Summary
这里介绍的方法提供了从内耳前庭神经节和螺旋神经节神经元解剖、解离、培养和膜片钳记录的详细说明。
Abstract
分离和培养的内耳神经节神经元的紧凑形态允许详细表征离子通道和神经递质受体，这些离子通道和神经递质受体有助于该群体的细胞多样性。该协议概述了成功解剖，解离和短期培养内耳双极神经元的体细胞以进行膜片钳记录所需的步骤。提供了制备前庭神经节神经元的详细说明，以及铺设螺旋神经节神经元所需的必要修改。该协议包括在穿孔贴片配置中执行全细胞膜片钳记录的说明。表征超极化激活的环核苷酸门控 （HCN） 介导电流的电压钳位记录的示例结果突出了与更标准的破裂贴片配置相比，穿孔贴片记录配置的稳定性。这些方法的组合，分离体体和穿孔膜片钳记录，可用于研究需要长期、稳定记录和细胞内环境保存的细胞过程，例如通过 G 蛋白偶联受体的信号传导。
Introduction
前庭蜗神经的双极神经元将内耳的感觉毛细胞连接到脑干。它们是有关声音和头部运动的信息的主要载体;这些重要细胞的损伤会导致耳聋和平衡障碍。神经的前庭和听觉部分分别由形态和功能多样化的不同细胞类型组成 1,2。在前庭系统中，两个传入亚群以规则或不规则的间隔自发放电2.传入尖峰时间被认为反映了离子通道组成的潜在多样性 3,4。在听觉系统中，螺旋神经节神经元 （SGN） 有两个主要亚群;I 型 SGN 接触单个内毛细胞5，II 型 SGN 接触多个外毛细胞5。来自半完整和器官型培养物的体外记录表明 I 型和 II 型 SGN 的膜特性存在差异 6,7。
在这些神经元末端发现的许多离子通道和神经递质受体也存在于它们的细胞体中。因此，可以在 体外 研究孤立的前庭和螺旋神经节体的培养物，以了解离子通道和神经递质受体如何促进这些神经元的反应。分离细胞体的紧凑形态允许高质量的电记录，适用于电压门控离子通道和神经递质受体的详细表征。易于获得具有代表性的各种神经元亚型，可对细胞多样性进行高通量分析。
本文介绍了一种在出生后第9至P20天从大鼠前庭神经节上部分离和培养解离的神经节细胞体的方法。除了成功提取、解离和接种神经节细胞所需的步骤外，还提供了将这些方法扩展到螺旋神经节的建议。这些方法是各个实验室出版物中设计的方法的演变 8,9,10。本文还包括选择健康细胞进行膜片钳记录的指南。
最后，该协议概述了使用穿孔补丁配置11 进行膜片钳记录的过程。虽然穿孔贴片配置比更常见的破裂贴片配置更耗时，技术上更具挑战性，但它更适合维持细胞质环境，允许长时间稳定的记录会话。这种记录配置的好处在这里通过相对于破裂贴片记录的超极化激活阳离子电流在穿孔贴片中提高的稳定性来说明。
该协议分为五个部分。第 1-3 节描述了可以提前准备和存储的解决方案和工具。第 4 节描述了解剖和接种前庭和 SGN 的步骤，第 5 节描述了在培养一段时间后从神经元记录的步骤。在我们手中，第 4 节和第 5 节是在连续 2 天内执行的。
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Protocol
此处描述的所有动物用途均已获得南加州大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案中的动物是从查尔斯河实验室获得的P3至P25年龄的两性Long Evans大鼠，但这些方法可以应用于其他啮齿动物品系。在所有程序中必须穿戴实验室外套和手套，并在制备溶液时戴上防溅护目镜。
1. 准备工作
注意：本节中描述的解决方案和工具可以提前制作，以便在解剖和记录当天使用。
- 制备补充有10mM HEPES（L-15溶液）的Liebovitz培养基。以下步骤描述了制作 1 L L-15 溶液。
- 将 990 mL 去离子 H2O 倒入一个烧杯中。测量并加入 2.386 g （10 mM） 的 HEPES。加入一瓶 1 L L-15 溶液粉末。
注意： 粉末状 L-15 具有更长的保质期，占用的存储空间更少。或者，购买 L-15 溶液并补充 HEPES。后一种选择还可以选择使用无酚溶液，这对于荧光成像很有用。 - 在搅拌板上搅拌溶液。使用 pH 计，缓慢加入 1 N 氢氧化钠 （NaOH） 以获得 7.34 至 7.36 之间的 pH 值。
- 加入去离子H2O，直到溶液达到1,000mL的体积。使用0.22μm孔径膜过滤溶液。
注意：L-15溶液可在4°C下储存约1-2周。如果使用由酚红制成的L-15，如果太碱性（pH>7.4），溶液会变成粉红色，如果太酸（pH<7.34），溶液会变成橙色。
- 将 990 mL 去离子 H2O 倒入一个烧杯中。测量并加入 2.386 g （10 mM） 的 HEPES。加入一瓶 1 L L-15 溶液粉末。
- 准备前庭神经节神经元（VGN）的培养基（对SGN进行修饰）。按照以下步骤制备 50 mL 培养基：
- 将 47.5 mL GluMAX-I 最低必需培养基加入干净的玻璃烧杯中。
- 测量并加入 0.1194 g （10 mM） HEPES。这种额外的缓冲液可在细胞沉降时抵抗pH值变化，然后再移至培养箱。
- 加入 2.5 mL 胎牛血清 （FBS）。这使得 50 mL 培养基的总体积为 5% 的 FBS。对于SGN制剂，用0.5mL N2和1mL B27溶液代替2.5mL FBS。
- 在搅拌板上搅拌溶液。使用pH计，缓慢加入1N NaOH，以获得7.38至7.4之间的pH值。
- 加入 0.5 mL 青霉素-链霉素。通过0.22μm无菌过滤器过滤溶液。将溶液储存在4°C。
- 使用前至少 30 分钟，将培养基转移到带有通风盖的组织培养瓶中。将装有培养基的烧瓶置于37°C下浓度为5%CO2 的培养箱中。
- 准备穿孔贴片内部溶液
注：这里，100 mL 穿孔贴片内部溶液用于全细胞记录（配方总结在 表 1 中）。这些溶液可以提前制备并储存在-20°C。 等分试样可以无限期地储存在-20°C下，如果它们不经过反复的冻融循环。- 提前 6 个月，制备和储存以下储备溶液：1 M KCl、0.5 M Mg2Cl（六水合物）和 0.5 M CaCl2。在4°C的密封瓶中储存长达6个月。
注意：最好检查储备溶液的渗透压（1 M KCl 储备溶液为 2,000 mOsm;Mg2Cl 和 CaCl2 溶液为 1,500 mOsm），以确保达到目标浓度。如果溶液变得浑浊或形成沉淀，请勿使用。这可能是一个可能的暂停点。
- 提前 6 个月，制备和储存以下储备溶液：1 M KCl、0.5 M Mg2Cl（六水合物）和 0.5 M CaCl2。在4°C的密封瓶中储存长达6个月。
- 在内部解决方案制定当天，使用步骤 1.3 中的库存解决方案执行以下步骤。
- 测量 100 mL 的 milli-Q （MQ）H2O.，从 100 mL 中抽出 40 mL，放在干净的烧杯中。
- 将剩余的 60 mL H2O 加入干净无菌的 100 mL 烧杯中。加入 2.5 mL 的 1 M KCl、1 mL 的 0.5 M Mg2Cl-六水合物和 0.02 mL 的 0.5 M CaCl2。
- 加入搅拌棒，将烧杯放在搅拌盘上。搅拌至完全溶解。加入 1.307 克 K2SO4。搅拌至K2SO4 溶解。
- 称取 0.1192 g HEPES（目标 5 mM，最终体积为 100 mL）并加入溶液中。搅拌至溶解。
注意： 确保所有组分都完全溶解，因为有时 K2SO4 需要时间才能溶解。 - 称取0.1902g乙二醇-双（β-氨基乙基醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA）（目标5mM，终体积为100mL）并加入溶液中。由于 EGTA 不能完全溶解在酸性溶液中，因此将烧杯放在搅拌板上并插入 pH 探头。
- 搅拌时，缓慢滴定 1 M KOH，直到 EGTA 完全溶解。预计当 pH 值介于 6 和 7 之间时会发生这种情况。继续缓慢加入 KOH，直到最终 pH 值为 7.35（总共约 1.2 至 1.3 mL KOH）。
- 加入 MQH2O，使溶液的最终体积达到 100 mL 并搅拌。用渗透压计检查溶液的渗透压（穿孔贴片溶液的目标浓度为270 mOsm/kg）。
- 使用0.22μm无菌过滤器过滤穿孔贴片内部溶液。在-20°C下储存在5mL等分试样中。 为每个新的录制会话使用新的等分试样。
注意：这可能是一个可能的暂停点。
2. 研磨移液器的制造
注意：研磨移液器可以重复用于多个实验。每次使用前用乙醇、水和 L-15 溶液冲洗移液器，每次使用后用水和乙醇清洗移液器。在两次使用之间小心存放。
- 要制备用于细胞解离的研磨移液器，请将玻璃巴斯德移液器放在本生燃烧器的火焰上。玻璃尖端开始熔化后，将玻璃拉伸至所需的尖端直径。将移液器的一端从火焰上拉开，形成一个小弯曲。
- 将弯曲的移液器靠近显微镜。使用刻痕瓷砖，以所需的直径刻划并打破玻璃。
- 将移液管的尖端越过本生燃烧器火焰的顶部。这将快速抛光尖端附近的粗糙边缘。检查以确保尖端没有被火焰密封。
- 重复该过程，直到制备了四到五个不同尺寸的移液器。
3. 制作贴片移液器
注意：在记录会议之前，但在神经节解剖和培养之后准备一组贴片移液器。虽然在录制过程中一次制作一个电极的性能最佳，但在前一天晚上批量制作电极时，已经取得了合理的成功。将移液器存放在有盖的玻璃容器中，以保护吸头免受灰尘影响。
- 使用垂直电极拉拔器和 1.5 mm 外径/1.17 mm 内径的长丝硼硅酸盐玻璃移液器。确保玻璃始终没有灰尘和指纹。
- 按照制造商对贴片移液器的建议，使用两步程序拉出 8-10 支记录移液器。
- 用microforge检查和热抛光每个记录移液器吸头;热抛光可促进更好的密封性。目标移液器电阻在 4 至 8 MΩ 之间。
- 将抛光的移液器存放在有盖的容器中。这可以被视为实验中的暂停点。
注意：优化移液器直径以达到目标电阻范围需要通过步骤 3.2 和 3.3 进行一些反复试验。大多数商用膜片钳系统都具有内置的膜测试功能，用于测量浴液中的电极电阻。电阻计算为响应施加的 5 mV 阶跃激励的稳态输出电流之比。步骤3.1中的拉动设置和步骤3.2中的抛光必须首先使用试验移液器进行调整，直到试验移液器的电阻落在4至8 MΩ范围内。 - 在记录当天，涂上移液器吸头以降低移液器电容和记录噪音。为此，在移液器的轴上包裹一小条石蜡薄膜。没有必要一直缠绕到尖端。
注意：另一种策略是在移液器12的轴上涂覆和加热定型有机硅弹性体。
4.前庭神经节的提取和前庭神经元的镀层
- 解剖准备
- 制备含有0.05%胶原酶和0.25%胰蛋白酶的L-15溶液的酶混合物。例如，将 0.001 g 胶原酶和 0.005 g 胰蛋白酶加入 2 mL L-15 溶液中，放入烧杯中，加入一个小磁力搅拌器，搅拌至完全混合。在室温下备用。
- 通过在断头台的侧面和下方放置纸巾来准备商业获得的断头台，以尽量减少工作台和其他表面暴露于血液和其他生物材料。
- 摆放大型不锈钢剪刀、大型镊子和大型弹簧剪刀。随身携带一个装有 70% 乙醇的大喷雾瓶，以便清洁头部。
- 用 L-15 溶液填充 100 mL 烧杯并置于冰上。对 L-15 溶液充氧。
- 摆放弹簧剪刀、手术剪刀、镊子、手术刀和移液器（见 材料表）。
- 准备一个 60 毫米培养皿（用于大体解剖）和两个 35 毫米培养皿（用于清洁/精细解剖神经节）。使用带有 0.22 μm 过滤器尖端的 30 mL 注射器用含氧 L-15 溶液填充 60 mm 培养皿。
- 安乐死、头部清洁和半切
- 称量幼崽以计算腹膜内给药的致命加稀释的适当剂量（每 10 克 ~0.01 毫升）。
- 一旦达到深层麻醉，根据对脚趾捏缺乏反应的评估，使用断头台斩首。
- 用 70% 乙醇彻底冲洗头部，然后用 L-15 溶液彻底冲洗。
- 从头骨上完全去除皮肤。使用大弹簧剪刀将头部一分为二，从脊髓到大脑的入口处开始，进行两次切割，第一次切开颅骨顶部，第二次切开下颌底部。用手术剪刀将头部一分为二。
- 将头部脑的两半朝下放入装有L-15溶液的60毫米培养皿中。将当前未解剖的新鲜组织放在冰上。
- 提取前庭上神经节
- 用封闭的手术剪刀挖出大脑。切断并切除颅神经，使大脑与颅骨完全分离。
注意：此时，耳囊（形状像数字 8）应该在头部后部可见。 - 使用镊子，从头部后部开始，将透明的膜状材料拉出。
- 用手术剪刀剪掉颅骨的顶部。去除头部和颈部后部多余的组织，使解剖区域和耳囊更清洁，更容易进入。
注意：在整个过程中丢弃多余的组织，避免使培养皿太浑浊。 - 将组织转移到装有新鲜L-15溶液的第二个培养皿中。定位耳囊和听觉、前庭上神经和前庭下神经。切掉听觉神经，用小弹簧剪刀将上神经节和下神经节分开。
注意：虽然前庭神经的胞体在下神经节（较薄）和上神经节（较厚）中都存在，但从上神经节中提取的细胞具有更好的存活率。 - 使用手术刀，轻轻剃掉骨脊以削弱骨区域，神经在骨囊下潜入骨囊。用细镊子小心地清除碎屑，露出整个肿胀的神经节部分。
- 使用细弹簧剪刀将神经节与向椭圆囊俯冲的周围神经分支切割并分开。
- 使用细镊子取出上神经节，确保不要太靠近神经节组织。转移到装有新鲜L-15溶液的35mm培养皿中。
- 在继续之前，预热酶溶液：将酶混合物倒入35mm培养皿中，并置于37°C培养箱中10-15分钟。
- 使用细镊子和小弹簧剪刀清洁神经节，去除骨头（外观呈白色且结构结晶）、多余的组织、神经纤维和任何其他多余的结构。注意尽量减少任何神经节组织的切除。
- 用封闭的手术剪刀挖出大脑。切断并切除颅神经，使大脑与颅骨完全分离。
- 组织解离和电镀
- 将清洁的神经节转移到预热的酶溶液中，并将其放回培养箱中10至40分钟。一旦组织开始分裂但保持整体，酶治疗就完成了。用酶过度处理组织会导致神经节在研磨前完全溶解。
注意：组织接受酶处理的时间取决于动物的年龄。例如，用酶处理来自P9大鼠的神经节25分钟，用酶处理来自P15大鼠的神经节35分钟。 - 将神经节转移到装有新鲜L-15溶液的35mm培养皿中，并孵育2-3分钟。
- 将神经节转移到另一个装有过滤培养基的35mm培养皿中。
- 使用 200 μL 微量移液器，将 ~150 μL 过滤的培养基滴移液到涂层玻璃底培养皿上。不要添加过多的溶液，因为重要的是要保持表面张力以形成残留在玻璃盖玻片上的溶液气泡。
- 将所需数量的神经节（一到四个）转移到盖玻片上。
- 从培养皿中抽出少量培养基，用培养基冲洗研磨移液管，以防止组织粘在玻璃移液管的侧面。通过轻轻和反复地将组织通过移液管直到神经节充分解离来研磨。
注意：不要过度劳累组织以尝试单细胞悬浮液或让细胞使用过大的正压撞击到培养皿底部。此外，避免形成气泡，因为这会降低细胞存活率。温和的研磨是实现细胞成功存活的关键。 - 让细胞静置5分钟。在光学显微镜下检查细胞是否沉淀在盖玻片上。
- 小心地将培养皿放入37°C培养箱中12-24小时。同样，确保保持溶液气泡完好无损。
注意：当培养时间超过24小时时，每天刷新培养基。这可能是一个可能的暂停点。
- 将清洁的神经节转移到预热的酶溶液中，并将其放回培养箱中10至40分钟。一旦组织开始分裂但保持整体，酶治疗就完成了。用酶过度处理组织会导致神经节在研磨前完全溶解。
- 电镀 SGN
- 按照前庭神经节说明的步骤 4.2.1 至 4.2.5 将头部一分为二。
- 找到耳囊（形状像数字 8），然后用钝镊子切开边缘，从头骨中取出。
- 更换 L-15 解决方案。耳囊的螺旋部分容纳耳蜗和Corti器官。在不损伤下层组织的情况下，用平行于骨曲线的细镊子切掉覆盖在耳蜗转弯处的骨头。
- 一旦取出足够的骨头以露出耳蜗转动的全部范围，使用小弹簧剪刀切断耳蜗底部的 modiolus（含有 SGN 中央轴突的厚而白色的纤维组织），以将其从耳囊的其余部分中释放出来。
- 用细镊子捏住底部的纹，去除血管纹。在螺旋周围展开，一直到顶点，将其从Corti器官中剥离出来。
- 用小弹簧剪刀将Corti的器官切成两到三圈，使其平放。
- 用小弹簧剪刀切除每转一圈的modiolus。
- 通过切割 SGN 纤维束向毛细胞投射的边缘来去除螺旋神经节。
- 使用细镊子清洁神经节，去除骨头（外观为白色且结构结晶）、modiolus（外观为白色且纤维状）和任何其他多余结构。注意尽量减少任何神经节组织的切除。
- 遵循与第4.4节中用于前庭神经节的螺旋神经节相同的酶促处理程序。螺旋神经节的酶促时间通常较短，螺旋神经节比前庭神经节更细长。与前庭神经节相比，对螺旋神经节使用较小直径的研磨移液器。
- 在补充有N 2和B27的培养基中研磨螺旋神经节，如培养基配方中所示。
- 将含有解离神经节的培养皿置于37°C，5%CO2 培养箱中12-24小时。
注意：协议可以在此处暂停。
5. 录音
注意：在此过程中，通常在接种后 12-24 小时进行来自分离神经节的膜片钳记录。其他实验室报告了神经元在培养时间更长后的结果10.
- 准备录音室
- 使用快速交换记录室（或等效物），允许直接在培养皿中进行膜片钳记录。在倒置显微镜上设置腔室。
- 将玻璃底培养皿插入腔室。
- 通过灌注管系统将 L-15 溶液送入记录室。以每分钟 0.5-1 mL 的速度稳定腔室中的灌注流入和流出。
- 准备用于加载电极的内部溶液
- 解冻穿孔贴片内部溶液的等分试样。将 2.5 mL 溶液分配到 35 mm 培养皿中。盖上培养皿上的盖子，并贴上“Tip Dip”的标签。放在无尘区，因为尽可能保持这种溶液的清洁非常重要。
- 称取 1 mg 两性霉素 B 并加入 20 μL 二甲基亚砜 （DMSO）。涡旋并旋转溶液，直到所有两性霉素-B都在溶液中。将 10 μL DMSO/两性霉素 B 溶液加入剩余的 2 mL 解冻穿孔贴片内部溶液中。用移液管抽出并驱散溶液两到三次，以确保DMSO / 两性霉素-B均匀混合到内部溶液中。溶液将具有淡黄色调。
- 将两性霉素-B 穿孔贴剂内部溶液吸入 3 mL 注射器中。在注射器中加入一个 34 G 的尖端。将注射器包裹在铝箔中，并将注射器放在冰上。
注意：该溶液必须每 2 小时重新制备一次，以确保两性霉素 B 在穿孔细胞膜方面的有效性。两性霉素-B对光敏感，必须用铝箔或其他方法避光。
- 膜片钳记录
- 使用 10 倍或 20 倍物镜可视化神经元。调整照明并优化光学元件，以查看单元周围的边界和阴影。
- 检查分离神经元的质量。只尝试具有光滑均匀表面的神经元，这些神经元的对比度不太强烈，并且只有小而分散的陨石坑。此外，请确保避免成对的神经元、被碎片包围的神经元或其他细胞。
- 在 100 倍放大倍率下，识别要修补的神经元或神经元场，并将它们排列在视野的中心。
- 通过将吸头浸入放置在培养皿中的清洁溶液中，用不含两性霉素的清洁溶液填充移液器的尖端（~20 秒）。毛细管作用会将少量溶液吸入尖端。
注意：在立体解剖显微镜下执行此步骤，这样可以确定尖端保持尖端浸渍溶液的程度。如果溶液不能保持~10-20秒，则电极的形状不理想。在这种情况下，请重新配置电极拉拔程序以产生更长的尖端。 - 接下来，用含有两性霉素的内部溶液填充移液器的背面。移液器内的细丝将吸入溶液，以满足吸头中的清洁溶液。让灯丝平稳地将溶液拉下，不要试图敲出气泡，因为这会迫使两性霉素过快地到达尖端。
- 使用注射器抽出可能在电极后部的溶液。
注意：从这一点快速工作到着陆并在所需的电池上形成高电阻密封非常重要。 - 将移液器插入移液器支架。检查移液器是否紧贴在支架中，以防止移液器漂移。如果移液器不稳定，请更换移液器支架前后的密封 O 形圈，以尽量减少漂移并保持强大的吸力。将移液器更换为刚装满的移液器。
- 将移液器放入记录室的浴槽中。
- 将移液器吸头定位在视野中间。确保吸头没有气泡或其他碎屑。
- 在膜测试中施加电压阶跃 （5 mV） 以监测移液器电阻。在电池上形成密封的整个过程中继续监测输入电阻。
- 取消移液器偏移电位，使移液器电流在pClamp的膜测试模式下读数为零。
- 使用膜片钳放大器上的快速电容补偿功能校正移液器电容（Multiclamp Commander 软面板中的 Cp 快速拨盘）。
- 将移液器向下移动到细胞中。
- 一旦移液器离神经元足够近，切换到更高放大倍率的物镜，并通过相机将图像发送到监视器（使用40倍物镜，总放大倍率为400倍）。调整移液器并重新定位神经元。
- 将记录电极移近相体。在监视器上找到神经元的中心，并将记录电极放置在神经元上方。
- 从上方接近神经元，使电极落在球形细胞的中心。将移液器偏移量调整为系统中恒定直流电位的零。
- 将移液器靠近膜。牢牢地落在细胞的中心。
注意： 着陆时，神经元表面会出现小凹陷，输入电阻会增加一倍/三倍。 - 使用注射器或口腔移液器施加负压（抽吸）。打开 -60 mV 的保持电位。密封电阻应增加，直到它超过千兆欧姆。
注意： 快速工作以减少填充电极和降落在电池上之间的时间。在步骤5.3.5中加入到穿孔贴片内部溶液中的两性霉素到达电极尖端之前，有一段有限的时间。一旦尖端被两性霉素污染，就很难形成高电阻密封，并且电阻通常稳定在~200兆欧。 - 一旦形成千兆欧姆密封，释放负压。一旦密封形成，就应用快速电容补偿，以尽可能降低膜测试模式下移液器电容瞬变的幅度。
- 当两性霉素开始起作用时，随着两性霉素进入膜，输入电阻逐渐降低，响应 5 mV 电压阶跃的电流逐渐增加。串联阻力突然降低而不是逐渐稳定表明发生了自发破裂。
- 使用放大器的电容瞬态归零功能估计整个电池电容和串联电阻。在实验开始时和实验期间定期记录和监测串联电阻。
注意：串联电阻可能需要 5-20 分钟才能稳定下来，具体取决于电极的大小以及吸入移液器中的清洁溶液量。一旦串联电阻稳定在 30 MHz 以下，就可以使用电压钳位和电流钳位模式。有时观察到记录期间神经元的肿胀或收缩，但当溶液的渗透压和pH值正确调整时很少见。
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Representative Results
通过应用一系列电压阶跃来运行电压钳位协议，揭示了各种不同电流系列的电压依赖性激活。图1A，B显示了从VGN唤起并改编自已发表的记录13的全细胞电流的代表性示例。施加去极化电压（图1B）会激活一个内向电流（按照惯例为负），该电流会非常迅速地激活和失活（图1A）。这是钠通道 14,15 的电压门控特性的典型特征，钠通道14,15 主要驱动动作电位16,17 的上冲程。去极化还激活了持久且相对缓慢激活的向外电流，从而驱动动作电位的下冲程。药理学表明，这些电流主要由VGNs 3,18,19,20,21中的各种钾通道携带。
深而持久的超极化电压唤起超极化激活的环核苷酸门控 （HCN） 通道22 携带的缓慢激活的内向电流（图 1C）。可以使用 图1D所示的尾电流协议来研究这些电流的激活。在这里，通过绘制在尾部阶跃 （Itail） 期间流动的电流作为调节电压的函数来探测电流的激活百分比。电流-电压激活曲线呈S形形（图1E）。尽管该通道由可溶性第二信使（如环AMP（cAMP））门控，但使用穿孔贴片配置测量的激活曲线在整个长时间记录中是稳定的。相反，当在破裂的贴片配置中进行记录时，通道的大小和电压激活范围会发生变化（可能是由于胞质成分的洗脱）。
神经元多样性由将电流注入不同VGN和SGN时引发的放电模式范围来说明（图2;分别为顶部和底部）。一些神经元仅在电流注入开始时放电，而另一些神经元则多次放电。这种异质性反映了 VGN 和 SGN 中潜在钠和钾通道组成的基本多样性 23,24,25。
图 1：用于测量不同离子电流组的电压钳协议示例。 （A，B） 由一系列电压阶跃 （B） 感应的全电池电流 （A） 示例。净内向钠电流（负电流）在这里通过它们的瞬态激活和失活（标记为箭头，Na+）来识别。净向外电流（标记为箭头，K+，持久正电流）主要由钾离子携带，并且比钠电流具有慢得多的活化和失活动力学。（三、四）HCN电流由一系列长持续时间的超极化电压激活。（E，F）在记录过程中不同时间点，穿孔贴片中离子通道表征的稳定性。在穿孔贴片构型中测量了HCN电流的电压相关激活曲线I.破裂贴片构型（F）中HCN电流的激活曲线。图像 C-F 已从13 修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：通过注入电流步骤唤起不同的发射模式。 （A） 五个前庭神经节体的放电模式。（B） 五个 SGN 的点火模式。 （C） 相应的当前步长。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里介绍的方法特定于来自分离神经元的记录;以前的研究集中在半完整制剂中轴突末端的记录。与现有的终端记录技术相比，隔离记录具有出色的空间钳位和等电位行为。此外，该协议提供了对更广泛的神经元样本的访问，因为在前庭上皮的半完整记录中只能访问带有花萼的亚群。最后，孤立的记录允许使用穿孔贴片技术，该技术可以防止细胞内环境的破坏，而细胞内环境通常会因破裂贴片记录中细胞内溶液和胞质溶胶之间的透析而中断。
成功的录音首先取决于分离和培养的体腔的质量。细胞存活的一个关键步骤是在研磨过程中产生分离神经元所需的力。温柔的手对细胞存活至关重要。研磨移液器应放置在L-15溶液的气泡中，以防止将神经元强行排出到培养皿底部。如果出现细胞存活问题，还应格外小心，以防止气泡的形成或破坏溶液的气泡，以防止解离的细胞沉淀在盖玻片上。最好有各种尺寸的热抛光研磨移液器，以便研究人员可以灵活地选择直径使神经节在通过移液器时受到轻微阻力的移液器。对移液器进行热抛光可减少神经节穿过玻璃粗糙边缘而造成的损坏。留下粗糙的边缘最初似乎更有效地分解神经节，但这种方法会损害体细胞并降低培养期后的存活率。最后一条建议是小心翼翼地保护成功的研磨移液器。
另一个对细胞存活至关重要的因素是消化酶治疗的持续时间。在确定酶时间时，研究人员需要仔细调整时间，以确保组织很好地分解，但又不会影响细胞存活。我们发现酶处理对细胞存活和离子通道特性的影响很小，因为从酶处理的细胞收集的数据似乎与不依赖这种方法的其他方法一致19,26。尽管酶处理将研磨所需的力降至最低，但它确实存在酶消化（特别是基于单独胰蛋白酶或木瓜蛋白酶）会对离子通道27 造成损害的局限性。因此，尽管我们推荐了一些取决于动物年龄的酶时间指南，但最好准备好根据结果调整时间。最后，我们鼓励采用“少即是多”的磨削方法。这意味着要抵制形成单细胞悬浮液的冲动，并在三到四次通过后停止研磨，即使还剩下几大块组织。
培养的一个优点是它似乎可以清洁体细胞膜并促进形成髓鞘的神经胶质细胞的脱落，从而允许更成功地从神经元进行膜片钳夹。因此，分离和培养的神经节制剂对于将膜片钳记录延长到出生后第 1 周之后特别有用，之后细胞体逐渐被髓磷脂覆盖，阻碍膜片钳电极。在出生后第 2 周后分离的加短期培养（<24 小时）VGN 的膜片钳记录中观察到的离子通道活性与免疫组织化学和前庭上皮中花萼末端的直接记录一致28,29。然而，应该注意的是，在神经营养因子和抗生素的帮助下延长培养也可能影响离子通道30,31,32,33,34。这些技术的任何应用都必须仔细考虑这些因素对神经元及其离子通道的潜在生物物理学的影响 30,31,32,33,34。
总体而言，来自分离和培养的体细胞的膜片钳记录适用于研究内耳神经元离子通道特性的多样性。穿孔贴片构型的长期稳定性特别适合研究离子通道，例如HCN，其活化特性 通过胞质 第二信使进行调节。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Jing Bing Xue 博士和 Ruth Anne Eatock 博士对这些方法的早期贡献。这项工作得到了 NIH NIDCD R03 DC012652 和 NIH NIDCD DC012653S 的支持，R01 DC0155512到 RK 和 T32 DC009975到 DB、NN 和 KR。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
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