Summary
São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.
Abstract
A morfologia compacta dos neurônios ganglionares isolados e cultivados da orelha interna permite caracterizações detalhadas dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que contribuem para a diversidade celular nesta população. Este protocolo descreve os passos necessários para o sucesso da dissecação, dissociação e cultura em curto prazo da somata de neurônios bipolares da orelha interna para fins de gravações de patch-clamp. Instruções detalhadas para a preparação dos neurônios do gânglio vestibular são fornecidas com as modificações necessárias para o plaqueamento dos neurônios do gânglio espiral. O protocolo inclui instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras na configuração de patch perfurado. Resultados de exemplo que caracterizam os registros de clamp de tensão de correntes mediadas por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) destacam a estabilidade da configuração de gravação de patch perfurado em comparação com a configuração mais padrão de patch rompido. A combinação desses métodos, somata isolada mais registros perfurados de patch-clamp, pode ser usada para estudar processos celulares que requerem registros longos e estáveis e a preservação do meio intracelular, como a sinalização através de receptores acoplados à proteína G.
Introduction
Os neurônios bipolares do nervo vestibulococlear conectam as células ciliadas sensoriais da orelha interna ao tronco encefálico. São os principais portadores de informações sobre sons e movimentos da cabeça; Danos a essas células importantes levam à surdez e distúrbios do equilíbrio. As porções vestibular e auditiva do nervo são compostas, cada uma, por tipos celulares distintos e morfologicamentediversos1,2. No sistema vestibular, duas subpopulações aferentes disparam espontaneamente em intervalos regulares ouirregulares2. Acredita-se que o tempo da espícula aferente reflita uma diversidade subjacente na composição dos canaisiônicos 3,4. No sistema auditivo, existem duas subpopulações principais de neurônios do gânglio espiral (GNG); enquanto os GNC Tipo I entram em contato com células ciliadas internas individuais5, os GNs Tipo II entram em contato com múltiplas células ciliadas externas5. Registros in vitro de culturas semi-intactas e organotípicas sugerem diferenças nas propriedades de membrana dos SGNs Tipo I e TipoII 6,7.
Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores encontrados nos terminais desses neurônios também são encontrados em seus corpos celulares. Dessa forma, culturas do somato vestibular isolado e do gânglio espiral podem ser estudadas in vitro para entender como canais iônicos e receptores de neurotransmissores contribuem para a resposta desses neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares isolados permite registros elétricos de alta qualidade, adequados para a caracterização detalhada de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores de neurotransmissores. O fácil acesso a uma variedade representativa de subtipos de neurônios permite a análise de alto rendimento da diversidade celular.
Este artigo apresenta um método para isolar e cultivar corpos de células ganglionares dissociadas da porção superior do gânglio vestibular em ratos no dia pós-natal (P)9 a P20. Também são apresentadas sugestões para estender esses métodos ao gânglio espiral, além das etapas necessárias para extrair, dissociar e plaquear com sucesso as células ganglionares. Esses métodos são uma evolução daqueles desenvolvidos em publicações de diversos laboratórios8,9,10. Também está incluída neste artigo a orientação para a seleção de células saudáveis para gravações de patch-clamp.
Finalmente, o protocolo descreve o procedimento para o registro de patch-clamp usando a configuração de patch perfurado11. Embora a configuração de patch perfurado seja mais demorada e tecnicamente mais desafiadora do que a configuração de patch rompido mais comum, ela é melhor para manter o meio citoplasmático que permite sessões de gravação longas e estáveis. Os benefícios dessa configuração de gravação são ilustrados aqui através da estabilidade melhorada das correntes catiônicas ativadas por hiperpolarização em remendo-perfurado em relação aos registros de mancha-rompida.
Este protocolo está organizado em cinco seções. As seções 1 a 3 descrevem soluções e ferramentas que podem ser preparadas e armazenadas com antecedência. A seção 4 descreve os passos para dissecar e plaquear os vestibulares e SGNs. A seção 5 descreve os passos para o registro dos neurônios após um período em cultura. Em nossas mãos, a seção 4 e a seção 5 são realizadas durante um período de 2 dias consecutivos.
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Protocol
Todo o uso de animais descrito aqui foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul da Califórnia. Os animais deste protocolo são ratos Long Evans de ambos os sexos com idade P3 a P25 obtidos do Charles River Laboratories, mas estes métodos podem ser aplicados a outras linhagens de roedores. Um jaleco de laboratório e luvas devem ser usados durante todos os procedimentos, bem como óculos de proteção contra respingos ao fazer soluções.
1. Preparações
NOTA: As soluções e ferramentas descritas nesta seção podem ser feitas com bastante antecedência para serem usadas no dia da dissecção e gravação.
- Preparar o meio Liebovitz suplementado com 10 mM HEPES (solução L-15). As etapas a seguir descrevem a fabricação de 1 L de solução L-15.
- Despeje 990 mL de H2O deionizado em um copo. Meça e adicione 2.386 g (10 mM) de HEPES. Adicione um frasco de 1 L de solução de L-15 em pó.
NOTA: O L-15 em pó tem uma vida útil mais longa e ocupa menos espaço de armazenamento. Alternativamente, comprar solução L-15 e suplemento com HEPES. Esta última opção também tem a opção de usar uma solução livre de fenol, que é útil para imagens de fluorescência. - Mexa a solução num prato agitado. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) para obter um pH entre 7,34 e 7,36.
- Adicionar H2O deionizado até que a solução atinja um volume de 1.000 mL. Filtrar a solução utilizando uma membrana de 0,22 μm de tamanho de poros.
NOTA: A solução de L-15 pode ser armazenada a 4 °C durante cerca de 1-2 semanas. Se usar L-15 feito com fenol-vermelho, a solução ficará rosa se muito básica (pH > 7,4) ou laranja se muito ácida (pH < 7,34).
- Despeje 990 mL de H2O deionizado em um copo. Meça e adicione 2.386 g (10 mM) de HEPES. Adicione um frasco de 1 L de solução de L-15 em pó.
- Preparar o meio de cultura para neurônios ganglionares vestibulares (GNVs) (com modificação para SGNs). Siga os passos abaixo para fazer 50 mL de meio de cultura:
- Adicionar 47,5 mL de meio essencial mínimo GluMAX-I a um copo de vidro limpo.
- Medir e adicionar 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Este tampão adicional resiste às mudanças de pH enquanto as células se acomodam, antes de serem movidas para a incubadora.
- Adicionar 2,5 mL de soro fetal bovino (SFB). Isso faz 5% em volume FBS em um volume total de 50 mL de meio. Para preparações de SGN, 2,5 mL de FBS são substituídos por 0,5 mL de N2 e 1 mL de soluções B27.
- Mexa a solução num prato agitado. Usando um medidor de pH, adicione lentamente 1 N de NaOH para obter um pH entre 7,38 e 7,4.
- Adicionar 0,5 mL de penicilina-estreptomicina. Filtrar a solução através de um filtro estéril de 0,22 μm. Conservar a solução a 4 °C.
- Pelo menos 30 minutos antes do uso, transferir o meio de cultura para um frasco de cultura de tecidos com tampa ventilada. Colocar o balão com meios de cultura numa estufa com concentração de 5% de CO2 a 37 °C.
- Preparar a solução interna de patch perfurado
NOTA: Aqui, 100 mL de solução interna de remendo perfurado é usado para registro de células inteiras (a receita está resumida na Tabela 1). Estas soluções podem ser preparadas com bastante antecedência e armazenadas a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas indefinidamente a -20 °C se não passarem por um ciclo repetido de congelamento e descongelamento.- Até 6 meses antes do tempo, faça e armazene soluções de estoque das seguintes formas: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahidratado) e 0,5 M CaCl2. Conservar em frascos herméticos até 6 meses a 4 °C.
NOTA: É uma boa ideia verificar a osmolalidade das soluções-estoque (2.000 mOsm para a solução estoque de KCl 1 M; 1.500 mOsm para as soluções de Mg2Cl e CaCl2 ) para garantir que a concentração alvo seja atingida. Não utilize se a solução ficar turva ou se formar precipitados. Este pode ser um possível ponto de pausa.
- Até 6 meses antes do tempo, faça e armazene soluções de estoque das seguintes formas: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahidratado) e 0,5 M CaCl2. Conservar em frascos herméticos até 6 meses a 4 °C.
- No dia da fabricação da solução interna, siga as etapas abaixo usando as soluções de estoque da etapa 1.3.
- Meça 100 mL de milli-Q (MQ)H2O. Retire 40 mL dos 100 mL e reserve em um copo limpo.
- Adicionar os restantes 60 ml de H2O a um copo limpo e estéril de 100 ml. Adicionar 2,5 mL de KCl 1 M, 1 mL de 0,5 M Mg2Cl-hexahidratado e 0,02 mL de CaCl2 0,5 M.
- Adicione uma barra de agitação e coloque o copo em um prato agitado. Mexa até dissolver completamente. Adicionar 1,307 g de K2SO4. Mexa até dissolver o K2SO4 .
- Pesar 0,1192 g de HEPES (alvo de 5 mM num volume final de 100 ml) e adicionar à solução. Mexa até dissolver.
NOTA: Certifique-se de que todos os componentes estão totalmente dissolvidos, pois às vezes leva tempo para o K2SO4 se dissolver. - Pesar 0,1902 g de ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetracético (EGTA) (alvo de 5 mM num volume final de 100 ml) e adicionar à solução. Como o EGTA não se dissolve completamente em uma solução ácida, coloque o copo em uma placa de agitação e insira a sonda de pH.
- Ao mexer, titule lentamente 1 M KOH até que o EGTA se dissolva completamente. Espere que isso ocorra quando o pH estiver entre 6 e 7. Continue a adicionar lentamente KOH até que o pH final seja 7,35 (aproximadamente 1,2 a 1,3 mL de KOH no total).
- Adicione MQH2O para levar a solução a um volume final de 100 mL e mexa. Verifique a osmolalidade da solução (alvo de 270 mOsm/kg para a solução perfurada) com um osmômetro.
- Filtrar a solução interna com adesivo perfurado utilizando um filtro estéril de 0,22 μm. Conservar em alíquotas de 5 ml a -20 °C. Use uma nova alíquota para cada nova sessão de gravação.
Observação : isso pode ser um possível ponto de pausa.
2. Fabricação de pipetas de trituração
NOTA: As pipetas de trituração podem ser reutilizadas para múltiplos experimentos. Lave as pipetas com etanol, água e solução L-15 antes de cada uso e limpe-as com água e etanol após cada uso. Guarde cuidadosamente entre os usos.
- Para preparar pipetas de trituração para dissociação celular, segure uma pipeta de vidro Pasteur na chama de um queimador de Bunsen. Quando a ponta de vidro começar a derreter, estique o vidro até o diâmetro desejado da ponta. Puxe uma extremidade da pipeta para longe da chama para criar uma pequena curva.
- Leve a pipeta dobrada para perto de um microscópio. Usando uma telha de pontuação, marque e quebre o vidro no diâmetro desejado.
- Passe a ponta da pipeta por cima da chama do queimador de Bunsen. Isso irá polir rapidamente as bordas ásperas perto da ponta. Verifique se a ponta não está selada pela chama.
- Repita o processo até que quatro ou cinco pipetas tenham sido preparadas com tamanhos variados.
3. Fabricação de pipetas de remendo
NOTA: Prepare um conjunto de pipetas de remendo antes da sessão de gravação, mas após a dissecção e cultura dos gânglios. Embora os eletrodos que são feitos um de cada vez durante a sessão de gravação sejam ótimos em desempenho, um sucesso razoável foi alcançado quando estes são feitos em lote na noite anterior. Guarde as pipetas em um recipiente de vidro coberto para proteger as pontas da poeira.
- Use um extrator de eletrodo vertical e pipetas de vidro borossilicato filamentado de 1,5 mm de diâmetro externo/1,17 mm de diâmetro interno. Certifique-se de que o vidro é sempre mantido livre de poeira e impressões digitais.
- Puxe de 8 a 10 pipetas de gravação usando um programa de duas etapas, conforme recomendado pelo fabricante para pipetas de patch.
- Inspecionar e polir termicamente cada ponta da pipeta de gravação com uma microforja; O polimento térmico promove uma melhor vedação. A resistência da pipeta alvo está entre 4 e 8 MΩ.
- Guarde as pipetas polidas em um recipiente coberto. Isso pode ser tratado como um ponto de pausa no experimento.
NOTA: Otimizar o diâmetro da pipeta para atingir a faixa de resistência alvo requer algumas tentativas e erros com as etapas 3.2 e 3.3. A maioria dos sistemas comerciais de patch-clamp tem um recurso de teste de membrana embutido para medir a resistência do eletrodo na solução de banho. A resistência é calculada como uma razão da corrente de saída em estado estacionário em resposta a um estímulo de passo aplicado de 5 mV. As regulagens de tracção no passo 3.1 e o polimento no passo 3.2 devem primeiro ser ajustados utilizando pipetas de ensaio, até que a resistência das pipetas de ensaio se situe dentro da gama de 4 a 8 MΩ. - No dia da gravação, cubra as pontas da pipeta para reduzir a capacitância da pipeta e o ruído de gravação. Para isso, enrole uma pequena tira de filme de parafina no eixo da pipeta. Não é necessário enrolar até a ponta.
NOTA: Uma estratégia alternativa é revestir e aquecer um elastômero de silicone no eixo da pipeta12.
4. Extração do gânglio vestibular e plaqueamento dos neurônios vestibulares
- Preparo para dissecção
- Preparar uma mistura enzimática de solução L-15 com colagenase a 0,05% e tripsina a 0,25%. Por exemplo, adicione 0,001 g de colagenase e 0,005 g de tripsina a 2 mL de solução de L-15 em um copo, adicione um pequeno agitador magnético e mexa até ficar totalmente misturado. Reserve à temperatura ambiente.
- Prepare uma guilhotina obtida comercialmente colocando toalhas de papel ao lado e embaixo da guilhotina para minimizar a exposição da bancada e outras superfícies ao sangue e outros materiais biológicos.
- Coloque tesouras grandes de aço inoxidável, pinças grandes e tesouras de mola grandes. Mantenha um borrifador grande com etanol 70% à mão para a limpeza da cabeça.
- Encha um copo de 100 mL com solução de L-15 e coloque no gelo. Oxigenar a solução L-15.
- Coloque a tesoura de mola, tesoura cirúrgica, pinça, bisturi e pipeta de transferência (consulte Tabela de Materiais).
- Prepare uma placa de Petri de 60 mm (para a dissecção grosseira) e duas placas de Petri de 35 mm (para a limpeza/dissecção fina dos gânglios). Encher a placa de 60 mm com solução oxigenada de L-15 usando uma seringa de 30 mL com uma ponta de filtro de 0,22 μm.
- Eutanásia, limpeza da cabeça e hemissecção
- Pesar os filhotes para calcular a dose apropriada de diluição fatal-plus para administrar por via intraperitoneal (~0,01 mL por 10 g).
- Uma vez atingido um plano profundo de anestesia, avaliado pela falta de resposta ao pinçamento do dedo, decapitar com a guilhotina.
- Enxaguar bem a cabeça com etanol a 70% e, em seguida, completamente com solução de L-15.
- Remova completamente a pele do crânio. Separe a cabeça usando uma tesoura de mola grande, começando no ponto de entrada da medula espinhal para o cérebro e fazendo dois cortes, o primeiro cortando a parte superior do crânio e o segundo através da parte inferior da mandíbula. Termine de bissetriz da cabeça usando tesoura cirúrgica.
- Coloque as duas metades do cérebro da cabeça de lado para baixo em uma placa de Petri de 60 mm cheia com solução de L-15. Colocar o tecido fresco que não está sendo dissecado no gelo.
- Extração do gânglio vestibular superior
- Retirar o cérebro usando uma tesoura cirúrgica fechada. Sever e remover o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio.
NOTA: Neste ponto, a cápsula ótica (em forma de número 8) deve ser visível na parte de trás da cabeça. - Usando pinças e começando na parte de trás da cabeça, puxe o material membranoso claro.
- Corte a parte superior do crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remova o excesso de tecido da parte de trás da cabeça e pescoço para tornar a área de dissecção e a cápsula ótica mais limpas e fáceis de acessar.
OBS: Evite deixar o prato muito turvo, descartando o excesso de tecido durante todo o procedimento. - Transfira o tecido para uma segunda placa de Petri com solução fresca de L-15. Localizar a cápsula ótica e os nervos auditivo, vestibular superior e vestibular inferior. Cortar o nervo auditivo e separar os gânglios superior e inferior usando uma pequena tesoura de mola.
OBS: Embora os somatas do nervo vestibular sejam encontrados tanto nos gânglios inferior (mais fino) quanto superior (mais espesso), as células extraídas do gânglio superior têm melhor sobrevida. - Usando um bisturi, raspe suavemente a crista óssea para enfraquecer a área óssea, sob a qual o nervo mergulha na cápsula óssea. Remova cuidadosamente os detritos com pinças finas, expondo toda a porção inchada do gânglio.
- Use a tesoura fina de mola para cortar e separar o gânglio do ramo nervoso periférico que está mergulhando em direção ao utrículo.
- Remova o gânglio superior usando pinça fina, certificando-se de não beliscar muito perto do tecido ganglionar. Transfira para uma placa de Petri de 35 mm com solução fresca de L-15.
- Antes de prosseguir, pré-aqueça a solução enzimática: despeje a mistura enzimática em uma placa de Petri de 35 mm e coloque em uma incubadora de 37 °C por 10-15 min.
- Limpe o gânglio usando pinças finas e pequenas tesouras de mola, removendo o osso (que parece branco e cristalizado na estrutura), excesso de tecido, fibras nervosas e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
- Retirar o cérebro usando uma tesoura cirúrgica fechada. Sever e remover o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio.
- Dissociação tecidual e plaqueamento
- Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-a de volta na incubadora por 10 a 40 min. O tratamento enzimático é concluído quando o tecido começa a se separar, mas permanece em um pedaço. O tratamento excessivo do tecido com enzimas resultará na dissolução completa dos gânglios antes da trituração.
OBS: O tempo que o tecido passa por tratamento enzimático depende da idade do animal. Por exemplo, os gânglios de ratos P9 são tratados com enzima por 25 min, e os gânglios de ratos P15 são tratados com enzima por 35 min. - Transfira os gânglios para a placa de Petri de 35 mm com solução fresca de L-15 e incube por 2-3 min.
- Transfira os gânglios para outra placa de Petri de 35 mm preenchida com meios de cultura filtrados.
- Usando uma micropipeta de 200 μL, pipetar uma gota de ~150 μL de meio de cultura filtrado em um prato de fundo de vidro revestido. Não adicione muita solução, pois é importante manter a tensão superficial para formar uma bolha de solução que permanece sobre a tampa de vidro.
- Transfira o número desejado de gânglios (um a quatro) para a lamínula.
- Retirar uma pequena quantidade de meio de cultura da placa de cultura para enxaguar a pipeta de trituração com meio para evitar que o tecido grude nas laterais da pipeta de vidro. Triturar passando suave e repetidamente o tecido através da pipeta até que os gânglios estejam suficientemente dissociados.
NOTA: Não sobrecarregue o tecido para tentar suspensões de célula única ou permita que as células caiam para o fundo do prato usando pressão positiva excessiva. Além disso, evite formar bolhas de ar, pois isso reduzirá a sobrevivência celular. A trituração suave é a chave para alcançar a sobrevivência celular bem-sucedida. - Deixe as células descansarem por 5 min. Verifique sob um microscópio de luz para ver se as células se acomodaram na lamínula.
- Coloque cuidadosamente um prato de cultura em uma incubadora de 37 °C por 12-24 h. Novamente, certifique-se de manter a bolha de solução intacta.
OBS: Ao cultivar por mais de 24 h, atualize os meios de cultura diariamente. Este pode ser um possível ponto de pausa.
- Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-a de volta na incubadora por 10 a 40 min. O tratamento enzimático é concluído quando o tecido começa a se separar, mas permanece em um pedaço. O tratamento excessivo do tecido com enzimas resultará na dissolução completa dos gânglios antes da trituração.
- Chapeamento SGNs
- Seguir os passos 4.2.1 a 4.2.5 das instruções do gânglio vestibular para bissetriz da cabeça.
- Localize a cápsula ótica (em forma de número 8) e extraia do crânio lascando as bordas usando pinças rombas.
- Troque a solução L-15. A porção espiral da cápsula ótica abriga a cóclea com o órgão de Corti. Lascar o osso que recobre as espiras cocleares sem danificar o tecido subjacente, com pinças finas paralelas à curva do osso.
- Uma vez que o osso tenha sido removido o suficiente para revelar toda a extensão das espiras cocleares, use uma pequena tesoura de mola para cortar o modíolo (tecido fibroso espesso e branco contendo axônios centrais de SGNs) na base da cóclea para liberá-lo do resto da cápsula ótica.
- Remova a estria vascular pinçando a estria na base com pinças finas. Relaxe ao redor da espiral e até o ápice para descascá-la livre do órgão de Corti.
- Corte o órgão de Corti em duas ou três voltas usando uma pequena tesoura de mola para que ele fique plano.
- Excique o modíolo de cada volta com uma pequena tesoura de mola.
- Remova o gânglio espiral cortando na borda de onde os tratos de fibra SGN se projetam em direção às células ciliadas.
- Limpe o gânglio usando pinças finas, removendo o osso (que parece branco e cristalizado na estrutura), o modíolo (que aparece branco e fibroso) e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
- Seguir o mesmo procedimento utilizado para o tratamento enzimaticamente do gânglio espiral utilizado para o gânglio vestibular na secção 4.4. Os tempos enzimáticos são tipicamente mais curtos no gânglio espiral, que é mais alongado do que o gânglio vestibular. Utilizar pipetas de trituração de menor diâmetro para o gânglio espiral em relação ao gânglio vestibular.
- Triturar o gânglio espiral em meio de cultura suplementado com N2 e B27, indicado na receita para meios de cultura.
- Colocar a placa de cultura contendo os gânglios dissociados em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 por 12-24 h.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Gravação
NOTA: Neste procedimento, os registros de patch-clamp do gânglio isolado são tipicamente realizados 12-24 h após o plaqueamento. Outros laboratórios relataram resultados de neurônios após períodos muito mais longos em cultura10.
- Preparar a câmara de gravação
- Use a câmara de gravação de troca rápida (ou equivalente) que permite gravações de patch-clamp diretamente no prato de cultura. Configure a câmara no microscópio invertido.
- Insira as placas de cultura com fundo de vidro na câmara.
- Alimentar a solução L-15 através de um sistema de tubos de perfusão para a câmara de registo. Estabilizar o fluxo de entrada e saída de perfusão na câmara a uma taxa de 0,5-1 mL por minuto.
- Preparar a solução interna para carregar eletrodos
- Descongelar uma alíquota da solução interna do remendo perfurado. Alocar 2,5 mL da solução em uma placa de cultura de 35 mm. Substitua a tampa do prato de cultura e rotule como "Tip Dip". Reserve em uma zona livre de poeira, pois é muito importante manter essa solução o mais limpa possível.
- Pesar 1 mg de anfotericina B e adicionar 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Vórtice e gire a solução até que toda a anfotericina B esteja na solução. Adicionar 10 μL da solução de DMSO/anfotericina B aos 2 mL restantes da solução interna do remendo perfurado descongelado. Retirar e dissipar a solução com uma pipeta duas ou três vezes para garantir que o DMSO/anfotericina B se misturou uniformemente na solução interna. A solução terá um tom leve-amarelado.
- Introduzir a solução interna do adesivo perfurado de anfotericina B numa seringa de 3 ml. Adicione uma ponta de 34 G à seringa. Embrulhe a seringa em papel alumínio e mantenha a seringa no gelo.
NOTA: Esta solução deve ser refeita a cada 2 h para garantir a eficácia da anfotericina B em perfurar a membrana celular. A anfotericina B é sensível à luz e deve ser protegida da luz usando folha de alumínio ou outros métodos.
- Gravações de patch-clamp
- Visualize os neurônios usando uma objetiva de 10x ou 20x. Ajuste a iluminação e otimize a ótica para ver os limites e sombras ao redor da célula.
- Verifique a qualidade dos neurônios isolados. Tente apenas neurônios com superfícies lisas e uniformes que não sejam muito contrastadas e tenham apenas crateras pequenas e dispersas. Além disso, certifique-se de evitar pares de neurônios, neurônios cercados por detritos ou outras células.
- Sob ampliação de 100x, identifique um neurônio ou campo de neurônios para remendá-los e alinhá-los no centro do campo de visão.
- Encha a ponta da pipeta com uma solução limpa que não contenha anfotericina mergulhando a ponta (por ~20 s) na solução limpa que foi colocada em um prato de cultura. A ação capilar atrairá uma pequena quantidade de solução para a ponta.
NOTA: Execute esta etapa sob um microscópio de dissecção estéreo, que permite determinar quão bem a ponta segura a solução Tip Dip. Se a solução não se mantiver por ~10-20 s, a forma do eletrodo não é ideal. Nesse caso, reconfigure o programa de tração de eletrodos para produzir uma ponta mais longa. - Em seguida, encha o dorso da pipeta com a solução interna contendo anfotericina. O filamento dentro da pipeta irá puxar a solução para baixo para encontrar a solução limpa na ponta. Deixe o filamento puxar suavemente a solução para baixo e não tente tocar bolhas, pois isso forçará a anfotericina à ponta muito rápido.
- Use uma seringa para retirar a solução que pode estar na parte de trás do eletrodo.
NOTA: É muito importante trabalhar rápido a partir deste ponto para pousar e formar uma vedação de alta resistência na célula desejada. - Insira a pipeta no suporte da pipeta. Verifique se a pipeta está ajustada no suporte para evitar a deriva da pipeta. Se a pipeta não for estável, troque os anéis de vedação na frente e atrás do suporte da pipeta para minimizar a deriva e manter a sucção forte. Substitua a pipeta por uma recém-cheia.
- Abaixe a pipeta para o banho da câmara de gravação.
- Localize a ponta da pipeta no meio do campo de visão. Certifique-se de que a ponta está livre de bolhas de ar ou outros detritos.
- Aplicar um passo de tensão (5 mV) no teste de membrana para monitorar a resistência da pipeta. Continue monitorando a resistência de entrada durante todo o processo de formação de uma vedação na célula.
- Cancele o potencial de deslocamento da pipeta, de modo que a corrente da pipeta leia zero no modo de teste de membrana do pClamp.
- Corrija a capacitância da pipeta usando a função de compensação rápida de capacitância no amplificador patch-clamp (discadores rápidos Cp no painel macio Multiclamp Commander).
- Mova a pipeta para baixo até a célula.
- Quando a pipeta estiver perto o suficiente do neurônio, mude para a objetiva de ampliação mais alta e envie a imagem através de uma câmera para um monitor (use uma objetiva de 40x, aumento total de 400x). Ajuste a pipeta e recancifique o neurônio.
- Mova o eletrodo de gravação para perto do soma. Localize o centro do neurônio no monitor e posicione o eletrodo de gravação acima do neurônio.
- Aproxime-se do neurônio de cima, de modo que o eletrodo pouse no centro da célula esférica. Ajuste o deslocamento da pipeta para zerar os potenciais DC constantes no sistema.
- Posicione a pipeta próxima à membrana. Pouse firmemente no centro da célula.
NOTA: Ao aterrissar, ocorrerá uma pequena ondulação na superfície do neurônio e uma duplicação/triplicação da resistência de entrada. - Aplicar pressão negativa (sucção) usando uma seringa ou pipeta bucal. Ligue o potencial de retenção de -60 mV. A resistência da vedação deve aumentar até passar um giga-ohm.
NOTA: Trabalhe rápido para reduzir o tempo entre o enchimento de um eletrodo e o pouso em uma célula. O tempo para que a anfotericina adicionada à solução interna do remendo perfurado na etapa 5.3.5 atinja a ponta do eletrodo. Uma vez que a ponta é contaminada com anfotericina, é difícil formar vedações de alta resistência, e a resistência muitas vezes se estabiliza em ~200 megaohms. - Uma vez que uma vedação giga-ohm se forma, libere a pressão negativa. Assim que a vedação se formar, aplique compensação de capacitância rápida para reduzir ao máximo a amplitude dos transientes de capacitância da pipeta no modo de teste de membrana.
- À medida que a anfotericina começa a funcionar, observe como a resistência de entrada diminui lentamente e a corrente que flui em resposta ao passo de tensão de 5 mV aumenta progressivamente à medida que a anfotericina entra na membrana. Uma diminuição súbita da resistência em série, em vez de estabilização gradual, sugere que ocorreu ruptura espontânea.
- Estimar a capacitância de célula inteira e a resistência em série usando a função de anulação transiente capacitiva do amplificador. Documente e monitore a resistência da série no início e regularmente durante o experimento.
NOTA: A resistência em série pode levar de 5 a 20 minutos para estabilizar, dependendo do tamanho do eletrodo e da quantidade de solução limpa que é aspirada para a pipeta. Os modos de fixação de tensão e de fixação de corrente podem ser usados uma vez que a resistência da série tenha se estabilizado abaixo de 30 megaohms. Inchaço ou encolhimento dos neurônios durante o registro às vezes é observado, mas raramente quando a osmolaridade e o pH das soluções são ajustados corretamente.
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Representative Results
A execução de protocolos de fixação de tensão através da aplicação de famílias de passos de tensão revela a ativação dependente de tensão de uma variedade de diferentes famílias de correntes. Exemplos representativos de correntes de células inteiras evocadas a partir de um VGN e adaptadas de registros publicados13 são mostrados na Figura 1A,B. A aplicação de tensões despolarizantes (Figura 1B) ativa uma corrente interna (negativa por convenção) que ativa e inativa muito rapidamente (Figura 1A). Isso é estereotipado para as propriedades dependentes de voltagem dos canais de sódio14,15, que impulsionam principalmente o upstroke dos potenciais de ação16,17. A despolarização também ativa uma corrente externa de ativação prolongada e relativamente lenta que impulsiona o downstroke de um potencial de ação. A farmacologia tem revelado que essas correntes são em grande parte transportadas por uma variedade de canais de potássio em VGNs 3,18,19,20,21.
Tensões hiperpolarizantes profundas e de longa duração evocam uma corrente interna de ativação lenta transportada por canais nucleotídeos cíclicos (HCN) ativados por hiperpolarização22 (Figura 1C). A ativação dessas correntes pode ser estudada utilizando o protocolo de corrente de cauda mostrado na Figura 1D. Aqui, a porcentagem de ativação da corrente é investigada plotando a corrente que flui durante o passo de cauda (Itail) em função da tensão de condicionamento. A curva de ativação corrente-tensão tem forma sigmoidal (Figura 1E). Embora esse canal seja fechado por segundos mensageiros solúveis, como o AMP cíclico (AMPc), as curvas de ativação medidas usando a configuração de patch perfurado são estáveis ao longo de uma longa gravação. Em contraste, o tamanho e a faixa de ativação de voltagem do canal são alterados (presumivelmente devido ao washout de componentes citosólicos) quando o registro é feito na configuração de remendo rompido.
A diversidade neuronal é ilustrada pela gama de padrões de disparo eliciados quando correntes são injetadas em diferentes VGNs e SGNs (Figura 2; superior e inferior, respectivamente). Alguns neurônios disparam apenas no início da injeção atual, enquanto outros disparam várias vezes. Essa heterogeneidade reflete uma diversidade fundamental na composição dos canais subjacentes de sódio e potássio tanto em VGNs quanto em SGNs 23,24,25.
Figura 1: Exemplos de protocolos de tensão de fixação para medição de diversos grupos de correntes iônicas. (A,B) Exemplo de correntes de célula inteira (A) induzidas por uma família de passos de tensão (B). As correntes líquidas de sódio para dentro (correntes negativas) são identificadas aqui por sua ativação e inativação transitórias (seta marcada, Na+). As correntes líquidas de saída (seta marcada, K+, correntes positivas de longa duração) são transportadas em grande parte por íons potássio e têm uma cinética de ativação e inativação muito mais lenta do que as correntes de sódio. (C,D) As correntes HCN são ativadas por uma família de tensões hiperpolarizantes de longa duração. (E,F) Estabilidade da caracterização do canal iônico no patch perfurado em diferentes momentos durante o registro. As curvas de ativação voltagem-dependente das correntes HCN foram medidas em uma configuração de patch perfurado I. Curvas de ativação de correntes de HCN durante uma configuração de patch rompido (F). As imagens C-F foram modificadas de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diversos padrões de disparo são evocados pela injeção de passos de correntes. (A) Padrões de disparo em cinco somamas ganglionares vestibulares. (B) Padrões de disparo em cinco SGNs. (C) Etapas atuais correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos aqui apresentados são específicos para registros de neurônios isolados; Estudos anteriores se concentraram em gravações de terminais de axônio em uma preparação semi-intacta. Quando comparados com as técnicas de gravação de terminais existentes, os registros isolados oferecem um comportamento de pinça espacial e isopotencial superior. Além disso, esse protocolo fornece acesso a uma amostra mais ampla de neurônios, uma vez que apenas subpopulações portadoras de cálice são acessíveis em registros semi-intactos dos epitélios vestibulares. Finalmente, registros isolados permitem o uso da técnica de remendo perfurado, que evita a ruptura do meio intracelular que muitas vezes é interrompida pela diálise entre a solução intracelular e o citosol em registros de patch roto.
Gravações bem-sucedidas dependem primeiro da qualidade dos somatas isolados e cultivados. Uma etapa crítica na sobrevivência celular é a força necessária durante a trituração para produzir os neurônios isolados. Uma mão gentil é vital para a sobrevivência celular. As pipetas de trituração devem ser colocadas no alto da bolha da solução L-15 para evitar a expulsão forçada de neurônios para o fundo do prato. Se surgirem problemas de sobrevivência celular, cuidados extras também devem ser tomados para evitar a formação de bolhas de ar ou na quebra da bolha de solução, o que impede que as células dissociadas se instalem na lamínula. Também é melhor ter pipetas de trituração polidas termicamente disponíveis em uma variedade de tamanhos, para que os pesquisadores tenham a flexibilidade de escolher uma com um diâmetro tal que o gânglio experimente uma leve resistência ao passar pela pipeta. O polimento térmico das pipetas reduz os danos causados pela passagem do gânglio sobre as bordas ásperas do vidro. Deixar uma borda áspera pode inicialmente parecer mais eficaz na ruptura dos gânglios, mas essa abordagem danifica a somata e reduz a sobrevivência após o período em cultura. Um último conselho é proteger com zelo uma pipeta de trituração bem-sucedida.
Outro fator crítico para a sobrevivência celular é a duração do tratamento com enzimas digestoras. Ao determinar o tempo da enzima, os pesquisadores precisam ajustar cuidadosamente o tempo para garantir que o tecido se rompa bem, mas não tanto a ponto de impactar a sobrevivência celular. Verificamos que o impacto do tratamento enzimático na sobrevivência celular e nas propriedades dos canais iônicos é mínimo, uma vez que os dados coletados de células tratadas com enzimas parecem ser consistentes com outros métodos que não dependem dessa abordagem19,26. Embora o tratamento enzimático minimize a força necessária para triturar, ele tem a limitação de que a digestão enzimática (particularmente baseada em tripsina isolada ou papaína) é conhecida por causar danos aos canais iônicos27. Assim, embora recomendemos algumas diretrizes para o tempo enzimático dependendo da idade do animal, é melhor estar preparado para ajustar o tempo com base nos resultados. Por último, encorajamos uma abordagem "menos é mais" à trituração. Isso significa resistir ao impulso de formar uma suspensão de célula única e parar a trituração após três ou quatro passagens, mesmo que haja vários grandes pedaços de tecido restantes.
Uma vantagem da cultura é que ela parece limpar a membrana das células somáticas e promove a eliminação das células gliais formadoras de mielina, o que permite um clampeamento de retalhos mais bem-sucedido dos neurônios. Assim, o preparo do gânglio isolado e cultivado é especialmente útil para estender os registros de patch-clamp para além da 1ª semana pós-natal, após a qual os corpos celulares tornam-se progressivamente cobertos com mielina, impedindo o eletrodo patch-clamp. A atividade dos canais iônicos observada nos registros de patch-clamp de VGNs isolados e cultivados em cultura de curta duração (<24 h) após a 2ª semana pós-natal é consistente com mudanças zonais e maturacionais na expressão dos canais iônicos observadas por imunohistoquímica e registros diretos dos terminais do cálice no epitéliovestibular28,29. Entretanto, deve-se ressaltar que culturas prolongadas auxiliadas por fatores neurotróficos e antibióticos também podem afetar os canais iônicos 30,31,32,33,34. Qualquer aplicação dessas técnicas deve considerar cuidadosamente o impacto desses fatores na biofísica subjacente dos neurônios e seus canais iônicos 30,31,32,33,34.
Em geral, gravações de patch-clamp de somata isolada e cultivada são adequadas para estudar a diversidade nas propriedades dos canais iônicos dos neurônios da orelha interna. A estabilidade a longo prazo da configuração do remendo perfurado é especialmente adequada para o estudo de canais iônicos como o HCN, cujas propriedades de ativação estão sujeitas à modulação via segundos mensageiros citosólicos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos aos Drs. Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock por suas primeiras contribuições a esses métodos. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 para RK e T32 DC009975 para DB, NN e KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
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