissu pulmonaire. Il y avait aussi une lésion modeste du tissu entourant les bronches12. Le processus biologique du stress RE causé par la CSD est lié à NF-κB, qui est impliqué dans la réponse inflammatoire ( voir Figure 4). Dans l’ensemble, ces résultats montrent que l’approche proposée peut simuler efficacement le développement de la silicose chez la souris.
Figure 1 : Des particules de poussière de silice cristalline (CSD) inférieures à cinq microns ont été utilisées pour l’écoulement nasal. (A) La microscopie électronique à balayage (MEB) de CSD a montré que les particules étaient de forme irrégulière. (B) La suspension de CSD a été utilisée pour préparer le modèle de silicose de souris par goutte à goutte nasale. L’appareil de gauche est utilisé pour l’anesthésie à l’isoflurane, et le panneau de droite décrit les points clés qui conduisent au fonctionnement de l’écoulement nasal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La coloration au rouge Sirius a montré une fibrose dans les poumons de souris par écoulement nasal CSD pendant 1 mois. (A) La coloration au rouge Sirius a été réalisée pour mesurer le dépôt de collagène dans le tissu pulmonaire après un traitement au CSD ou au sérum physiologique (en haut à gauche et en bas à gauche dans les vitres). La microscopie polarisante a révélé trois types différents de fibres de collagène (rouge, jaune et verte), dont les fibres de collagène de type 1 indiquées en rouge sont un facteur de risque de silicose. Cependant, aucune fibrose significative n’a été retrouvée dans le groupe de véhicules (panneaux droit et bas). (B) Le score de fibrose (FS) est un indice d’évaluation semi-quantitatif basé sur la coloration au rouge Sirius12 qui diffère significativement du témoin (***P < 0,0001). Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Marquage immunohistochimique de CD68 dans le poumon d’une souris traitée par CSD pour surveiller le rôle des macrophages dans la formation d’un nodule silicotique. Un nodule de silice typique est caractérisé par une nécrose liquéfiée après phagocytose de CSD au centre, entouré de macrophages en périphérie (coloration HE). De plus, la CSD a été enrichie dans les nodules, accompagnée d’une fibrose (coloration de Masson). La coloration immunohistochimique de CD68 a révélé que les macrophages étaient largement présents dans les tissus pulmonaires. De plus, ces macrophages avaient ingéré du CSD (vu sous la microscopie à lumière polarisée, panneau de droite), ce qui a causé de graves lésions pulmonaires. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’expression de NF-κB dans le poumon de souris traité par CSD. (A) Une coloration immunohistochimique a été réalisée sur le tissu pulmonaire. Le poumon des souris traitées au CSD sur le volet de droite présentait une coloration NF-κB élevée par rapport au groupe de véhicules sur la gauche. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Le western blot représentatif a montré que les souris traitées par CSD ont une expression accrue de NF-κB dans le poumon. La lyse des tissus pulmonaires frais a été soumise à un transfert Western. (C) La différence NF-κB entre les groupes Sil et Veh était significative (** P < 0,01). L’intensité de la bande a été mesurée à l’aide de l’image J. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les modèles murins de silicose sont cruciaux pour l’étude de la pathogenèse et du traitement de la silicose. Ce protocole décrit une méthode de préparation d’un modèle de silicose chez la souris par exposition nasale répétée. Cette méthode permet d’étudier les caractéristiques pathologiques de la silicose induite par différents temps d’exposition. Les souris ont été anesthésiées sous respirateur et leur fréquence respiratoire a été surveillée. Le rythme respiratoire initial court et rapide a progressivement ralenti et s’est approfondi au fil du temps. L’anesthésie a provoqué le relâchement des muscles des souris, ce qui a conduit à une respiration profonde et leur a permis d’inhaler du CSD pendant une fenêtre de temps de respiration lente et profonde. Au cours de ce processus, l’opérateur tient la mandibule de la souris avec son pouce et redresse son cou pour empêcher le liquide de pénétrer dans le tube digestif, une méthode d’exposition aux poussières respirables qui ne provoque pas de douleur et qui est non invasive. Cette méthode peut répondre aux besoins individuels d’une mise en œuvre répétée pour étudier l’exposition aux poussières. Kato et al. en 2017 ont utilisé une seule dose importante (125 mg/mL, 40 μL) via un goutte-à-goutte oropharyngé pour modéliser la fibrose pulmonaire, et nous nous référons à cette concentration pour essayer d’explorer les changements pulmonaires induits par de multiples petites doses à travers la cavité nasale14.
D’un point de vue technique, les écoulements nasaux post-anesthésie présentent plusieurs défis. Au cours de ce processus, l’opérateur tient la mandibule de la souris avec son pouce pour redresser son cou et empêcher le liquide de pénétrer dans le tube digestif. Si les souris n’obtiennent pas d’anesthésie profonde ou si l’opérateur n’est pas qualifié et manque la fenêtre de temps pour une respiration lente et profonde, l’effet de l’écoulement nasal et les caractéristiques pathologiques du modèle ne seront pas ceux attendus. Par conséquent, pour éviter la mort et l’échec de la modélisation sous anesthésie, les personnes qui travaillent avec des souris anesthésiées à l’isoflurane doivent être adéquatement formées et maîtriser les caractéristiques critiques des souris anesthésiées à l’isoflurane avant d’effectuer le goutte-à-goutte nasal. De plus, le fait d’appuyer sur la poitrine des souris après l’écoulement nasal, communément appelé massage, favorise le déplacement de la CSD pour atteindre les bronches terminales et même les parois alvéolaires des poumons. Les souris anesthésiées à un niveau profond étaient sujettes à l’asphyxie lorsqu’elles recevaient une forte dose de gouttes nasales. Cependant, si leur poitrine était rapidement comprimée, le taux de survie augmentait. Enfin, la création de modèles de silicose nécessite des souris ayant une base physique solide, et certaines études ont montré que les souris âgées de plus de 10 à 12 semaines ont une faible tolérance et un taux de mortalité accru après une exposition répétée à la CSD. Malgré ses avantages, ce modèle présente plusieurs inconvénients. Un inconvénient est que la souris n’inhale pas directement les particules de poussière par le biais du flux d’air. Pour remédier à ce problème, nous avons limité la quantité de suspension de CSD inhalée en une seule respiration et la fréquence d’administration répétée de CSD. De plus, nous avons mis en place des groupes de véhicules. Les données révèlent que l’inhalation d’une petite quantité de liquide ne perturbe que temporairement la ventilation, ce qui n’endommagera pas les poumons des souris12. Les souris témoins du véhicule absorberont rapidement le liquide salin inhalé sans affecter la fonction pulmonaire, le poids corporel ou l’activité basale des souris. Au contraire, une exposition répétée à la CSD par inhalation nasale peut créer le modèle dynamique souhaité de la silicose chez la souris12. Étant donné que différentes fréquences d’exposition affectent le processus de fibrose dans les modèles avec des expositions répétées, nous n’avons pas de point temporel clair. Habituellement, pour une exposition unique à la poussière de silice, le jour 7 est encore dans les premiers stades de la silicose. Les jours 7 à 14 correspondent au stade de l’activité inflammatoire, les jours 14 à 28 correspondent au stade de transformation de la fibrose et le temps après le jour 28 correspond au stade de formation de la fibrose12,15. Cependant, la pathologie à ces moments peut varier en fonction de la dose.
La méthode de goutte à goutte nasale présente plusieurs avantages par rapport aux gouttes endotrachéales traditionnelles ou aux approches de trachéotomie exposées chirurgicalement16,17, tels que la réduction des infections liées à la trachéotomie et les soins postopératoires. Cette approche peut également satisfaire à l’exigence d’une exposition répétée aux CSD au cours d’une expérience et ne nécessite pas d’équipement coûteux. De plus, la méthode de goutte à goutte nasale est une représentation plus réaliste de l’exposition à la poussière, car de petites particules pénètrent dans les poumons à partir des voies respiratoires supérieures et se déplacent vers les bronchioles et les alvéoles terminales. Étant donné que nous utilisons plusieurs petites doses de gouttes de silice, la dose de poussière de silice peut pénétrer dans les poumons au maximum et stimuler continuellement l’organisme. Ainsi, cette approche de modélisation est développée pour simuler l’exposition récurrente des salariés aux CS dans leur environnement de travail et pour explorer le processus pathologique de la silicose.
La création de modèles murins de silicose par exposition nasale à la CSD peut être appliquée à des expositions répétées. Par conséquent, ce modèle animal peut être utilisé pour étudier les effets de la fréquence d’exposition et de la posologie sur la progression de la silicose et les caractéristiques pathologiques dynamiques et les mécanismes de la silicose. De plus, une exposition combinée avec d’autres substances ou médicaments est également très possible.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le programme d’innovation en synergie universitaire de la province d’Anhui (GXXT-2021-077) et le Fonds d’innovation pour les diplômés de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
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- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
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- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
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