Summary
Hier worden methoden gepresenteerd die gedetailleerde instructies geven voor het ontleden, dissociëren, kweken en patch-clamp-opname van vestibulaire ganglion- en spiraalvormige ganglionneuronen van het binnenoor.
Abstract
De compacte morfologie van geïsoleerde en gekweekte ganglionneuronen in het binnenoor maakt gedetailleerde karakteriseringen mogelijk van de ionkanalen en neurotransmitterreceptoren die bijdragen aan de celdiversiteit in deze populatie. Dit protocol schetst de stappen die nodig zijn voor het succesvol ontleden, dissociëren en op korte termijn kweken van de somata van bipolaire neuronen in het binnenoor met het oog op patch-clamp-opnames. Gedetailleerde instructies voor het voorbereiden van vestibulaire ganglionneuronen worden voorzien van de nodige aanpassingen die nodig zijn voor het plateren van spiraalvormige ganglionneuronen. Het protocol bevat instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen in de configuratie met geperforeerde patch. Voorbeeldresultaten die de spanningsklemopnames van hyperpolarisatie-geactiveerde cyclische nucleotide-gated (HCN)-gemedieerde stromen karakteriseren, benadrukken de stabiliteit van de opnameconfiguratie van geperforeerde pleisters in vergelijking met de meer standaard configuratie met gescheurde pleisters. De combinatie van deze methoden, geïsoleerde somata plus geperforeerde-patch-clamp-opnames, kan worden gebruikt om cellulaire processen te bestuderen die lange, stabiele opnames vereisen en het behoud van intracellulair milieu, zoals signalering via G-proteïne gekoppelde receptoren.
Introduction
De bipolaire neuronen van de vestibulocochleaire zenuw verbinden de sensorische haarcellen van het binnenoor met de hersenstam. Zij zijn de belangrijkste dragers van informatie over geluid en hoofdbewegingen; Schade aan deze belangrijke cellen leidt tot doofheid en evenwichtsstoornissen. De vestibulaire en auditieve delen van de zenuw bestaan elk uit verschillende celtypen die morfologisch en functioneel divers zijn 1,2. In het vestibulaire systeem vuren twee afferente subpopulaties spontaan met tussenpozen die regelmatig of onregelmatig zijn2. Afferente piektiming wordt verondersteld een onderliggende diversiteit in ionenkanaalsamenstelling te weerspiegelen 3,4. In het auditieve systeem zijn er twee belangrijke subpopulaties van spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's); Terwijl Type I SGN's contact maken met individuele binnenste haarcellen5, komen Type II SGN's in contact met meerdere buitenste haarcellen5. In vitro opnames van semi-intacte en organotypische culturen suggereren verschillen in de membraaneigenschappen van Type I en Type II SGN's 6,7.
Veel ionkanalen en neurotransmitterreceptoren die aan de uiteinden van deze neuronen worden aangetroffen, worden ook in hun cellichamen aangetroffen. Als zodanig kunnen culturen van de geïsoleerde vestibulaire en de spiraalvormige ganglionsomata in vitro worden bestudeerd om te begrijpen hoe ionkanalen en neurotransmitterreceptoren bijdragen aan de respons van deze neuronen. De compacte morfologie van de geïsoleerde cellichamen maakt elektrische opnames van hoge kwaliteit mogelijk, geschikt voor gedetailleerde karakterisering van spanningsafhankelijke ionkanalen en neurotransmitterreceptoren. Gemakkelijke toegang tot een representatieve verscheidenheid aan neuronsubtypes maakt een high-throughput analyse van celdiversiteit mogelijk.
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren en kweken van gedissocieerde ganglioncellichamen uit het superieure deel van het vestibulaire ganglion bij ratten op postnatale dag (P)9 tot P20. Er worden ook suggesties gedaan om deze methoden uit te breiden naar het spiraalvormige ganglion, naast de stappen die nodig zijn voor het succesvol extraheren, dissociëren en plateren van de ganglioncellen. Deze methoden zijn een evolutie van de methoden die zijn bedacht in publicaties van verschillende laboratoria 8,9,10. In dit artikel zijn ook richtlijnen opgenomen voor het selecteren van gezonde cellen voor patch-clamp-opnames.
Ten slotte schetst het protocol de procedure voor het opnemen van patch-clamps met behulp van de geperforeerde patchconfiguratie11. Hoewel de configuratie met geperforeerde pleisters tijdrovender en technisch uitdagender is dan de meer gebruikelijke configuratie met gescheurde pleisters, is het beter voor het behoud van het cytoplasmatische milieu dat lange en stabiele opnamesessies mogelijk maakt. De voordelen van deze opnameconfiguratie worden hier geïllustreerd door de verbeterde stabiliteit van hyperpolarisatie-geactiveerde kationische stromen in geperforeerde pleisters ten opzichte van gescheurde pleisteropnamen.
Dit protocol is onderverdeeld in vijf secties. In de paragrafen 1-3 worden oplossingen en hulpmiddelen beschreven die van tevoren kunnen worden voorbereid en opgeslagen. Sectie 4 beschrijft de stappen voor het ontleden en plateren van de vestibulaire en SGN's. Sectie 5 beschrijft de stappen voor het opnemen van de neuronen na een periode in kweek. In onze handen worden sectie 4 en sectie 5 uitgevoerd over een periode van 2 opeenvolgende dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het hier beschreven gebruik van dieren is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Southern California. Dieren in dit protocol zijn P3- tot P25-gerijpte Long Evans-ratten van beide geslachten verkregen van Charles River Laboratories, maar deze methoden kunnen worden toegepast op andere knaagdierstammen. Bij alle procedures moeten een laboratoriumjas en handschoenen worden gedragen, evenals een spatbril bij het maken van oplossingen.
1. Voorbereidingen
NOTITIE: De oplossingen en hulpmiddelen die in dit gedeelte worden beschreven, kunnen ruim van tevoren worden gemaakt om te worden gebruikt op de dag van dissectie en opname.
- Bereid Liebovitz-media aangevuld met 10 mM HEPES (L-15-oplossing). De volgende stappen beschrijven het maken van 1 L L-15 oplossing.
- Giet 990 ml gedeïoniseerd H2O in een bekerglas. Meet 2,386 g (10 mM) HEPES af en voeg deze toe. Voeg een fles van 1 L L-15 oplossingspoeder toe.
LET OP: L-15 in poedervorm is langer houdbaar en neemt minder opslagruimte in beslag. U kunt ook L-15-oplossing kopen en aanvullen met HEPES. De laatste optie heeft ook de mogelijkheid om een fenolvrije oplossing te gebruiken, wat handig is voor fluorescentiebeeldvorming. - Roer de oplossing op een roerplaat. Voeg met behulp van een pH-meter langzaam 1 N natriumhydroxide (NaOH) toe om een pH tussen 7,34 en 7,36 te verkrijgen.
- Voeg gedeïoniseerd H2O toe tot de oplossing een volume van 1.000 ml bereikt. Filtreer de oplossing met behulp van een membraan met een poriegrootte van 0,22 μm.
OPMERKING: L-15-oplossing kan ongeveer 1-2 weken bij 4 °C worden bewaard. Als u L-15 gebruikt op basis van fenolrood, wordt de oplossing roze als deze te basisch is (pH > 7,4) of oranje als deze te zuur is (pH < 7,34).
- Giet 990 ml gedeïoniseerd H2O in een bekerglas. Meet 2,386 g (10 mM) HEPES af en voeg deze toe. Voeg een fles van 1 L L-15 oplossingspoeder toe.
- Bereid het kweekmedium voor vestibulaire ganglionneuronen (VGN's) voor (met modificatie voor SGN's). Volg de onderstaande stappen om 50 ml kweekmedium te maken:
- Voeg minimaal 47,5 ml GluMAX-I toe aan een schoon glazen bekerglas.
- Meet en voeg 0,1194 g (10 mM) HEPES toe. Deze extra buffer is bestand tegen pH-veranderingen terwijl de cellen bezinken, voordat ze naar de incubator worden verplaatst.
- Voeg 2,5 ml foetaal runderserum (FBS) toe. Dit maakt 5% van het volume FBS in een totaal volume van 50 ml medium. Voor SGN-preparaten wordt 2,5 ml FBS vervangen door 0,5 ml N2- en 1 ml B27-oplossingen.
- Roer de oplossing op een roerplaat. Voeg met behulp van een pH-meter langzaam 1 N NaOH toe om een pH tussen 7,38 en 7,4 te verkrijgen.
- Voeg 0,5 ml penicilline-streptomycine toe. Filtreer de oplossing door een steriel filter van 0,22 μm. Bewaar de oplossing bij 4 °C.
- Breng de kweekmedia ten minste 30 minuten voor gebruik over in een weefselkweekkolf met een geventileerde dop. Plaats de kolf met kweekmedia in een incubator met een CO2 -concentratie van 5% bij 37 °C.
- Bereid de interne oplossing met geperforeerde pleister voor
OPMERKING: Hier wordt 100 ml interne oplossing met geperforeerde pleister gebruikt voor opname van hele cellen (recept is samengevat in tabel 1). Deze oplossingen kunnen ruim van tevoren worden bereid en bij -20 °C worden bewaard. Aliquots kunnen voor onbepaalde tijd bij -20 °C worden bewaard als ze geen herhaalde cyclus van invriezen en ontdooien ondergaan.- Maak en bewaar tot 6 maanden van tevoren voorraadoplossingen van het volgende: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydraat) en 0,5 M CaCl2. Bewaren in luchtdichte flessen tot 6 maanden bij 4 °C.
OPMERKING: Het is een goed idee om de osmolaliteit van de voorraadoplossingen te controleren (2.000 mOsm voor de 1 M KCl-voorraadoplossing; 1.500 mOsm voor de Mg2Cl- en CaCl2-oplossingen ) om er zeker van te zijn dat de streefconcentratie wordt bereikt. Niet gebruiken als de oplossing troebel wordt of neerslag vormt. Dit kan een mogelijk pauzepunt zijn.
- Maak en bewaar tot 6 maanden van tevoren voorraadoplossingen van het volgende: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydraat) en 0,5 M CaCl2. Bewaren in luchtdichte flessen tot 6 maanden bij 4 °C.
- Volg op de dag van het maken van de interne oplossing de onderstaande stappen met behulp van de voorraadoplossingen uit stap 1.3.
- Meet 100 ml milli-Q (MQ)H2O af. Trek 40 ml uit de 100 ml en zet apart in een schoon bekerglas.
- Voeg de resterende 60 ml H2O toe aan een schoon en steriel bekerglas van 100 ml. Voeg 2,5 ml 1 M KCl, 1 ml 0,5 M Mg2Cl-hexahydraat en 0,02 ml 0,5 M CaCl2 toe.
- Voeg een roerstaaf toe en plaats het bekerglas op een roerschaal. Roer tot het volledig is opgelost. Voeg 1.307 g K2SO4 toe. Roer tot de K2SO4 is opgelost.
- Weeg 0,1192 g HEPES af (streefwaarde 5 mM in een eindvolume van 100 ml) en voeg toe aan de oplossing. Roer tot het is opgelost.
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle componenten volledig zijn opgelost, aangezien het soms even duurt voordat de K2SO4 is opgelost. - Weeg 0,1902 g ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA) af (streefwaarde 5 mM in een eindvolume van 100 ml) en voeg toe aan de oplossing. Omdat EGTA niet volledig oplost in een zure oplossing, plaatst u het bekerglas op een roerplaat en plaatst u de pH-sonde.
- Titreer al roerend langzaam 1 M KOH totdat de EGTA volledig is opgelost. Verwacht dat dit gebeurt wanneer de pH tussen 6 en 7 ligt. Blijf langzaam KOH toevoegen tot de uiteindelijke pH 7,35 is (ongeveer 1,2 tot 1,3 ml KOH in totaal).
- Voeg MQH2O toe om de oplossing tot een eindvolume van 100 ml te brengen en roer. Controleer de osmolaliteit van de oplossing (streefwaarde 270 mOsm/kg voor de geperforeerde patchoplossing) met een osmometer.
- Filtreer de interne oplossing met geperforeerde pleister met behulp van een steriel filter van 0,22 μm. Bewaren in aliquots van 5 ml bij -20 °C. Gebruik een nieuw aliquot voor elke nieuwe opnamesessie.
OPMERKING: Dit kan een mogelijk pauzepunt zijn.
2. Trituratiepipetten fabriceren
OPMERKING: Trituratiepipetten kunnen voor meerdere experimenten worden hergebruikt. Spoel de pipetten voor elk gebruik met ethanol, water en L-15-oplossing en reinig ze na elk gebruik met water en ethanol. Zorgvuldig bewaren tussen gebruik.
- Om trituratiepipetten voor te bereiden op celdissociatie, houdt u een glazen pasteurpipet tegen de vlam van een bunsenbrander. Zodra de glazen punt begint te smelten, rekt u het glas uit tot de gewenste diameter van de punt. Trek het ene uiteinde van de pipet weg van de vlam om een kleine bocht te maken.
- Breng de gebogen pipet in de buurt van een microscoop. Snijd en breek het glas met behulp van een scoretegel op de gewenste diameter.
- Haal de punt van de pipet over de bovenkant van de vlam van de bunsenbrander. Hierdoor worden de ruwe randen bij de punt snel gepolijst. Controleer of de punt niet door de vlam wordt afgesloten.
- Herhaal het proces totdat er vier of vijf pipetten met verschillende groottes zijn voorbereid.
3. Patchpipetten fabriceren
OPMERKING: Bereid een set patchpipetten voor de opnamesessie, maar na gangliondissectie en kweek. Hoewel elektroden die tijdens de opnamesessie één voor één worden gemaakt, optimaal presteren, is er redelijk succes geboekt wanneer deze de avond ervoor als batch worden gemaakt. Bewaar de pipetten in een afgedekte glazen container om de tips tegen stof te beschermen.
- Gebruik een verticale elektrodetrekker en filamentpipetten met een buitendiameter van 1,5 mm/een binnendiameter van 1,17 mm. Zorg ervoor dat het glas altijd vrij wordt gehouden van stof en vingerafdrukken.
- Trek 8-10 opnamepipetten met behulp van een tweestapsprogramma, zoals aanbevolen door de fabrikant voor patchpipetten.
- Inspecteer en polijst elke opnamepipetpunt met een microforge; Warmtepolijsten bevordert een betere afdichting. De weerstand van de doelpipet ligt tussen 4 en 8 MΩ.
- Bewaar de gepolijste pipetten in een afgedekte container. Dit kan worden behandeld als een pauzepunt in het experiment.
OPMERKING: Het optimaliseren van de pipetdiameter om het beoogde weerstandsbereik te bereiken, vereist wat vallen en opstaan met stap 3.2 en 3.3. De meeste commerciële patch-clamp-systemen hebben een ingebouwde membraantestfunctie voor het meten van de elektrodeweerstand in de badoplossing. De weerstand wordt berekend als een verhouding van de steady-state uitgangsstroom als reactie op een toegepaste stapstimulus van 5 mV. De trekinstellingen in stap 3.1 en het polijsten in stap 3.2 moeten eerst met proefpipetten worden ingesteld, totdat de weerstand van de proefpipetten binnen het bereik van 4 tot 8 MΩ valt. - Smeer op de dag van de opname de pipetpunten in om de pipetcapaciteit en het opnamegeluid te verminderen. Wikkel hiervoor een klein strookje paraffinefolie op de schacht van de pipet. Het is niet nodig om helemaal tot aan de punt te wikkelen.
OPMERKING: Een alternatieve strategie is om een siliconenelastomeer op de schacht van de pipet12 te coaten en te verhitten.
4. Extractie van vestibulaire ganglion en plating van vestibulaire neuronen
- Voorbereiding voor dissectie
- Bereid een enzymmengsel van L-15-oplossing met 0,05% collagenase en 0,25% trypsine. Voeg bijvoorbeeld 0,001 g collagenase en 0,005 g trypsine toe aan 2 ml L-15-oplossing in een bekerglas, voeg een kleine magnetische roerder toe en roer tot het volledig gemengd is. Zet opzij bij kamertemperatuur.
- Bereid een commercieel verkregen guillotine voor door keukenpapier opzij en onder de guillotine te leggen om blootstelling van het werkblad en andere oppervlakken aan bloed en andere biologische materialen tot een minimum te beperken.
- Leg een grote roestvrijstalen schaar, een grote pincet en een grote veerschaar neer. Houd een grote spuitfles met 70% ethanol bij de hand voor het reinigen van het hoofd.
- Vul een bekerglas van 100 ml met L-15-oplossing en leg het op ijs. Geef de L-15-oplossing zuurstof.
- Leg de veerschaar, de chirurgische schaar, de pincet, de scalpel en de transferpipet neer (zie Materiaaltabel).
- Zet een petrischaaltje van 60 mm (voor de grove dissectie) en twee petrischaaltjes van 35 mm (voor de reiniging/fijne dissectie van de ganglia) klaar. Vul de schaal van 60 mm met zuurstofrijke L-15-oplossing met behulp van een spuit van 30 ml met een filtertip van 0,22 μm.
- Euthanasie, hoofdreiniging en hemisectie
- Weeg de jongen om de juiste dosering van fatale-plus-verdunning te berekenen om intraperitoneaal toe te dienen (~0,01 ml per 10 g).
- Zodra een diep niveau van anesthesie is bereikt, zoals beoordeeld door een gebrek aan reactie op de teenknijp, onthoofdt u met behulp van de guillotine.
- Spoel de kop grondig met 70% ethanol en vervolgens grondig met L-15-oplossing.
- Verwijder de huid volledig van de schedel. Snijd het hoofd in tweeën met een grote veerschaar door te beginnen bij de ingang van het ruggenmerg naar de hersenen en twee sneden te maken, de eerste door de bovenkant van de schedel en de tweede door de onderkant van de kaak. Voltooi het doorsnijden van het hoofd met een chirurgische schaar.
- Plaats beide helften van het hoofd met de hersenen naar beneden in een petrischaal van 60 mm gevuld met L-15-oplossing. Plaats het verse weefsel dat momenteel niet wordt ontleed op ijs.
- Extractie van het superieure vestibulaire ganglion
- Schep de hersenen eruit met een gesloten chirurgische schaar. Snijd en verwijder de hersenzenuw om de hersenen volledig los te maken van de schedel.
OPMERKING: Op dit punt moet het otische kapsel (in de vorm van het cijfer 8) zichtbaar zijn aan de achterkant van het hoofd. - Gebruik een pincet en begin aan de achterkant van het hoofd om vliezig materiaal eraf te trekken.
- Knip de bovenkant van de schedel uit met een chirurgische schaar. Verwijder overtollig weefsel van de achterkant van het hoofd en de nek om het dissectiegebied en het otische kapsel schoner en gemakkelijker toegankelijk te maken.
NOTITIE: Maak het gerecht niet te troebel door overtollig weefsel tijdens de procedure weg te gooien. - Breng het weefsel over in een tweede petrischaal met verse L-15-oplossing. Lokaliseer het otische kapsel en de auditieve, superieure vestibulaire en inferieure vestibulaire zenuwen. Knip de gehoorzenuw weg en scheid de superieure en inferieure ganglia met een kleine veerschaar.
OPMERKING: Hoewel de somata van de vestibulaire zenuw worden aangetroffen in zowel de inferieure (dunnere) als superieure (dikkere) ganglia, hebben cellen die uit het superieure ganglion worden geëxtraheerd een betere overleving. - Scheer met een scalpel voorzichtig de benige rand af om het benige gebied te verzwakken, waaronder de zenuw in het benige kapsel duikt. Verwijder voorzichtig vuil met een fijne pincet, waarbij het hele gezwollen deel van het ganglion bloot komt te liggen.
- Gebruik de fijne veerschaar om het ganglion te knippen en te scheiden van de perifere zenuwtak die naar de utrikel duikt.
- Verwijder het superieure ganglion met een fijne pincet en zorg ervoor dat u niet te dicht bij het ganglionweefsel knijpt. Breng over naar een petrischaal van 35 mm met verse L-15-oplossing.
- Verwarm de enzymoplossing voor voordat u verder gaat: giet het enzymmengsel in een petrischaal van 35 mm en plaats het gedurende 10-15 minuten in een incubator van 37 °C.
- Reinig het ganglion met een fijne pincet en een kleine veerschaar door bot (dat wit en gekristalliseerd van structuur lijkt), overtollig weefsel, zenuwvezels en andere overbodige structuren te verwijderen. Zorg ervoor dat u het verwijderen van ganglionweefsel tot een minimum beperkt.
- Schep de hersenen eruit met een gesloten chirurgische schaar. Snijd en verwijder de hersenzenuw om de hersenen volledig los te maken van de schedel.
- Weefseldissociatie en plating
- Breng de gereinigde ganglia over in de voorverwarmde enzymoplossing en plaats deze 10 tot 40 minuten terug in de incubator. De enzymbehandeling is voltooid zodra het weefsel uit elkaar begint te vallen, maar heel blijft. Overbehandeling van het weefsel met enzymen zal resulteren in volledige oplossing van de ganglia vóór trituratie.
OPMERKING: De hoeveelheid tijd dat het weefsel een enzymatische behandeling ondergaat, hangt af van de leeftijd van het dier. Ganglia van P9-ratten worden bijvoorbeeld gedurende 25 minuten met enzym behandeld en ganglia van P15-ratten worden gedurende 35 minuten met enzym behandeld. - Breng de ganglia over naar de petrischaal van 35 mm met verse L-15-oplossing en incubeer gedurende 2-3 min.
- Breng de ganglia over in een andere petrischaal van 35 mm, gevuld met gefilterde voedingsmedia.
- Gebruik een micropipet van 200 μl om een druppel van ~150 μl gefilterde kweekmedia op een gecoate schaal met glazen bodem te pipetteren. Voeg niet te veel oplossing toe, want het is belangrijk om de oppervlaktespanning op peil te houden om een bel van oplossing te vormen die over het glazen dekglaasje achterblijft.
- Breng het gewenste aantal ganglia (één tot vier) over op het dekglaasje.
- Zuig een kleine hoeveelheid kweekmedium uit het kweekschaaltje om de trituratiepipet met medium te spoelen om te voorkomen dat het weefsel aan de zijkanten van de glazen pipet blijft plakken. Tritureer door het weefsel voorzichtig en herhaaldelijk door de pipet te halen totdat de ganglia voldoende gedissocieerd zijn.
OPMERKING: Overbelast het weefsel niet om eencellige suspensies te proberen en laat de cellen niet op de bodem van de schaal botsen met overmatige positieve druk. Vermijd ook het vormen van luchtbellen, omdat dit de overleving van de cellen zal verminderen. Zachte trituratie is de sleutel tot het bereiken van succesvolle celoverleving. - Laat de cellen 5 minuten rusten. Controleer onder een lichtmicroscoop of de cellen zich op het dekglaasje hebben genesteld.
- Plaats een kweekschaal voorzichtig in een incubator van 37 °C gedurende 12-24 uur. Nogmaals, zorg ervoor dat de bel van de oplossing intact blijft.
OPMERKING: Als u langer dan 24 uur kweekt, ververs dan dagelijks de kweekmedia. Dit kan een mogelijk pauzepunt zijn.
- Breng de gereinigde ganglia over in de voorverwarmde enzymoplossing en plaats deze 10 tot 40 minuten terug in de incubator. De enzymbehandeling is voltooid zodra het weefsel uit elkaar begint te vallen, maar heel blijft. Overbehandeling van het weefsel met enzymen zal resulteren in volledige oplossing van de ganglia vóór trituratie.
- Beplating SGN's
- Volg de stappen 4.2.1 tot en met 4.2.5 van de instructies voor vestibulaire ganglion om de kop in tweeën te snijden.
- Lokaliseer het otische kapsel (in de vorm van het getal 8) en haal het uit de schedel door de randen weg te hakken met een stompe pincet.
- Verander de L-15 oplossing. Het spiraalvormige gedeelte van het otische kapsel herbergt het slakkenhuis met het orgaan van Corti. Breek het bot weg dat boven de cochleaire bochten ligt zonder het onderliggende weefsel te beschadigen, met een fijne pincet evenwijdig aan de kromming van het bot.
- Zodra er genoeg bot is verwijderd om de volledige omvang van de cochleaire windingen te onthullen, gebruikt u een kleine veerschaar om de modiolus (dik, wit, vezelig weefsel met centrale axonen van SGN's) aan de basis van het slakkenhuis door te snijden om het te bevrijden van de rest van het otische kapsel.
- Verwijder de stria vascularis door met een fijne pincet in de stria aan de basis te knijpen. Wikkel rond de spiraal en tot aan de top om deze los te pellen van het orgaan van Corti.
- Knip het orgaan van Corti in twee of drie windingen met een kleine veerschaar, zodat het plat ligt.
- Snijd de modiolus van elke beurt af met een kleine veerschaar.
- Verwijder het spiraalvormige ganglion door te snijden aan de rand van waar SGN-vezelbanen uitsteken in de richting van de haarcellen.
- Reinig het ganglion met een fijne pincet door bot (dat wit en gekristalliseerd van structuur lijkt), de modiolus (die wit en vezelig lijkt) en andere overbodige structuren te verwijderen. Zorg ervoor dat u het verwijderen van ganglionweefsel tot een minimum beperkt.
- Volg dezelfde procedure als voor de enzymatische behandeling van het spiraalvormige ganglion als gebruikt voor het vestibulaire ganglion in rubriek 4.4. Enzymatische tijden zijn doorgaans korter in het spiraalvormige ganglion, dat langwerpiger is dan het vestibulaire ganglion. Gebruik trituratiepipetten met een kleinere diameter voor het spiraalvormige ganglion in vergelijking met het vestibulaire ganglion.
- Tritureer het spiraalvormige ganglion in kweekmedium aangevuld met N2 en B27, aangegeven in het recept voor kweekmedia.
- Plaats de kweekschaal met de gedissocieerde ganglia gedurende 12-24 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. Opname
OPMERKING: Bij deze procedure worden patch-clamp-opnames van het geïsoleerde ganglion doorgaans 12-24 uur na de beplating uitgevoerd. Andere laboratoria hebben resultaten gerapporteerd van neuronen na veel langere perioden in cultuur10.
- Bereid de opnamekamer voor
- Gebruik de snel verwisselbare opnamekamer (of gelijkwaardig) die patch-clamp-opnames rechtstreeks in de kweekschaal mogelijk maakt. Plaats de kamer op de omgekeerde microscoop.
- Plaats de kweekschalen met glazen bodem in de kamer.
- Voer de L-15-oplossing via een perfusieslangsysteem naar de opnamekamer. Stabiliseer de in- en uitstroom van de perfusie in de kamer met een snelheid van 0,5-1 ml per minuut.
- Bereid de interne oplossing voor op het laden van elektroden
- Ontdooi een aliquot van de interne oplossing met geperforeerde patch. Breng 2,5 ml van de oplossing aan op een kweekschaal van 35 mm. Plaats het deksel terug op de kweekschaal en label als "Tip Dip". Zet opzij in een stofvrije zone, want het is erg belangrijk om deze oplossing zo schoon mogelijk te houden.
- Weeg 1 mg amfotericine-B af en voeg 20 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe. Draai en draai de oplossing naar beneden totdat alle amfotericine-B in de oplossing zit. Voeg 10 μL van de DMSO/amfotericine-B-oplossing toe aan de resterende 2 ml van de ontdooide interne oplossing met geperforeerde pleister. Zuig de oplossing twee of drie keer op en verdrijf deze met een pipet om ervoor te zorgen dat de DMSO/amfotericine-B gelijkmatig in de interne oplossing is gemengd. De oplossing heeft een licht-gelige tint.
- Zuig de amfotericine-B geperforeerde pleister inwendige oplossing op in een spuit van 3 ml. Voeg een tuit van 34 G toe aan de spuit. Wikkel de spuit in aluminiumfolie en bewaar de spuit op ijs.
OPMERKING: Deze oplossing moet elke 2 uur opnieuw worden gemaakt om de effectiviteit van amfotericine-B bij het perforeren van het celmembraan te garanderen. Amfotericine-B is lichtgevoelig en moet tegen licht worden afgeschermd met aluminiumfolie of andere methoden.
- Patch-clamp opnames
- Visualiseer de neuronen met behulp van een 10x of 20x objectief. Pas de verlichting aan en optimaliseer de optiek om de grenzen en schaduwen rond de cel te zien.
- Controleer de kwaliteit van de geïsoleerde neuronen. Probeer alleen neuronen met gladde en gelijkmatige oppervlakken die niet te sterk contrasteren en alleen kleine, verspreide kraters hebben. Zorg er ook voor dat u paren neuronen, neuronen omgeven door puin of andere cellen vermijdt.
- Identificeer bij een vergroting van 100x een neuron of veld van neuronen om te patchen en ze in het midden van het gezichtsveld uit te lijnen.
- Vul de punt van de pipet met een schone oplossing die geen amfotericine bevat door de punt (gedurende ~20 s) in de schone oplossing te dopen die in een kweekschaal is geplaatst. Door de capillaire werking wordt een kleine hoeveelheid oplossing in de punt getrokken.
NOTITIE: Voer deze stap uit onder een stereodissectiemicroscoop, waarmee kan worden bepaald hoe goed de punt de Tip Dip-oplossing vasthoudt. Als de oplossing ~10-20 s niet standhoudt, is de vorm van de elektrode niet ideaal. Configureer in dit geval het programma voor het trekken van de elektrode opnieuw om een langere punt te produceren. - Vul vervolgens de achterkant van de pipet met de inwendige oplossing die amfotericine bevat. Het filament in de pipet zal de oplossing naar beneden trekken om de schone oplossing in de punt te ontmoeten. Laat het filament de oplossing soepel naar beneden trekken en probeer geen luchtbellen eruit te tikken, omdat dit de amfotericine te snel naar de punt zal dwingen.
- Gebruik een spuit om de oplossing op te zuigen die zich helemaal aan de achterkant van de elektrode kan bevinden.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om vanaf dit punt snel te landen en een afdichting met hoge weerstand op de gewenste cel te vormen. - Steek de pipet in de pipethouder. Controleer of de pipet goed in de houder zit om te voorkomen dat de pipet afdrijft. Als de pipet niet stabiel is, vervang dan de afdichtende O-ringen aan de voor- en achterkant van de pipethouder om drift te minimaliseren en een sterke zuigkracht te behouden. Vervang de pipet door een pipet die vers gevuld is.
- Laat de pipet in het bad van de opnamekamer zakken.
- Plaats de pipetpunt in het midden van het gezichtsveld. Zorg ervoor dat de punt vrij is van luchtbellen of ander vuil.
- Pas een spanningsstap (5 mV) toe in de membraantest om de pipetweerstand te controleren. Ga door met het bewaken van de ingangsweerstand gedurende het hele proces van het vormen van een afdichting op de cel.
- Annuleer de pipetoffpotentiaal, zodat de pipetstroom nul aangeeft in de membraantestmodus van pClamp.
- Corrigeer de pipetcapaciteit met behulp van de snelle capaciteitscompensatiefunctie op de patch-clamp versterker (Cp snelle draaiknoppen in het Multiclamp Commander soft panel).
- Beweeg de pipet naar beneden naar de cel.
- Zodra de pipet dicht genoeg bij het neuron is, schakelt u over naar het objectief met een hogere vergroting en stuurt u het beeld via een camera naar een monitor (gebruik een 40x objectief, totale vergroting van 400x). Pas de pipet aan en centreer het neuron opnieuw.
- Plaats de opname-elektrode dicht bij de soma. Lokaliseer het midden van het neuron op de monitor en plaats de opname-elektrode boven het neuron.
- Benader het neuron van bovenaf, zodat de elektrode in het midden van de bolvormige cel terechtkomt. Stel de pipetoffset in op nul van de constante DC-potentialen in het systeem.
- Plaats de pipet dicht bij het membraan. Land stevig op het midden van de cel.
OPMERKING: Bij de landing zal een klein kuiltje in het oppervlak van het neuron en een verdubbeling/verdrievoudiging van de ingangsweerstand optreden. - Oefen negatieve druk (zuigen) uit met behulp van een spuit of mondpipet. Schakel het houdpotentiaal van -60 mV in. De weerstand van de afdichting moet toenemen totdat deze een giga-ohm passeert.
OPMERKING: Werk snel om de tijd tussen het vullen van een elektrode en het landen op een cel te verkorten. Er is een beperkte tijd voordat de amfotericine die in stap 5.3.5 aan de interne oplossing met geperforeerde pleister is toegevoegd, de punt van de elektrode bereikt. Zodra de punt is verontreinigd met amfotericine, is het moeilijk om afdichtingen met een hoge weerstand te vormen en de weerstand bereikt vaak een plateau tot ~ 200 megaohm. - Zodra zich een giga-ohm-afdichting vormt, laat u de onderdruk los. Zodra de afdichting zich vormt, past u snelle capaciteitscompensatie toe om de amplitude van de pipetcapaciteitstransiënten in de membraantestmodus zoveel mogelijk te beperken.
- Als amfotericine begint te werken, kijk dan hoe de ingangsweerstand langzaam afneemt en de stroom die vloeit als reactie op de 5 mV spanningsstap geleidelijk toeneemt naarmate het amfotericine het membraan binnendringt. Een plotselinge afname van de serieweerstand in plaats van geleidelijke stabilisatie suggereert dat er een spontane breuk is opgetreden.
- Schat de capaciteit van de hele cel en de serieweerstand met behulp van de capacitieve transiënte nulling-functie van de versterker. Documenteer en bewaak de serieweerstand aan het begin van en regelmatig tijdens het experiment.
OPMERKING: Het kan 5-20 minuten duren voordat de serieweerstand is gestabiliseerd, afhankelijk van de grootte van de elektrode en de hoeveelheid schone oplossing die in de pipet wordt gezogen. Voltage-clamp- en stroom-clamp-modi kunnen worden gebruikt zodra de serieweerstand is gestabiliseerd onder 30 megaohm. Zwelling of krimp van de neuronen tijdens de opname wordt soms waargenomen, maar zelden wanneer de osmolariteit en pH van de oplossingen correct zijn aangepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het uitvoeren van spanningsklemprotocollen door families van spanningsstappen toe te passen, onthult de spanningsafhankelijke activering van een verscheidenheid aan verschillende stroomfamilies. Representatieve voorbeelden van stromen van hele cellen die worden opgeroepen door een VGN en aangepast zijn aan de hand van gepubliceerde opnames13 worden weergegeven in figuur 1A,B. Het toepassen van depolariserende spanningen (Figuur 1B) activeert een inwaartse stroom (volgens afspraak negatief) die zeer snel wordt geactiveerd en geïnactiveerd (Figuur 1A). Dit is stereotiep voor de spanningsafhankelijke eigenschappen van natriumkanalen14,15, die voornamelijk de opwaartse slag van actiepotentialen16,17 aansturen. Depolarisatie activeert ook een langdurige en relatief langzaam activerende buitenwaartse stroom die de neerwaartse slag van een actiepotentiaal aandrijft. Farmacologie heeft aangetoond dat deze stromen grotendeels worden gedragen door een verscheidenheid aan kaliumkanalen in VGN's 3,18,19,20,21.
Diepe, langdurige hyperpolariserende spanningen roepen een langzaam activerende inwaartse stroom op die wordt gedragen door hyperpolarisatie-geactiveerde cyclische nucleotide-gated (HCN) kanalen22 (Figuur 1C). De activering van deze stromen kan worden bestudeerd met behulp van het staartstroomprotocol dat wordt weergegeven in figuur 1D. Hier wordt het activeringspercentage van de stroom gepeild door de stroom die tijdens de staartstap vloeit (Itail) uit te zetten als functie van de conditioneringsspanning. De stroom-spanningsactiveringscurve heeft een sigmoïdale vorm (Figuur 1E). Hoewel dit kanaal wordt afgesloten door oplosbare tweede boodschappers zoals cyclisch AMP (cAMP), zijn de activeringscurven die worden gemeten met behulp van de geperforeerde patchconfiguratie stabiel gedurende een lange opname. Daarentegen worden de grootte en het spanningsactiveringsbereik van het kanaal gewijzigd (vermoedelijk als gevolg van het uitspoelen van cytosolische componenten) wanneer de opname wordt gemaakt in de gescheurde patch-configuratie.
Neuronale diversiteit wordt geïllustreerd door het bereik van vuurpatronen die worden opgewekt wanneer stromen in verschillende VGN's en SGN's worden geïnjecteerd (Figuur 2; respectievelijk boven en onder). Sommige neuronen vuren alleen bij het begin van de huidige injectie, terwijl andere meerdere keren vuren. Deze heterogeniteit weerspiegelt een fundamentele diversiteit in de samenstelling van onderliggende natrium- en kaliumkanalen in zowel VGN's als SGN's 23,24,25.
Figuur 1: Voorbeelden van spanningsklemprotocollen voor het meten van diverse groepen ionische stromen. (A,B) Voorbeeld van stromen van hele cellen (A) geïnduceerd door een reeks spanningsstappen (B). De netto inkomende natriumstromen (negatieve stromen) worden hier geïdentificeerd door hun voorbijgaande activering en inactivatie (gelabelde pijl, Na+). De netto uitgaande stromen (gelabeld pijl, K+, langdurige positieve stromen) worden grotendeels gedragen door kaliumionen en hebben een veel langzamere activerings- en inactiveringskinetiek dan natriumstromen. (C,D) HCN-stromen worden geactiveerd door een familie van langdurige hyperpolariserende spanningen. (E,F) Stabiliteit van de karakterisering van het ionenkanaal in de geperforeerde pleister op verschillende tijdstippen tijdens de opname. De spanningsafhankelijke activeringscurven van HCN-stromen werden gemeten in een geperforeerde-patch-configuratie I. Activeringscurven van HCN-stromen tijdens een gescheurde patch-configuratie (F). Afbeeldingen CF zijn aangepast van13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verschillende vuurpatronen worden opgeroepen door het injecteren van stromen in stappen. (A) Vuurpatronen in vijf vestibulaire ganglion somata. (B) Vuurpatronen in vijf SGN's. (C) Overeenkomstige stroomstappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methoden zijn specifiek voor opnames van geïsoleerde neuronen; Eerdere studies hebben zich gericht op opnames van axonterminals in een semi-intact preparaat. In vergelijking met bestaande terminalopnametechnieken bieden geïsoleerde opnames een superieur ruimteklem- en isopotentiaalgedrag. Bovendien biedt dit protocol toegang tot een bredere steekproef van neuronen, aangezien alleen kelkdragende subpopulaties toegankelijk zijn in semi-intacte opnames van de vestibulaire epitheel. Ten slotte maken geïsoleerde opnames het gebruik van de geperforeerde-patch-techniek mogelijk, die verstoring van het intracellulaire milieu voorkomt die vaak wordt onderbroken door de dialyse tussen de intracellulaire oplossing en cytosol in gescheurde patch-opnames.
Succesvolle opnames zijn in de eerste plaats afhankelijk van de kwaliteit van de geïsoleerde en gekweekte somata. Een cruciale stap in de overleving van cellen is de kracht die tijdens de trituratie nodig is om de geïsoleerde neuronen te produceren. Een zachte hand is van vitaal belang voor het overleven van cellen. Trituratiepipetten moeten hoog in de bel van de L-15-oplossing worden geplaatst om te voorkomen dat neuronen met kracht op de bodem van de schaal worden verdreven. Als er problemen met de celoverleving optreden, moet ook extra aandacht worden besteed aan het voorkomen van de vorming van luchtbellen of het breken van de oplossingsbel, waardoor wordt voorkomen dat de gedissocieerde cellen zich op het dekglaasje nestelen. Het is ook het beste om door warmte gepolijste trituratiepipetten in verschillende maten beschikbaar te hebben, zodat onderzoekers de flexibiliteit hebben om er een te kiezen met een zodanige diameter dat het ganglion een milde weerstand ervaart wanneer het door de pipet gaat. Door de pipetten met warmte te polijsten, wordt schade die wordt veroorzaakt door het ganglion over ruwe randen van glas te halen. Het achterlaten van een ruw randje lijkt in eerste instantie misschien effectiever in het opbreken van de ganglia, maar deze aanpak beschadigt de somata en vermindert de overleving na de periode in cultuur. Een laatste advies is om angstvallig te zorgen voor een succesvolle trituratiepipet.
Een andere factor die cruciaal is voor de overleving van cellen is de duur van de behandeling met verteringsenzymen. Bij het bepalen van de enzymtijd moeten onderzoekers de tijd zorgvuldig aanpassen om ervoor te zorgen dat het weefsel goed uiteenvalt, maar niet zozeer dat het de overleving van de cel beïnvloedt. We vinden dat de impact van enzymatische behandeling op de overleving van cellen en de eigenschappen van ionkanalen minimaal is, aangezien gegevens verzameld van met enzymen behandelde cellen consistent lijken te zijn met andere methoden die niet op deze benadering berusten19,26. Hoewel enzymatische behandeling de kracht minimaliseert die nodig is om te tritureren, heeft het de beperking dat het bekend is dat enzymatische vertering (met name op basis van trypsine alleen of papaïne) schade aan ionkanalen veroorzaakt27. Dus, hoewel we enkele richtlijnen aanbevelen voor enzymtiming, afhankelijk van de leeftijd van het dier, is het het beste om bereid te zijn om de tijd aan te passen op basis van de resultaten. Ten slotte moedigen we een 'less is more'-benadering van trituratie aan. Dit betekent dat je weerstand moet bieden aan de drang om een eencellige suspensie te vormen en de trituratie na drie of vier passages moet stoppen, zelfs als er nog meerdere grote stukken weefsel over zijn.
Een voordeel van kweken is dat het het somatische celmembraan lijkt te reinigen en het afstoten van de myelinevormende gliacellen bevordert, wat vervolgens een succesvollere klemming van de neuronen mogelijk maakt. Het geïsoleerde en gekweekte ganglionpreparaat is dus vooral nuttig voor het verlengen van patch-clamp-opnames na de 1e postnatale week, waarna de cellichamen geleidelijk bedekt raken met myeline, waardoor de patch-clamp-elektrode wordt belemmerd. Ionkanaalactiviteit waargenomen in patch-clamp-opnames van geïsoleerde plus kortdurende gekweekte (<24 uur) VGN's na de 2e postnatale week zijn consistent met zonale en rijpingsveranderingen in ionkanaalexpressie gezien door immunohistochemie en directe opnames van kelkterminals in vestibulaire epitheel28,29. Er moet echter worden opgemerkt dat langdurige kweek met behulp van neurotrofe factoren en antibiotica ook ionenkanalen kan beïnvloeden 30,31,32,33,34. Bij elke toepassing van deze technieken moet zorgvuldig rekening worden gehouden met de impact van deze factoren op de onderliggende biofysica van de neuronen en hun ionkanalen 30,31,32,33,34.
Over het algemeen zijn patch-clamp-opnames van geïsoleerde en gekweekte somata geschikt voor het bestuderen van diversiteit in de ionkanaaleigenschappen van neuronen in het binnenoor. De stabiliteit op lange termijn van de configuratie van de geperforeerde pleister is vooral geschikt voor het bestuderen van ionkanalen zoals HCN, waarvan de activeringseigenschappen onderhevig zijn aan modulatie via cytosolische tweede boodschappers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Acknowledgments
We erkennen Drs. Jing Bing Xue en Ruth Anne Eatock voor hun vroege bijdragen aan deze methoden. Dit werk werd ondersteund door NIH NIDCD R03 DC012652 en NIH NIDCD DC012653S, en R01 DC0155512 naar RK en T32 DC009975 naar DB, NN en KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
