Summary
Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.
Abstract
İzole edilmiş ve kültürlenmiş iç kulak ganglion nöronlarının kompakt morfolojisi, bu popülasyondaki hücre çeşitliliğine katkıda bulunan iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonlarına izin verir. Bu protokol, yama-kelepçe kayıtları amacıyla iç kulak bipolar nöronlarının somalarının başarılı bir şekilde diseksiyonu, ayrıştırılması ve kısa süreli kültürlenmesi için gerekli adımları özetlemektedir. Vestibüler ganglion nöronlarının hazırlanması için ayrıntılı talimatlar, spiral ganglion nöronlarının kaplanması için gerekli modifikasyonlarla birlikte sağlanır. Protokol, delikli yama konfigürasyonunda tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) aracılı akımların voltaj-kelepçe kayıtlarını karakterize eden örnek sonuçlar, daha standart yırtılmış yama konfigürasyonuna kıyasla delikli yama kayıt konfigürasyonunun kararlılığını vurgulamaktadır. Bu yöntemlerin kombinasyonu, izole somata artı delikli-yama-kelepçe kayıtları, uzun, kararlı kayıtlar ve G-proteinine bağlı reseptörler aracılığıyla sinyalleme gibi hücre içi ortamın korunmasını gerektiren hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Vestibülokoklear sinirin bipolar nöronları, iç kulağın duyusal tüy hücrelerini beyin sapına bağlar. Ses ve kafa hareketleri hakkında temel bilgi taşıyıcılarıdır; Bu önemli hücrelerin zarar görmesi sağırlık ve denge bozukluklarına yol açar. Sinirin vestibüler ve işitsel kısımlarının her biri, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı hücre tiplerinden oluşur 1,2. Vestibüler sistemde, iki afferent alt popülasyon, düzenli veya düzensiz aralıklarla kendiliğinden ateşlenir2. Afferent spike zamanlamasının, iyon kanalı bileşimi 3,4'teki altta yatan bir çeşitliliği yansıttığı düşünülmektedir. İşitsel sistemde, spiral ganglion nöronlarının (SGN'ler) iki ana alt popülasyonu vardır; Tip I SGN'ler tek tek iç saç hücrelerine5 temas ederken, Tip II SGN'ler birden fazla dış saç hücresinetemas eder 5. Yarı bozulmamış ve organotipik kültürlerden elde edilen in vitro kayıtlar, Tip I ve Tip II SGN'lerin membran özelliklerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir 6,7.
Bu nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. Bu nedenle, izole vestibüler ve spiral ganglion somata kültürleri, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin bu nöronların tepkisine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için in vitro olarak incelenebilir. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, voltaj kapılı iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonu için uygun olan yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir. Temsili çeşitlilikteki nöron alt tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin yüksek verimli analizine olanak tanır.
Bu makale, sıçanlarda postnatal günde (P)9 ila P20'de vestibüler ganglionun üst kısmından ayrışmış ganglion hücre gövdelerini izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem sunmaktadır. Ganglion hücrelerinin başarılı bir şekilde çıkarılması, ayrıştırılması ve kaplanması için gerekli adımlara ek olarak, bu yöntemlerin spiral gangliona genişletilmesi için öneriler de sunulmaktadır. Bu yöntemler, çeşitli laboratuvarlardan 8,9,10 yayınlarda tasarlananların bir evrimidir. Bu yazıda ayrıca, yama kelepçesi kayıtları için sağlıklı hücrelerin seçilmesine yönelik rehberlik de yer almaktadır.
Son olarak, protokol, delikli yama yapılandırmasını kullanarak yama kelepçesi kaydı prosedürünü ana hatlarıyla belirtir11. Delikli yama konfigürasyonu, daha yaygın yırtılmış yama konfigürasyonundan daha fazla zaman alıcı ve teknik olarak daha zorlayıcı olsa da, uzun ve kararlı kayıt oturumlarına izin veren sitoplazmik ortamı korumak için daha iyidir. Bu kayıt konfigürasyonunun faydaları, yırtılmış yama kayıtlarına göre delikli yamadaki hiperpolarizasyonla aktive edilen katyonik akımların geliştirilmiş stabilitesi ile burada gösterilmektedir.
Bu protokol beş bölüm halinde düzenlenmiştir. Bölüm 1-3, önceden hazırlanabilecek ve depolanabilecek çözümleri ve araçları açıklar. Bölüm 4, vestibüler ve SGN'lerin diseke edilmesi ve kaplanması için adımları açıklar. Bölüm 5, kültürde bir süre sonra nöronlardan kayıt adımlarını açıklar. Bizim elimizde, bölüm 4 ve bölüm 5 art arda 2 günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan kullanımları, Güney Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokoldeki hayvanlar, Charles River Laboratuvarları'ndan elde edilen her iki cinsiyetten P3 ila P25 yaşlı Long Evans sıçanlarıdır, ancak bu yöntemler diğer kemirgen suşlarına da uygulanabilir. Tüm prosedürler sırasında bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmeli, ayrıca çözelti yapılırken sıçramaya karşı koruyucu gözlük takılmalıdır.
1. Hazırlıklar
NOT: Bu bölümde açıklanan çözümler ve araçlar, diseksiyon ve kayıt gününde kullanılmak üzere çok önceden yapılabilir.
- 10 mM HEPES (L-15 çözeltisi) ile desteklenmiş Liebovitz ortamını hazırlayın. Aşağıdaki adımlar, 1 L L-15 çözeltisinin yapılmasını açıklar.
- 990 mL deiyonizeH2Obir behere dökün. 2.386 g (10 mM) HEPES ölçün ve ekleyin. Bir şişe 1 L L-15 çözelti tozu ekleyin.
NOT: Toz haline getirilmiş L-15 daha uzun raf ömrüne sahiptir ve daha az depolama alanı kaplar. Alternatif olarak, L-15 solüsyonu satın alın ve HEPES ile takviye edin. İkinci seçenek, floresan görüntüleme için yararlı olan fenol içermeyen bir çözelti kullanma seçeneğine de sahiptir. - Çözeltiyi bir karıştırma plakasında karıştırın. Bir pH metre kullanarak, 7,34 ile 7,36 arasında bir pH elde etmek için yavaşça 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin.
- Çözelti 1.000 mL'lik bir hacme ulaşana kadar deiyonizeH2Oekleyin. Çözeltiyi 0.22 μm gözenek boyutunda bir membran kullanarak filtreleyin.
NOT: L-15 çözeltisi 4 °C'de yaklaşık 1-2 hafta saklanabilir. Fenol kırmızısı ile yapılmış L-15 kullanılıyorsa, çözelti çok bazikse (pH > 7.4) pembeye veya çok asidikse turuncuya (pH < 7.34) dönecektir.
- 990 mL deiyonizeH2Obir behere dökün. 2.386 g (10 mM) HEPES ölçün ve ekleyin. Bir şişe 1 L L-15 çözelti tozu ekleyin.
- Vestibüler ganglion nöronları (VGN'ler) için kültür ortamını hazırlayın (SGN'ler için modifikasyon ile). 50 mL kültür ortamı yapmak için aşağıdaki adımları izleyin:
- Temiz bir cam behere 47,5 mL GluMAX-I minimum esansiyel besiyeri ekleyin.
- 0.1194 g (10 mM) HEPES ölçün ve ekleyin. Bu ek tampon, inkübatöre taşınmadan önce hücreler çökelirken pH değişikliklerine direnir.
- 2.5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Bu, toplam 50 mL ortam hacminde hacimce %5 FBS yapar. SGN preparatları için 2.5 mL FBS, 0.5 mL N2 ve 1 mL B27 çözeltileri ile ikame edilir.
- Çözeltiyi bir karıştırma plakasında karıştırın. Bir pH metre kullanarak, 7.38 ile 7.4 arasında bir pH elde etmek için yavaşça 1 N NaOH ekleyin.
- 0.5 mL penisilin-streptomisin ekleyin. Çözeltiyi 0.22 μm steril bir filtreden süzün. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
- Kullanmadan en az 30 dakika önce, kültür ortamını havalandırmalı kapaklı bir doku kültürü şişesine aktarın. Kültür ortamı içeren şişeyi 37 °C'de %5CO2 konsantrasyonuna sahip bir inkübatöre yerleştirin.
- Delikli yama iç çözümünü hazırlayın
NOT: Burada, tüm hücre kaydı için 100 mL delikli yama dahili solüsyonu kullanılmıştır (tarif Tablo 1'de özetlenmiştir). Bu çözeltiler önceden hazırlanabilir ve -20 °C'de saklanabilir. Alikotlar, tekrarlanan bir donma ve çözülme döngüsüne girmezlerse -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir.- 6 ay öncesine kadar, aşağıdakilerin stok çözümlerini yapın ve saklayın: 1 M KCl, 0,5 MMg2Cl (heksahidrat) ve 0,5 M CaCl2. Hava geçirmez şişelerde 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
NOT: Hedef konsantrasyona ulaşıldığından emin olmak için stok çözeltilerinin ozmolalitesini (1 M KCl stok çözeltisi için 2.000 mOsm; Mg2Cl ve CaCl2 çözeltileri için 1.500 mOsm) kontrol etmek iyi bir fikirdir. Çözelti bulanıklaşırsa veya çökelti oluşturursa kullanmayın. Bu olası bir duraklama noktası olabilir.
- 6 ay öncesine kadar, aşağıdakilerin stok çözümlerini yapın ve saklayın: 1 M KCl, 0,5 MMg2Cl (heksahidrat) ve 0,5 M CaCl2. Hava geçirmez şişelerde 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
- Dahili çözüm oluşturma gününde, adım 1.3'teki stok çözümlerini kullanarak aşağıdaki adımları izleyin.
- 100 mL mili-Q (MQ)H2O'yuölçün. 100 mL'den 40 mL çekin ve temiz bir behere koyun.
- Kalan 60 mLH2O'yutemiz ve steril 100 mL'lik bir behere ekleyin. 2.5 mL 1 M KCl, 1 mL 0.5 M Mg2Cl-heksahidrat ve 0.02 mL 0.5 MCaCl2 ekleyin.
- Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin. Tamamen eriyene kadar karıştırın. 1.307 gK2S04 ekleyin. K2S04eriyene kadar karıştırın.
- 0.1192 g HEPES tartın (100 mL nihai hacimde hedef 5 mM) ve çözeltiye ekleyin. Eriyene kadar karıştırın.
NOT: Tüm bileşenlerin tamamen çözüldüğünden emin olun, çünkü bazen K2S04'ün çözülmesi zaman alır. - 0.1902 g etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N', N'-tetraasetik asit (EGTA) (100 mL nihai hacimde hedef 5 mM) tartın ve çözeltiye ekleyin. EGTA asidik bir çözelti içinde tamamen çözünmediğinden, kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve pH probunu yerleştirin.
- Karıştırırken, EGTA tamamen eriyene kadar 1 M KOH'yi yavaşça titre edin. Bunun, pH 6 ile 7 arasında olduğunda gerçekleşmesini bekleyin. Son pH 7.35 (toplamda yaklaşık 1.2 ila 1.3 mL KOH) olana kadar yavaşça KOH eklemeye devam edin.
- Çözeltiyi 100 mL'lik son hacme getirmek için MQH2O ekleyin ve karıştırın. Çözeltinin ozmolalitesini (delikli yama çözeltisi için hedef 270 mOsm/kg) bir ozmometre ile kontrol edin.
- Delikli yama iç çözeltisini 0,22 μm steril filtre kullanarak filtreleyin. -20 °C'de 5 mL'lik alikotlarda saklayın. Her yeni kayıt oturumu için yeni bir alikot kullanın.
NOT: Bu olası bir duraklama noktası olabilir.
2. Öğütme pipetlerinin imalatı
NOT: Öğütme pipetleri birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Her kullanımdan önce pipetleri etanol, su ve L-15 solüsyonu ile yıkayın ve her kullanımdan sonra su ve etanol ile temizleyin. Kullanımlar arasında dikkatlice saklayın.
- Hücre ayrışması için öğütme pipetleri hazırlamak için, bir Bunsen brülörünün alevine bir cam Pasteur pipeti tutun. Cam uç erimeye başladığında, camı istediğiniz uç çapına kadar uzatın. Küçük bir kıvrım oluşturmak için pipetin bir ucunu alevden çekin.
- Bükülmüş pipeti mikroskobun yakınına getirin. Bir puanlama karosu kullanarak, camı istenen çapta çizin ve kırın.
- Pipetin ucunu Bunsen brülör alevinin üstünden geçirin. Bu, ucun yakınındaki pürüzlü kenarları hızla parlatacaktır. Ucun alevle kapatılmadığından emin olmak için kontrol edin.
- Farklı boyutlarda dört veya beş pipet hazırlanana kadar işlemi tekrarlayın.
3. Yama pipetlerinin üretilmesi
NOT: Kayıt seansından önce, ancak ganglion diseksiyonu ve kültüründen sonra bir dizi yama pipeti hazırlayın. Kayıt seansı sırasında teker teker yapılan elektrotlar performans açısından optimal olsa da, bunlar bir gece önce toplu olarak yapıldığında makul bir başarı elde edilmiştir. Uçları tozdan korumak için pipetleri kapalı bir cam kapta saklayın.
- Dikey elektrot çektirmesi ve 1,5 mm dış çap/1,17 mm iç çap filamentli borosilikat cam pipetler kullanın. Camın her zaman toz ve parmak izlerinden uzak tutulduğundan emin olun.
- Üreticinin yama pipetleri için önerdiği şekilde iki adımlı bir program kullanarak 8-10 kayıt pipetini çekin.
- Her kayıt pipet ucunu bir microforge ile inceleyin ve ısıyla parlatın; Isıyla parlatma, daha iyi sızdırmazlık sağlar. Hedef pipet direnci 4 ile 8 MΩ arasındadır.
- Parlatılmış pipetleri kapalı bir kapta saklayın. Bu, deneyde bir duraklama noktası olarak değerlendirilebilir.
NOT: Hedef direnç aralığına ulaşmak için pipet çapını optimize etmek, 3.2 ve 3.3 adımlarında biraz deneme yanılma gerektirir. Çoğu ticari yama kelepçesi sistemi, banyo solüsyonundaki elektrot direncini ölçmek için yerleşik bir membran testi özelliğine sahiptir. Direnç, uygulanan 5 mV adım uyaranına yanıt olarak kararlı durum çıkış akımının bir oranı olarak hesaplanır. Adım 3.1'deki çekme ayarları ve adım 3.2'deki parlatma, deneme pipetlerinin direnci 4 ila 8 MΩ aralığına düşene kadar önce deneme pipetleri kullanılarak ayarlanmalıdır. - Kayıt gününde, pipet kapasitansını ve kayıt gürültüsünü azaltmak için pipet uçlarını kaplayın. Bunu yapmak için, pipetin şaftına küçük bir parafin film şeridi sarın. Ucuna kadar sarmak gerekli değildir.
NOT: Alternatif bir strateji, pipetin12 şaftına bir silikon elastomeri kaplamak ve ısıtmak için ayarlamaktır.
4. Vestibüler ganglionun çıkarılması ve vestibüler nöronların kaplanması
- Diseksiyon için hazırlık
- % 0.05 kollajenaz ve% 0.25 tripsin içeren bir L-15 çözeltisi enzim karışımı hazırlayın. Örneğin, bir behere 2 mL L-15 çözeltisine 0.001 g kollajenaz ve 0.005 g tripsin ekleyin, küçük bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve tamamen karışana kadar karıştırın. Oda sıcaklığında bir kenara koyun.
- Tezgah üstü ve diğer yüzeylerin kana ve diğer biyolojik materyallere maruz kalmasını en aza indirmek için giyotinin yanına ve altına kağıt havlu koyarak ticari olarak elde edilmiş bir giyotin hazırlayın.
- Büyük paslanmaz çelik makas, büyük forseps ve büyük yaylı makas yerleştirin. Kafa temizliği için elinizin altında %70 etanol içeren büyük bir sprey şişesi bulundurun.
- 100 mL'lik bir kabı L-15 çözeltisi ile doldurun ve buzun üzerine koyun. L-15 çözeltisini oksijenlendirin.
- Yaylı makası, cerrahi makası, forseps, neşter ve transfer pipetini yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
- 60 mm'lik bir Petri kabı (brüt diseksiyon için) ve iki adet 35 mm'lik Petri kabı (ganglionların temizlenmesi/ince diseksiyonu için) hazırlayın. 0,22 μm filtre ucuna sahip 30 mL'lik bir şırınga kullanarak 60 mm'lik kabı oksijenli L-15 çözeltisiyle doldurun.
- Ötenazi, kafa temizleme ve hemiseksiyon
- İntraperitoneal olarak uygulamak için uygun ölümcül artı seyreltme dozajını hesaplamak için yavruları tartın (10 g'da ~ 0.01 mL).
- Derin bir anestezi düzlemine ulaşıldığında, ayak parmağı sıkışmasına yanıt eksikliği ile değerlendirildiği gibi, giyotin kullanarak dekapitasyon yapın.
- Kafayı% 70 etanol ile iyice durulayın ve ardından L-15 çözeltisi ile iyice durulayın.
- Cildi kafatasından tamamen çıkarın. Omuriliğin beyne giriş noktasından başlayarak ve ilki kafatasının üstünden, ikincisi çenenin altından olmak üzere iki kesim yaparak büyük yaylı makas kullanarak kafayı ikiye bölün. Cerrahi makas kullanarak kafayı ikiye bölmeyi bitirin.
- Başın her iki yarısını da beyin tarafı aşağı bakacak şekilde L-15 solüsyonu ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Şu anda kesilmeyen taze dokuyu buz üzerine yerleştirin.
- Superior vestibüler ganglionun çıkarılması
- Kapalı cerrahi makas kullanarak beyni çıkarın. Beyni kafatasından tamamen ayırmak için kraniyal siniri kesin ve çıkarın.
NOT: Bu noktada, otik kapsül (8 numara şeklinde) başın arkasında görünmelidir. - Forseps kullanarak ve başın arkasından başlayarak, şeffaf membranöz materyali çekin.
- Cerrahi makas kullanarak kafatasının üst kısmını kesin. Diseksiyon alanını ve otik kapsülü daha temiz ve daha kolay erişilebilir hale getirmek için başın ve boynun arkasındaki fazla dokuyu çıkarın.
NOT: İşlem boyunca fazla dokuyu atarak yemeği çok bulanık hale getirmekten kaçının. - Dokuyu taze L-15 çözeltisi ile ikinci bir Petri kabına aktarın. Otik kapsülü ve işitsel, superior vestibüler ve inferior vestibüler sinirleri bulun. İşitme sinirini kesin ve küçük yaylı makas kullanarak üst ve alt gangliyonları ayırın.
NOT: Vestibüler sinirin somataları hem inferior (daha ince) hem de superior (daha kalın) gangliyonlarda bulunmasına rağmen, superior gangliondan çıkarılan hücreler daha iyi sağkalıma sahiptir. - Bir neşter kullanarak, sinirin kemikli kapsüle daldığı kemikli bölgeyi zayıflatmak için kemikli sırtı nazikçe tıraş edin. Ganglionun tüm şişmiş kısmını açığa çıkaran ince forseps ile kalıntıları dikkatlice çıkarın.
- Gangliyonu utriküle doğru dalan periferik sinir dalından kesmek ve ayırmak için ince yaylı makası kullanın.
- Ganglionik dokuya çok yakın sıkışmamaya dikkat ederek ince forseps kullanarak üst ganglionu çıkarın. Taze L-15 çözeltisi ile 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
- Devam etmeden önce, enzim çözeltisini önceden ısıtın: enzim karışımını 35 mm'lik bir Petri kabına dökün ve 10-15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
- Gangliyonu ince forseps ve küçük yaylı makas kullanarak kemiği (beyaz ve kristalize görünen), fazla dokuyu, sinir liflerini ve diğer gereksiz yapıları çıkararak temizleyin. Herhangi bir ganglionik dokunun çıkarılmasını en aza indirmeye özen gösterin.
- Kapalı cerrahi makas kullanarak beyni çıkarın. Beyni kafatasından tamamen ayırmak için kraniyal siniri kesin ve çıkarın.
- Doku ayrışması ve kaplama
- Temizlenmiş gangliyonları önceden ısıtılmış enzim çözeltisine aktarın ve 10 ila 40 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Enzim tedavisi, doku parçalanmaya başladığında tamamlanır, ancak tek parça halinde kalır. Dokunun enzimlerle aşırı muamele edilmesi, gangliyonların tritürasyondan önce tamamen çözünmesine neden olacaktır.
NOT: Dokunun enzimatik işleme tabi tutulduğu süre, hayvanın yaşına bağlıdır. Örneğin, P9 sıçanlarından gangliyonlar 25 dakika boyunca enzim ile tedavi edilir ve P15 sıçanlarından gangliyonlar 35 dakika boyunca enzim ile tedavi edilir. - Gangliyonları taze L-15 çözeltisi ile 35 mm'lik Petri kabına aktarın ve 2-3 dakika inkübe edin.
- Gangliyonları, filtrelenmiş kültür ortamı ile doldurulmuş başka bir 35 mm Petri kabına aktarın.
- 200 μL'lik bir mikropipet kullanarak, kaplanmış cam tabanlı bir tabağa ~150 μL'lik bir damla filtrelenmiş kültür ortamı pipetleyin. Çok fazla çözelti eklemeyin, çünkü cam lamel üzerinde kalan bir çözelti kabarcığı oluşturmak için yüzey gerilimini korumak önemlidir.
- İstenilen sayıda gangliyon (bir ila dört) lamel üzerine aktarın.
- Dokunun cam pipetin kenarlarına yapışmasını önlemek için öğütme pipetini orta ile durulamak için kültür kabından az miktarda kültür ortamı çekin. Ganglionlar yeterince ayrışana kadar dokuyu pipetten nazikçe ve tekrar tekrar geçirerek eziyet edin.
NOT: Tek hücreli süspansiyonları denemek için dokuyu aşırı çalıştırmayın veya hücrelerin aşırı pozitif basınç kullanarak tabağın dibine çarpmasına izin vermeyin. Ayrıca, hücre sağkalımını azaltacağından hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Nazik öğütme, başarılı hücre sağkalımını sağlamanın anahtarıdır. - Hücreleri 5 dakika dinlendirin. Hücrelerin lamel üzerine yerleşip yerleşmediğini görmek için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
- Bir kültür kabını 12-24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin. Yine, çözelti kabarcığını sağlam tuttuğunuzdan emin olun.
NOT: 24 saatten daha uzun süre kültür yaparken, kültür ortamını günlük olarak yenileyin. Bu olası bir duraklama noktası olabilir.
- Temizlenmiş gangliyonları önceden ısıtılmış enzim çözeltisine aktarın ve 10 ila 40 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Enzim tedavisi, doku parçalanmaya başladığında tamamlanır, ancak tek parça halinde kalır. Dokunun enzimlerle aşırı muamele edilmesi, gangliyonların tritürasyondan önce tamamen çözünmesine neden olacaktır.
- Kaplama SGN'leri
- Başı ikiye bölmek için vestibüler ganglion talimatlarının 4.2.1 ila 4.2.5 adımlarını izleyin.
- Otik kapsülü (8 numara şeklinde) bulun ve künt forseps kullanarak kenarlarından yontarak kafatasından çıkarın.
- L-15 çözümünü değiştirin. Otik kapsülün spiral kısmı, Corti organı ile kokleayı barındırır. Koklear dönüşün üzerindeki kemiği, kemiğin eğrisine paralel ince forseps ile alttaki dokuya zarar vermeden yontun.
- Koklear dönüşlerin tam kapsamını ortaya çıkarmak için yeterli kemik çıkarıldıktan sonra, kokleanın tabanındaki modiolusu (SGN'lerin merkezi aksonlarını içeren kalın, beyaz, lifli doku) kesmek için küçük yaylı makas kullanın ve onu otik kapsülün geri kalanından kurtarın.
- Stria'yı tabanda ince forseps ile sıkıştırarak stria vaskularis'i çıkarın. Corti organından arındırmak için spiralin etrafında ve tepeye kadar gevşeyin.
- Corti'nin organını düz duracak şekilde küçük yaylı makas kullanarak iki veya üç tur halinde kesin.
- Modiolus'u her turda küçük yaylı makasla kesin.
- SGN lif yollarının saç hücrelerine doğru çıkıntı yaptığı kenardan keserek spiral gangliyonu çıkarın.
- Kemiği (yapıda beyaz ve kristalize görünen), modiolusu (beyaz ve lifli görünen) ve diğer gereksiz yapıları çıkararak ince forseps kullanarak gangliyonu temizleyin. Herhangi bir ganglionik dokunun çıkarılmasını en aza indirmeye özen gösterin.
- Bölüm 4.4'te vestibüler ganglion için kullanılan spiral ganglionu enzimatik olarak tedavi etmek için kullanılan prosedürün aynısını izleyin. Enzimatik süreler, vestibüler gangliondan daha uzun olan spiral ganglionda tipik olarak daha kısadır. Vestibüler ganglion ile karşılaştırıldığında spiral ganglion için daha küçük çaplı öğütme pipetleri kullanın.
- Spiral ganglionu, kültür ortamı tarifinde belirtilen N2 ve B27 ile desteklenmiş kültür ortamında tritüre edin.
- Ayrışmış gangliyonları içeren kültür kabını 12-24 saat boyunca 37 °C,% 5CO2 inkübatöre yerleştirin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
5. Kayıt
NOT: Bu prosedürde, izole gangliondan yama klemp kayıtları tipik olarak kaplamadan 12-24 saat sonra gerçekleştirilir. Diğer laboratuvarlar, kültür10'da çok daha uzun süreler geçirdikten sonra nöronlardan elde edilen sonuçları bildirmiştir.
- Kayıt odasını hazırlayın
- Doğrudan kültür kabında yama-kelepçe kayıtlarına izin veren hızlı değişim kayıt odasını (veya eşdeğerini) kullanın. Odayı ters mikroskop üzerine kurun.
- Cam tabanlı kültür kaplarını hazneye yerleştirin.
- L-15 çözeltisini bir perfüzyon tüpü sisteminden kayıt odasına besleyin. Odadaki perfüzyon giriş ve çıkışını dakikada 0.5-1 mL oranında stabilize edin.
- Elektrotları yüklemek için dahili çözeltiyi hazırlayın
- Delikli yama iç çözeltisinin bir kısmını çözün. 2.5 mL çözeltiyi 35 mm'lik bir kültür kabına ayırın. Kültür kabının kapağını değiştirin ve "Tip Dip" olarak etiketleyin. Bu çözeltiyi mümkün olduğunca temiz tutmak çok önemli olduğu için tozsuz bir bölgede bir kenara koyun.
- 1 mg amfoterisin-B tartın ve 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. Tüm amfoterisin-B çözeltiye girene kadar çözeltiyi vorteksleyin ve döndürün. Çözülmüş delikli yama iç çözeltisinin kalan 2 mL'sine 10 μL DMSO / amfoterisin-B çözeltisi ekleyin. DMSO / amfoterisin-B'nin iç çözeltiye homojen bir şekilde karıştığından emin olmak için çözeltiyi bir pipetle iki veya üç kez çekin ve boşaltın. Çözelti hafif sarımsı bir renk tonuna sahip olacaktır.
- Amfoterisin-B delikli yama iç çözeltisini 3 mL'lik bir şırıngaya çekin. Şırıngaya 34 G'lik bir uç ekleyin. Şırıngayı alüminyum folyoya sarın ve şırıngayı buz üzerinde tutun.
NOT: Amfoterisin-B'nin hücre zarını delmedeki etkinliğini sağlamak için bu çözelti her 2 saatte bir yeniden yapılmalıdır. Amfoterisin-B ışığa duyarlıdır ve alüminyum folyo veya diğer yöntemler kullanılarak ışıktan korunmalıdır.
- Yama kelepçesi kayıtları
- 10x veya 20x objektif kullanarak nöronları görselleştirin. Hücrenin etrafındaki sınırları ve gölgeleri görmek için aydınlatmayı ayarlayın ve optikleri optimize edin.
- İzole nöronların kalitesini kontrol edin. Sadece çok güçlü kontrastlı olmayan ve sadece küçük, dağınık kraterlere sahip pürüzsüz ve düz yüzeylere sahip nöronları deneyin. Ayrıca, nöron çiftlerinden, enkazla çevrili nöronlardan veya diğer hücrelerden kaçındığınızdan emin olun.
- 100x büyütme altında, yama yapmak için bir nöron veya nöron alanı belirleyin ve bunları görüş alanının ortasına hizalayın.
- Pipetin ucunu, bir kültür kabına yerleştirilmiş temiz solüsyona (~20 s) batırarak amfoterisin içermeyen temiz bir solüsyonla doldurun. Kılcal hareket, uca az miktarda çözelti çekecektir.
NOT: Bu adımı, ucun Tip Dip solüsyonunu ne kadar iyi tuttuğunu belirlemeye izin veren bir stereo diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin. Çözelti ~ 10-20 s boyunca tutmazsa, elektrotun şekli ideal değildir. Bu durumda, daha uzun bir uç üretmek için elektrot çekme programını yeniden yapılandırın. - Ardından, pipetin arkasını amfoterisin içeren dahili çözelti ile doldurun. Pipet içindeki filament, uçtaki temiz çözeltiyi karşılamak için çözeltiyi aşağı çekecektir. Filamentin çözeltiyi düzgün bir şekilde aşağı çekmesine izin verin ve amfoterisini uca çok hızlı zorlayacağından kabarcıklara dokunmaya çalışmayın.
- Elektrotun en arkasında olabilecek çözeltiyi çıkarmak için bir şırınga kullanın.
NOT: Bu noktadan karaya kadar hızlı çalışmak ve istenilen hücre üzerinde yüksek dirençli bir conta oluşturmak çok önemlidir. - Pipeti pipet tutucusuna yerleştirin. Pipetin kaymasını önlemek için pipetin tutucuya tam oturduğunu kontrol edin. Pipet sabit değilse, sapmayı en aza indirmek ve güçlü emiş sağlamak için pipet tutucunun önündeki ve arkasındaki sızdırmazlık O-halkalarını değiştirin. Pipeti yeni doldurulmuş bir pipetle değiştirin.
- Pipeti kayıt odasının banyosuna indirin.
- Pipet ucunu görüş alanının ortasına yerleştirin. Ucun hava kabarcıkları veya diğer kalıntılar içermediğinden emin olun.
- Pipet direncini izlemek için membran testinde bir voltaj adımı (5 mV) uygulayın. Hücre üzerinde bir conta oluşturma sürecinin tamamı boyunca giriş direncini izlemeye devam edin.
- pClamp'in membran test modunda pipet akımı sıfırı gösterecek şekilde pipet ofset potansiyelini iptal edin.
- Yama kelepçesindeki hızlı kapasitans dengeleme işlevini kullanarak pipet kapasitansını düzeltin amp amplifier (Multiclamp Commander yumuşak panelindeki Cp hızlı aramaları).
- Pipeti hücreye doğru hareket ettirin.
- Pipet nörona yeterince yaklaştığında, daha yüksek büyütme hedefine geçin ve görüntüyü bir kamera aracılığıyla bir monitöre gönderin (40x objektif, toplam 400x büyütme kullanın). Pipeti ayarlayın ve nöronu yeniden ortalayın.
- Kayıt elektrodunu somaya yaklaştırın. Monitörde nöronun merkezini bulun ve kayıt elektrodunu nöronun üzerine yerleştirin.
- Nörona yukarıdan yaklaşın, böylece elektrot küresel hücrenin ortasına inecektir. Pipet ofsetini, sistemdeki sabit DC potansiyellerini sıfırlayacak şekilde ayarlayın.
- Pipeti membrana yakın bir yere yerleştirin. Hücrenin ortasına sıkıca inin.
NOT: İniş sırasında, nöronun yüzeyinde küçük bir çukurlaşma ve giriş direncinin iki katına/üç katına çıkması meydana gelecektir. - Bir şırınga veya ağız pipeti kullanarak negatif basınç (emme) uygulayın. -60 mV'luk tutma potansiyelini açın. Conta direnci, bir giga-ohm'u geçene kadar artmalıdır.
NOT: Bir elektrotun doldurulması ile bir hücreye inmesi arasındaki süreyi azaltmak için hızlı çalışın. Adım 5.3.5'te delikli yama iç çözeltisine eklenen amfoterisinin elektrot ucuna ulaşması için sınırlı bir süre vardır. Uç amfoterisin ile kontamine olduğunda, yüksek dirençli contalar oluşturmak zordur ve direnç genellikle ~ 200 megaohm'a kadar plato yapar. - Bir giga-ohm conta oluştuğunda, negatif basıncı serbest bırakın. Conta oluşur oluşmaz, membran test modunda pipet kapasitans geçişlerinin genliğini mümkün olduğunca azaltmak için hızlı kapasitans kompanzasyonu uygulayın.
- Amfoterisin çalışmaya başladığında, giriş direncinin yavaşça azaldığını ve amfoterisin membrana girerken 5 mV voltaj adımına yanıt olarak akan akımın kademeli olarak arttığını izleyin. Kademeli stabilizasyon yerine seri dirençte ani bir azalma, kendiliğinden yırtılmanın meydana geldiğini düşündürür.
- Amplifikatörün kapasitif geçici sıfırlama işlevini kullanarak tüm hücre kapasitansını ve seri direnci tahmin edin. Deneyin başında ve sırasında seri direnci belgeleyin ve düzenli olarak izleyin.
NOT: Elektrotun boyutuna ve pipete ne kadar temiz çözelti çekildiğine bağlı olarak seri direncin stabilize olması 5-20 dakika arasında sürebilir. Voltaj-kelepçe ve akım-kelepçe modları, seri direnç 30 megaohm'un altına sabitlendiğinde kullanılabilir. Kayıt sırasında nöronların şişmesi veya küçülmesi bazen gözlenir, ancak nadiren çözeltilerin ozmolaritesi ve pH'ı doğru ayarlandığında gözlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voltaj adımları ailelerini uygulayarak voltaj-kelepçe protokollerini çalıştırmak, çeşitli farklı akım ailelerinin voltaja bağlı aktivasyonunu ortaya çıkarır. Bir VGN'den uyarılan ve yayınlanmış kayıtlardan13 uyarlanan tüm hücre akımlarının temsili örnekleri Şekil 1A,B'de gösterilmektedir. Depolarize edici voltajların uygulanması (Şekil 1B), çok hızlı bir şekilde etkinleşen ve etkisiz hale gelen bir içe doğru akımı (konvansiyonel olarak negatif) etkinleştirir (Şekil 1A). Bu, sodyum kanallarının(14,15) voltaj kapılı özellikleri için basmakalıptır ve esas olarak aksiyon potansiyellerinin16,17 yukarı vuruşunu sağlar. Depolarizasyon ayrıca, bir aksiyon potansiyelinin aşağı inmesini sağlayan uzun süreli ve nispeten yavaş aktive olan bir dış akımı da aktive eder. Farmakoloji, bu akımların büyük ölçüde VGN'lerdeki çeşitli potasyum kanalları tarafından taşındığını ortayakoymuştur 3,18,19,20,21.
Derin, uzun süreli hiperpolarize voltajlar, hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) kanallar22 tarafından taşınan yavaş aktive olan içe doğru akımı uyandırır (Şekil 1C). Bu akımların aktivasyonu, Şekil 1D'de gösterilen kuyruk akımı protokolü kullanılarak incelenebilir. Burada, akımın aktivasyon yüzdesi, kuyruk adımı (Itail) sırasında akan akımın koşullandırma voltajının bir fonksiyonu olarak çizilmesiyle incelenir. Akım-voltaj aktivasyon eğrisi sigmoidal bir şekle sahiptir (Şekil 1E). Bu kanal, döngüsel AMP (cAMP) gibi çözünür ikinci haberciler tarafından kapılı olmasına rağmen, delikli yama konfigürasyonu kullanılarak ölçülen aktivasyon eğrileri uzun bir kayıt boyunca stabildir. Buna karşılık, kanalın boyutu ve voltaj aktivasyon aralığı, yırtılmış yama konfigürasyonunda kayıt yapıldığında (muhtemelen sitozolik bileşenlerin yıkanması nedeniyle) değiştirilir.
Nöronal çeşitlilik, akımlar farklı VGN'lere ve SGN'lere enjekte edildiğinde ortaya çıkan ateşleme paternleri aralığı ile gösterilmektedir (Şekil 2; sırasıyla üst ve alt). Bazı nöronlar yalnızca mevcut enjeksiyonun başlangıcında ateşlenirken, diğerleri birden çok kez ateşlenir. Bu heterojenlik, hem VGN'lerde hem de SGN'lerde altta yatan sodyum ve potasyum kanallarının bileşimindeki temel bir çeşitliliği yansıtır 23,24,25.
Şekil 1: Çeşitli iyonik akım gruplarını ölçmek için voltaj-kelepçe protokollerine örnekler. (A,B) Bir voltaj adımları ailesi (B) tarafından indüklenen örnek tüm hücre akımları (A). Net içe doğru sodyum akımları (negatif akımlar) burada geçici aktivasyonları ve inaktivasyonları (etiketli ok, Na+) ile tanımlanır. Net dış akımlar (ok, K+, uzun süreli pozitif akımlar olarak etiketlenir) büyük ölçüde potasyum iyonları tarafından taşınır ve sodyum akımlarından çok daha yavaş aktivasyon ve inaktivasyon kinetiğine sahiptir. (C,D) HCN akımları, uzun süreli hiperpolarize voltaj ailesi tarafından aktive edilir. (E,F) Kayıt sırasında farklı zaman noktalarında delikli yamada iyon kanalı karakterizasyonunun kararlılığı. HCN akımlarının voltaja bağlı aktivasyon eğrileri, delikli yama konfigürasyonunda ölçüldü I. Yırtılmış yama konfigürasyonu (F) sırasında HCN akımlarının aktivasyon eğrileri. C-F görüntüleri13'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akımların enjekte edilen adımlarıyla çeşitli ateşleme modelleri uyandırılır. (A) Beş vestibüler ganglion somatasında ateşleme paternleri. (B) Beş SGN'de ateşleme paternleri. (C) Karşılık gelen akım adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemler, izole nöronlardan alınan kayıtlara özgüdür; Önceki çalışmalar, yarı bozulmamış bir preparatta akson terminallerinden alınan kayıtlara odaklanmıştır. Mevcut terminal kayıt teknikleriyle karşılaştırıldığında, izole kayıtlar üstün boşluk kelepçesi ve izo-potansiyel davranışı sunar. Ek olarak, bu protokol daha geniş bir nöron örneğine erişim sağlar, çünkü vestibüler epitelin yarı bozulmamış kayıtlarında yalnızca kaliks taşıyan alt popülasyonlara erişilebilir. Son olarak, izole kayıtlar, yırtılmış yama kayıtlarında hücre içi solüsyon ile sitozol arasındaki diyaliz tarafından sıklıkla kesintiye uğrayan hücre içi ortamın bozulmasını önleyen delikli yama tekniğinin kullanılmasına izin verir.
Başarılı kayıtlar öncelikle izole edilmiş ve kültürlü somataların kalitesine dayanır. Hücre sağkalımında kritik bir adım, izole nöronları üretmek için tritürasyon sırasında gereken kuvvettir. Nazik bir el, hücrenin hayatta kalması için hayati önem taşır. Öğütme pipetleri, nöronların tabağın dibine zorla atılmasını önlemek için L-15 çözeltisinin kabarcığına yerleştirilmelidir. Hücre sağkalımı sorunları ortaya çıkarsa, hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek veya ayrışmış hücrelerin lamel üzerine yerleşmesini önleyen çözelti kabarcığını kırmak için ekstra özen gösterilmelidir. Ayrıca, araştırmacıların, ganglionun pipetten geçerken hafif direnç göstereceği bir çapa sahip olanı seçme esnekliğine sahip olmaları için çeşitli boyutlarda ısıyla parlatılmış öğütme pipetlerine sahip olmak da en iyisidir. Pipetlerin ısıyla parlatılması, ganglionun camın pürüzlü kenarlarından geçirilmesinden kaynaklanan hasarı azaltır. Pürüzlü bir kenar bırakmak, başlangıçta ganglionların parçalanmasında daha etkili görünebilir, ancak bu yaklaşım somataya zarar verir ve kültürdeki dönemden sonra sağkalımı azaltır. Son bir tavsiye, başarılı bir öğütme pipetini kıskançlıkla korumaktır.
Hücre sağkalımı için kritik olan bir diğer faktör, sindirim enzimleri ile tedavi süresidir. Enzim zamanını belirlerken, araştırmacıların dokunun iyi bir şekilde parçalanmasını sağlamak için zamanı dikkatlice ayarlamaları gerekir, ancak hücre sağkalımını etkileyecek kadar değil. Enzimle tedavi edilen hücrelerden toplanan veriler, bu yaklaşıma dayanmayan diğer yöntemlerle tutarlı göründüğü için, enzimatik tedavinin hücre sağkalımı ve iyon kanalı özellikleri üzerindeki etkisinin minimum olduğunu bulduk19,26. Enzimatik işlem, öğütmek için gereken kuvveti en aza indirse de, enzimatik sindirimin (özellikle tek başına tripsin veya papain bazlı) iyon kanallarına zarar verdiği bilinmektedir27. Bu nedenle, hayvanın yaşına bağlı olarak enzim zamanlaması için bazı yönergeler önersek de, sonuçlara göre zamanı ayarlamaya hazırlıklı olmak en iyisidir. Son olarak, eziyet için 'az çoktur' yaklaşımını teşvik ediyoruz. Bu, tek hücreli bir süspansiyon oluşturma dürtüsüne direnmek ve birkaç büyük doku parçası kalsa bile, üç veya dört geçişten sonra öğütülmeyi durdurmak anlamına gelir.
Kültürlemenin bir avantajı, somatik hücre zarını temizliyor gibi görünmesi ve miyelin oluşturan glial hücrelerin dökülmesini teşvik etmesidir, bu da nöronlardan daha başarılı yama kenetlenmesine izin verir. Bu nedenle, izole edilmiş ve kültürlenmiş ganglion preparatı, yama klemp kayıtlarının doğum sonrası 1. haftadan sonra uzatılması için özellikle yararlıdır, bundan sonra hücre gövdeleri aşamalı olarak miyelin ile kaplanır ve yama kelepçe elektrodunu engeller. Doğum sonrası 2. haftanın ötesinde izole edilmiş ve kısa süreli kültürlenmiş (<24 saat) VGN'lerden alınan yama-klemp kayıtlarında gözlenen iyon kanalı aktivitesi, immünohistokimya ve vestibüler epiteldeki kaliks terminallerinden direkt kayıtlar ile görülen iyon kanalı ekspresyonundaki bölgesel ve matorasyonel değişikliklerle tutarlıdır28,29. Bununla birlikte, nörotrofik faktörler ve antibiyotikler tarafından desteklenen uzun süreli kültürün 30,31,32,33,34 iyon kanallarını da etkileyebileceği unutulmamalıdır. Bu tekniklerin herhangi bir uygulaması, bu faktörlerin nöronların ve iyon kanallarının altında yatan biyofizik üzerindeki etkisini dikkatlice değerlendirmelidir 30,31,32,33,34.
Genel olarak, izole edilmiş ve kültürlenmiş somatalardan alınan yama-kelepçe kayıtları, iç kulak nöronlarının iyon kanalı özelliklerindeki çeşitliliği incelemek için uygundur. Delikli yama konfigürasyonunun uzun vadeli stabilitesi, aktivasyon özellikleri sitozolik ikinci haberciler yoluyla modülasyona tabi olan HCN gibi iyon kanallarını incelemek için özellikle uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Dr. Jing Bing Xue ve Ruth Anne Eatock'a bu yöntemlere erken katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NIDCD R03 DC012652 ve NIH NIDCD DC012653S tarafından desteklenmiştir ve R01 RK'ya ve T32'ye DC009975 DB, NN ve KR'ye DC0155512.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
