Summary
Denne protokol beskriver en metode til etablering af en musemodel af silikose gennem gentagen eksponering for silicasuspensioner via et næsedrop. Denne model kan effektivt, bekvemt og fleksibelt efterligne den patologiske proces af human silikose med høj repeterbarhed og økonomi.
Abstract
Silikose kan skyldes udsættelse for respiratorisk krystallinsk silicastøv (CSD) i et industrielt miljø. Patofysiologi, screening og behandling af silikose hos mennesker er alle blevet grundigt undersøgt ved hjælp af musesilikosemodellen. Ved gentagne gange at få mus til at inhalere CSD i lungerne kan musene efterligne de kliniske symptomer på human silikose. Denne metode er praktisk og effektiv med hensyn til tid og output og forårsager ikke mekanisk skade på det øvre luftveje på grund af kirurgi. Desuden kan denne model med succes efterligne akut/kronisk transformationsproces af silikose. De vigtigste procedurer var følgende: Det steriliserede 1-5 μm CSD-pulver blev fuldt malet, suspenderet i saltvand og dispergeret i et ultralydsvandbad i 30 minutter. Mus under isofluran-induceret anæstesi skiftede fra lav hurtig vejrtrækning til dyb, langsom aspiration i ca. 2 s. Musen blev placeret i håndfladen, og tommelfingerspidsen rørte forsigtigt læbekanten af musens kæbe for at rette luftvejene. Efter hver udånding indåndede musene silicasuspensionen dråbe for dråbe gennem et næsebor og afsluttede processen inden for 4-8 s. Efter at musenes vejrtrækning var stabiliseret, blev deres bryst aet og kærtegnet for at forhindre, at den inhalerede CSD blev hostet op. Musene blev derefter returneret til buret. Afslutningsvis kan denne model kvantificere CSD langs den typiske fysiologiske passage af små partikler ind i lungen, fra det øvre luftveje til de terminale bronchioler og alveoler. Det kan også replikere medarbejdernes tilbagevendende eksponering på grund af arbejde. Modellen kan udføres af en person og behøver ikke dyrt udstyr. Det simulerer bekvemt og effektivt sygdomsegenskaberne ved human silikose med høj repeterbarhed.
Introduction
Arbejdstagere udsættes uundgåeligt for uregelmæssigt krystallinsk silikatstøv (CSD), som kan indåndes og er mere giftigt i mange erhvervsmæssige sammenhænge, herunder minedrift, keramik, glas, kvartsforarbejdning og beton 1,2. En kronisk støvindåndingstilstand kendt som silikose forårsager progressiv lungefibrose3. Ifølge epidemiologiske data har forekomsten af silikose været faldende globalt i løbet af de sidste par årtier, men i de senere år har den været stigende og påvirker yngre mennesker 4,5,6. Den underliggende mekanisme for silikose udgør en betydelig udfordring for videnskabelig forskning på grund af dens lumske begyndelse og langvarige inkubationstid. Det er stadig ukendt, hvordan silikose udvikler sig. Desuden kan ingen nuværende medicin stoppe udviklingen af silikose og omvendt lungefibrose.
De nuværende musemodeller for silikose involverer trakealindtagelse af en blandet suspension af CSD. For eksempel overholder administration af CSD i lungerne ved at vedtage cervikal luftrørstraumet efter anæstesi ikke gentagen menneskelig eksponering for farvestøv7. Virkningerne af eksponering for omgivende støv for enkeltpersoner kan undersøges ved at udsætte dem for CSD i form af aerosoler, som mere nøjagtigt afspejler miljøkoncentrationerne af dette giftige stof8. Imidlertid kan miljø-CSD ikke bare inhaleres direkte i lungerne på grund af den unikke fysiologiske struktur af musenæsen9. Desuden er udstyret forbundet med denne teknologi dyrt, hvilket har fået forskere til at revurdere mussilikosemodellenmodel 10. Ved at inhalere CSD-suspension gennem et næsedrop fem gange inden for 2 uger var det muligt at opbygge en dynamisk model af silikose. Denne model er konsistent og sikker, samtidig med at den er nem at bruge. Det er vigtigt at bemærke, at denne undersøgelse giver mulighed for gentagen indånding af CSD hos mus. Den musesilikosemodel, der oprettes gennem denne procedure, forventes at være mere gavnlig for forskningskravene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer fulgte retningslinjerne i National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publikation nr. 8023, revideret 1978) og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Håndtering og fodring af mus
- Tildel 20 raske C57BL/6 hanmus til forsøgs- eller vehikelgrupperne i forholdet 1:1. Akklimatisere musene til det nye miljø i 1 uge.
- Giv en konstant lystid på 12 timer om dagen. Brug en tidskontrolkontakt til præcis timing.
2. Forberedelse af CSD-suspensionen
- Mindst 1 dag før næsedråber slibes silica i en agakmørtel i 0,5 timer.
- Overhold krystalpartiklernes størrelse og form. Tag repræsentative fotografier ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM).
- Brug ledende tape til at binde partiklerne for at forberede prøven til SEM. Brug en hårtørrer til forsigtigt at blæse siliciumpartiklerne væk, der ikke er fast bundet.
- Evakuer prøvekammeret, tænd for højtrykket, og tag billedet.
BEMÆRK: Arbejdsafstanden (WD) mellem objektivet og prøven er 5,9 mm, accelerationsspændingen er 2,0 kV, og forstørrelsen (Mag) er 100.000x ved hjælp af SignalA-detektoren. Partiklerne dispergeres med uregelmæssig krystallisation, og ca. 80% har en diameter på 1-5 μm (figur 1A).
- Lav en 20 mg/ml steril CSD-suspension. Fortynd CSD ved hjælp af sterilt saltvand og bland det med en ultralydsryster (40 kHz, 80 W) ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter.
- CSD-suspensionen omrøres og blandes grundigt på en hvirvelblander i 10 sekunder, før næsedråberne administreres.
3. Administration af næsedråber til mus
- Bedøvelse hurtigt en mus med 2% isofluran i en dosis på 3,6 ml / t i en anæstesimaskine (figur 1B, venstre panel).
BEMÆRK: Anæstesi skal udføres i en røghætte for at undgå indånding af bedøvelsesmidlet af teknikeren. Sørg for, at den tilstrækkelige dybde af anæstesi ved at observere ændringen fra hurtig og uregelmæssig vejrtrækning til en langsom og stabil tilstand hos musene. - Dryp 50 μL af CSD nasalt inden for 4-8 s (figur 1B, højre).
- For næsedryppet skal du placere musens hoved på forskerens metacarpophalangeale led med spidsen af pegefingeren.
- Hold musen i en udsat position med fire fingre let bøjede og spidsen af tommelfingeren let rørende musens underlæbe for at rette luftvejene. Undgå at røre svælget for at fremkalde gagrefleksen.
- Opsug 50 μl væske ved hjælp af en 200 μl pipette. Drop væsken ind i musens næsehule i tre til fire opdelte doser afhængigt af musens respirationsfrekvens. Hver instillation skal bestå af 15 til 20 μl væske. Administrer dryppene en gang hver 3. dag, 5x inden for 12 dage. Behandl kontrolmusen med en lige så stor mængde saltvand.
- Massér forsigtigt musens hjerteområde 5x-10x i 5 s.
- Hold musens krop med håndfladen, klem huden på bagsiden af nakken med tommel- og pegefingeren, og fastgør musens bagben med de andre fingre. Tryk derefter forsigtigt på musens hjertebankende område med pegefingeren på den anden hånd 5-10 gange i en periode på 5 s.
- Når musens vejrtrækning er stabiliseret, skal du placere den i et genopretningsbur med en varmepude og observere, indtil den kommer sig efter anæstesi, og returner derefter musen til sit hjemmebur. Ofre musen efter 31 dage.
4. Indsamling af lungevæv og forberedelse af en paraffinsektion
- Injicer 0,18 ml 10% chloralhydrat intraperitonealt, hvilket sikrer, at musene ikke reagerer på tå- eller halestimulering (udført ved hjælp af tandpincet). Fortsæt derefter til næste trin.
- Fastgør muselemmerne på et skumtestbræt og spray med 75% alkohol for at dæmpe pelsen. Fjern de fleste brystribben ved kravebenets midterlinje og åbn musens brysthule for at udsætte hjertet og lungerne.
- Skær straks højre atrium op med en oftalmologisk kirurgisk saks og injicer langsomt 20 ml fosfatbuffer (PBS) fra hjertespidsen ved venstre atrieslag med den største amplitude for at lade fuldblodet strømme. Fjern derefter den nederste lap af højre lunge og opbevar den ved -80 °C til western blotting-analyse.
- Opbevar perfuserende 10 ml 4% paraformaldehyd (PFA) på samme sted efter PBS-injektionen. Den resterende lunge opsamles og prøven opbevares i 30 ml 4% PFA til patologisk analyse.
- Efter 72 timers fiksering indlejres prøver i paraffin.
- Dehydrere vævene gennem en gradueret serie ethanol (EtOH) fortyndinger i deioniseret vand (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) i 1 time hver ved RT. Prøven renses i to vaske xylen i hver 1 time.
- Prøverne infiltreres med smeltet paraffinvoks ved opvarmning til 50 °C i 2 timer. Gentag denne proces i en anden cylinder. Afkøl voksformene med væv i 1 time for at hærde.
- Når voksen er hærdet, og vævet er indlejret, skal du bruge en paraffinsektionsmaskine til at skære vævet ved 5 μm. De præcise snit- og glidemonteringstrin blev tidligere beskrevet11.
BEMÆRK: Tilstrækkelig vævsperfusion indikeres ved at udvikle muskeltrækninger og halevridning til en "S" form eller bøjning efter at have modtaget 10 ml 4% PFA.
5. Udførelse af hæmatoxylin og eosin (HE) farvning
- Det paraffinindlejrede væv opvarmes på en varmeplade (60 °C) i mere end 4 timer for at muliggøre vedhæftning til objektglassene og forbedret afparaffinering.
- Dewax og hydrat paraffinsektioner. Læg diasene i blød med prøver i xylen 2x i 30 minutter hver gang. Dypp dem derefter i vandfri ethanol, derefter henholdsvis 95%, 85%, 75% alkohol og deioniseret vand i 5 min.
- Udfør hæmatoxylin og eosin farvning. Plet vævene i en hæmatopylinfarvningspand i 10 min. Skyl dem med forsigtigt rindende vand i 5 min. Dypp derefter diasene i eosin-farvningspanden i 10 s.
- Dehydrer prøverne i 75%, 85%, 95% og vandfri ethanol i 5 minutter hver. Ryd vævssektionerne ved at nedsænke dem i xylen i 5 min. Sektionen forsegles med ca. 60 μL neutrale harpiksdråber. Placer dækslet glide over sektionen og sænk det forsigtigt for at undgå luftbobler.
6. Udførelse af Masson-farvning
- Paraffinprøverne afvokses og hydreres som nævnt i trin 5.2. Plet derefter cellekernerne med 50% Weigerts hæmatoxylin i 10 minutter. Blødgør vævet i sur ethanolfortætning i 10 s og skyl vævet glide forsigtigt med rindende vand til kernerumning.
BEMÆRK: Forbered Weigerts hæmatoxylinfarvningsopløsning umiddelbart før brug. - Plet prøverne med dråber Lichun rød farvningsopløsning (40 μL for hvert vævsglas) i 7 minutter og vask dem med en svag syrearbejdsopløsning (30% saltsyre) i 1 min for at fjerne det ubundne Lichun røde farvestof.
- Dyp dem i 95% alkohol i 20 s og dehydrer dem 2x med vandfri ethanol i 1-3 s hver. Derefter ryddes vævene med xylen og forsegles med 60 μL neutrale harpiksdråber som nævnt i trin 5.4.
7. Udførelse af Sirius rød farvning
- Afvoks og hydrat paraffinsektioner som nævnt i trin 5.2.
- Infiltrer sektionerne i 1 time med Sirius rød farvningsopløsning.
- Plet cellekernerne i prøverne i 8-10 minutter med Mayer hæmatoxylinfarvningsopløsning. Skyl dem forsigtigt med rindende vand i 10 min. Derefter dehydreres og ryddes vævsgliderne. Luk dem som nævnt i trin 5.4.
8. Udførelse af immunhistokemi
- Paraffinprøverne afvokses og hydreres som beskrevet i trin 5.2.
- Prøverne infiltreres med en 3 mg/ml EDTA-antigenudtagningsopløsning på ca. 30 ml. Kog i 20-30 min. Vask vævene med deioniseret vand, og inkuber dem derefter i fosfatbufret opløsning indeholdende 0,5% Tween-20 (PBST) i 5 minutter.
- Prøverne lægges i blød i 15 minutter med 0,3% hydrogenperoxidopløsning for at inaktivere den endogene peroxidase i prøverne. Vask dem 3x med PBST i 5 min hver gang.
BEMÆRK: 0,3% hydrogenperoxidopløsningen skal gøres frisk i et lystæt miljø. - Permeabiliser membranen af prøver i 15 min med 0,3% Triton-100 opløsning. Derefter blokeres med 30-40 μL 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time.
- Fjern blokeringsopløsningen. Der tilsættes fortyndede primære antistoffer NF-κB (fortynding 1:200) og CD68 (fortynding 1:1.000), og prøverne inkuberes natten over ved 2-8 °C i en mikroskopglas IHC-vådboks for at forhindre fordampning og lys.
- Den næste dag overføres dem til RT i 1 time. Vask dem derefter med PBST 3x i 5 minutter hver.
- Inkuber prøverne i 1 time i kanin-anti-mus peberrodsperoxidase-mærkede sekundære antistoffer (fortyndingsforhold 1:500) ved RT og vask dem med PBST 3x i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Både primære og sekundære antistoffer blev fortyndet med 5% BSA. - Prøverne inkuberes med 3,3'-diaminobenzidinsubstratet (DAB) svarende til det enzymmærkede antistof i 5-20 min. Stop reaktionen med deioniseret vand, når den optimale farvningsintensitet er nået.
BEMÆRK: DAB-opløsningen skal tilberedes frisk og beskyttes mod lys. Farveudviklingsreaktionen skal observeres i realtid under mikroskopet for at bestemme, hvornår farvningen skal stoppes. Positive prøver udviser intens farvning, mens negative prøver ikke udvikler farve. - Modfarve prøverne i 30 s med Weigert hæmatoxylin. Skyl derefter vævene under rindende vand i 1 min. Derefter dehydreres, ryddes og forsegles vævsgliderne som nævnt i trin 5.4.
9. Udførelse af western blotting-analyse
- Lyse lungevævet for at ekstrahere proteiner. Der tilsættes 200 μL RIPA arbejdsløsning til 20 mg lungevæv.
- Homogeniser vævet på is i 5 minutter ved hjælp af en håndholdt elektrisk kværn og inkuber i 1 time på is med forsigtig omrystning. Derefter centrifugeres homogenatet ved 4 °C i 15 minutter ved 14.800 x g.
- Supernatanten opsamles, og proteinkoncentrationen bestemmes med BCA-proteinanalysesættet. Lav proteinlagringsopløsningen med RIPA ved 6 μg/μL protein. Der tilsættes 20 μL 5x belastningsbuffer til 80 μL proteinlysat. Den sekundære proteinstruktur afbrydes ved at opvarme de proteinholdige mikrocentrifugeglas i et metalbad (100 °C) i 20 minutter.
- Efter afkøling alikvote 100 μL af proteinoplagringsopløsningen i hvert glas og opbevar prøverne i køleskab -80 °C. Fortynd proteinkoncentrationen til 2-3 μg / μL med 1x belastningsbuffer før elektroforese.
BEMÆRK: Proteinekstraktionsprocessen skal udføres på is. Til RIPA-arbejdsløsningen tilsættes 1 μL 100 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) til 99 μL RIPA for at hæmme nedbrydning af phosphoryleret protein. Forbered 1x belastningsbuffer ved at fortynde 5x belastningsbuffer med RIPA i forholdet 1:4. - Tilsæt 20 μg prøver til hvert hul og kør gelen. For 5% koncentrerede geler skal du bruge 80 V i 20 minutter for at få proteinerne elektroforeseret ned fra samme udgangspunkt. For 10% isolerede geler køres ved 100 V i 1 time for at tillade proteiner med forskellige molekylvægte at blive adskilt så meget som muligt.
- Foraktiver PVDF-membranen med methanol i 20 sekunder. Overfør proteinerne til PVDF-membranen ved hjælp af vådoverførselsmetoden med 400 mA strøm i 1-2 timer.
BEMÆRK: Sørg for, at elektroforesetanken og elektrooverførselstanken er vandrette. Afkøl hele tanken med is, da membranoverførselsprocessen genererer meget varme. - Vask membranen med TBST-opløsning i 5 min hver gang, 5x. Bloker derefter med 5% BSA eller 5% skummetmælk i 1 time. Fortynd de primære antistoffer NF-κB (1:1.000) og β-actin (1:1.000) med 5% BSA. Nedsænk strimlerne i antistofopløsningen og ryst strimlerne forsigtigt natten over ved 2-8 °C.
- Vask strimlerne med PBST. Derefter fortyndes peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret gedeantikanin sekundært antistof (1:10.000) og inkuberes i det fortyndede sekundære antistof i 1 time ved RT med forsigtig omrystning.
- Forbered en forbedret kemiluminescens (ECL) udvikler, slip den på strimlen og inkuber i 3 minutter.
- Udsæt strimlen for et gelbillede i 20 s. Mål den grå værdi af strimlen for at vurdere proteinniveauet ved hjælp af systemsoftware. Brug β-actin som intern kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den potentielle patogenese af silikose hos mus blev undersøgt ved anvendelse af den foreslåede metode. Vi fandt, at kropsvægten hos musene i forsøgsgruppen faldt signifikant i forhold til kontrolgruppen, og at kropsvægten langsomt kom sig efter ophør af eksponering. På grund af den optimerede dosis, der anvendes her, blev der ikke observeret dødelighed hos silicaeksponerede mus i dette eksperiment. Den tekniske køreplan for gentagen næsedryp til CSD er vist i (figur 1). De tidligere beskrevne procedurer omfattede CSD-suspensionspræparat, isofluran-induceret anæstesi, næsedryp og thoraxmassage12. Vi demonstrerede kollagenaflejring og myofibroblastdifferentiering efter 4 ugers statisk fodring12. Vi har brugt denne støveksponeringsmetode til at studere den underliggende mekanisme for lungefibrose forårsaget af kulstøv. De nye undergrupper af makrofag og interventionseffekten af D-vitamin blev fundet gennem enkeltcelletranskriptomteknologi13. I denne undersøgelse blev progressionen af lungefibrose hos mus signifikant accelereret ved eksponering for CSD, hvilket forårsagede skade på bronchiale perifere elastiske fibre (figur 2 og figur 3). Silikoseknuder består af makrofager, der indeholder CSD. Fibrose nodulær er beriget med mange CSD, og CD68-positive makrofager opsluger aktivt disse partikler. Disse deponerede CSD'er fremmer dannelsen af fibrøse foci. Som tidligere nævnt, efter at have været udsat for CSD i 4 uger, fik mus åbenlyse læsioner, såsom kollagenaflejring i siliciumlungeknuder og skade på lungevævsstruktur. Der var også beskeden skade på vævet omkring bronkierne12. Den biologiske proces med ER-stress forårsaget af CSD er relateret til NF-κB, som er involveret i det inflammatoriske respons (se figur 4). Samlet set viser disse resultater, at den foreslåede fremgangsmåde effektivt kan simulere udviklingen af silikose hos mus.
Figur 1: Krystallinsk silikatstøv (CSD) partikler under fem mikron blev anvendt til nasal dryp. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) af CSD viste, at partiklerne var uregelmæssigt formet. B) CSD-suspension blev anvendt til at fremstille silikosemodellen med mus ved næsedryp. Maskinen til venstre bruges til isofluranbedøvelse, og højre panel skitserer de nøglepunkter, der fører til, at næsedryppet fungerer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sirius rød farvning viste fibrose i muselunger ved næsedrop CSD i 1 måned. (A) Sirius rød farvning blev udført for at måle kollagenaflejring i lungevæv efter CSD- eller saltvandsbehandling (venstre øvre og venstre nedre i ruder). Polariserende mikroskopi afslørede tre forskellige typer kollagenfibre (rød, gul og grøn), hvoraf type 1 kollagenfibre vist i rødt er en risikofaktor for silikose. Der blev imidlertid ikke fundet signifikant fibrose i køretøjsgruppen (lige op og lave paneler). (B) Fibrose score (FS) er et semikvantitativt evalueringsindeks baseret på Sirius rød farvning12, der adskiller sig væsentligt fra kontrollen (***P < 0,0001). Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunohistokemisk farvning af CD68 i CSD-behandlet muselunge for at overvåge makrofagernes rolle i en silicotisk knudedannelse. En typisk silicaknude er kendetegnet ved flydende nekrose efter fagocytose af CSD i midten, omgivet af makrofager i periferien (HE-farvning). Derudover blev CSD beriget i knuderne ledsaget af fibrose (Masson-farvning). Den immunhistokemiske farvning af CD68 afslørede, at makrofager var bredt til stede i lungevæv. Desuden havde disse makrofager indtaget CSD (set under polariseret lysmikroskopi, højre panel), hvilket forårsagede alvorlig lungeskade. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: NF-κB-ekspressionen i den CSD-behandlede muselunge . (A) Immunohistokemisk farvning blev udført på lungevævet. Den CSD-behandlede muselunge i højre rude viste høj NF-κB-farvning sammenlignet med køretøjsgruppen til venstre. Skalabjælke = 50 μm. (B) Repræsentativ western blot viste, at de CSD-behandlede mus har en øget NF-κB-ekspression i lungen. Frisk lungevævslyse blev udsat for western blotting. (C) NF-κB-forskellen mellem Sil- og Veh-grupperne var signifikant (** P < 0,01). Båndintensiteten blev målt ved hjælp af billede J. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Silikose musemodeller er afgørende for at studere patogenese og behandling af silikose. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af en model af silikose hos mus gennem gentagen nasal eksponering. Denne metode muliggør undersøgelse af de patologiske egenskaber ved silikose induceret af forskellige eksponeringstider. Mus blev bedøvet på en ventilator, og deres respirationsfrekvens blev overvåget. Den indledende korte, hurtige vejrtrækning blev gradvist langsommere og dybere over tid. Anæstesien fik musenes muskler til at slappe af, hvilket førte til dyb vejrtrækning og gav dem mulighed for at indånde CSD i et tidsvindue med langsom, dyb vejrtrækning. Under denne proces holder operatøren musens underkæbe med tommelfingeren og retter halsen for at forhindre væsken i at komme ind i fordøjelseskanalen, en metode til respirabel støveksponering, der ikke forårsager smerte og er ikke-invasiv. Denne metode kan opfylde de individuelle behov for gentagen implementering for at studere støveksponering. Kato et al. i 2017 brugte en enkelt stor dosis (125 mg / ml, 40 μL) via et orofaryngealt drop til at modellere lungefibrose, og vi henviser til denne koncentration for at forsøge at udforske lungeændringer induceret af flere små doser gennem næsehulen14.
Der er flere udfordringer forbundet med næsedråber efter anæstesi fra et teknisk synspunkt. Under denne proces holder operatøren musens underkæbe med tommelfingeren for at rette halsen og forhindre væsken i at komme ind i fordøjelseskanalen. Hvis musene ikke opnår dyb anæstesi, eller operatøren ikke er dygtig og savner tidsvinduet for langsom dyb vejrtrækning, vil effekten af næsedryppet og modelens patologiske egenskaber ikke være som forventet. For at undgå overbedøvet død og underbedøvet modelleringsfejl skal de, der arbejder med isofluranbedøvede mus, derfor være tilstrækkeligt uddannet og mestre de kritiske egenskaber ved isofluranbedøvede mus, før de udfører næsedryppet. Desuden fremmer tryk på musens bryst efter næsedryppet, almindeligvis kaldet massering, CSD's rejse for at nå de terminale bronchi og endda lungernes alveolære vægge. Mus, der blev bedøvet til et dybt niveau, var tilbøjelige til kvælning, da de fik en høj dosis næsedråber. Men hvis deres bryst hurtigt blev komprimeret, steg overlevelsesraten. Sidst men ikke mindst kræver skabelsen af silikosemodeller mus med et sundt fysisk fundament, og nogle undersøgelser har vist, at mus ældre end 10-12 uger har dårlig tolerance og en øget dødelighed efter gentagen eksponering for CSD. På trods af sine fordele har denne model flere ulemper. En ulempe er, at musen ikke direkte indånder støvpartikler gennem luftstrømmen. For at løse dette problem har vi begrænset mængden af CSD-suspension, der inhaleres i en enkelt udåndingsudånding, og hyppigheden af gentagen administration af CSD. Desuden har vi oprettet køretøjsgrupper. Dataene afslører, at indånding af en lille mængde væske kun midlertidigt forstyrrer ventilationen, hvilket ikke vil skade musenes lunger12. Køretøjskontrolmusene absorberer hurtigt den inhalerede saltvand uden at påvirke musenes lungefunktion, kropsvægt eller basale aktivitet. Tværtimod kan gentagen eksponering for CSD gennem næseindånding skabe den ønskede dynamiske model for silikose hos mus12. Fordi forskellige eksponeringsfrekvenser påvirker fibroseprocessen i modeller med gentagne eksponeringer, har vi ikke et klart tidspunkt. Normalt, for en engangseksponering af silicastøv, er dag 7 stadig i de tidlige stadier silikosen. Dag 7-14 svarer til det inflammatoriske aktivitetsstadie, dag 14-28 svarer til fibrosetransformationsstadiet, og tiden efter dag 28 svarer til fibrosedannelsesstadiet12,15. Imidlertid kan patologien på disse tidspunkter variere afhængigt af dosis.
Den nasale drypmetode har flere fordele i forhold til traditionelle endotrakeale dryp eller kirurgisk eksponerede trakeostomimetoder16,17, såsom reduktion af trakeotomirelaterede infektioner og postoperativ pleje. Denne fremgangsmåde kan også opfylde kravet om gentagen CSD-eksponering under et forsøg og kræver ikke dyrt udstyr. Derudover er næsedråbemetoden en mere realistisk repræsentation af støveksponering, da små partikler kommer ind i lungerne fra det øvre luftveje og rejser til de terminale bronchioler og alveoler. Da vi bruger flere små doser silicadråber, kan silicastøvdosis komme ind i lungen i maksimalt omfang og kontinuerligt stimulere organismen. Således er denne modelleringsmetode udviklet til at simulere medarbejdernes tilbagevendende eksponering for CS i deres arbejdsmiljø og til at udforske den patologiske proces af silikose.
Oprettelse af musemodeller af silikose via nasal eksponering for CSD kan anvendes til gentagne eksponeringer. Derfor kan denne dyremodel bruges til at studere virkningerne af eksponeringsfrekvens og dosering på silikoseprogression og de dynamiske patologiske træk og mekanismer ved silikose. Desuden er kombineret eksponering med andre stoffer eller medicin også meget muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
